Name: ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: חקור אינטראקציות בין תאי שוואן לאסטרוציטים במבחנה לחקר שיקום פציעות חוט השדרה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח הגירה ושילוב תאים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות משופרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות פיליפה וורן על עזרתה האדיבה.

1. גבול Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה יסוד: שקופיות לשכת הם מצופים Poly-D-ליזין שקופיות הזכוכית לילה ועקר מוכנים לפני תחילת הניסוי. בינוני מוכן באמצעות מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין-Fungizon (כוחות הביטחון הפלסטינים). גם בקבוק של תמיסת סידן / מגנזיום הנקס מלח חינם מאוזנת (HBSS) מוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי שוואן עכברוש תאים בתרבית בבקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. תרבות ראשיים astrocyte עכברוש הוא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. טריפסין הוא inactived ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinized בתאי שוואן ואת האסטרוציטים מועברים בנפרד 15 מ"ל צינורות בז ו centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאי שוואן ואת האסטרוציטים הם מחדש מושעה בצפיפות של 2 x 10 6 (ראה סעיף תוצאות נציג עבור וריאציות צפיפות התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 50 μL ההשעיה תא שוואן ממוקם בקצה אחד של PDL בארות שקופיות מצופה קאמרית. רצועת זכוכית שימש למרוח את הירידה לכיוון המרכז של החדר כדי ליצור קצה ישר. (בעזרת חותך זכוכית, coverslips זכוכית מלבני נחתכים longitudinally כך שהוא יתאים לרוחב החדר שקופיות המשמש מבחני גבול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה השנייה של μL 50 ההשעיה astrocyte הוצב בקצה השני של הבאר אותו מרוח לכיוון המרכז כדי ליצור קצה ישר במקביל למרוח את הירידה הראשון עם פער 0.2mm קטן ביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר שקופיות המכיל את טיפות ממוקמות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, תרבויות נשטפו עם DMEM להסיר שאינם מחוברים פסולת הסלולר בינוני טרי המכיל DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים הוסיף. הערה: DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים ניתן להוסיף forskolin (2μM) ותמצית יותרת המוח שור (BPE) (10μg / mL) לעורר התפשטות שוואן התא. BPE תספק גורמי גדילה הדרושים כדי לאפשר התרבות לטווח ארוך שוואן תאים forskolin מעלה את רמות מחזורית monophosphate אדנוזין בתוך התאים שוואן לגרום התפשטות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית במשך כ 8-10 ימים 37 ° C, 7% CO 2 באינקובטור. בינוני דורש להיות שונה כל 3 ימים. בשתי חזיתות התא יהיה בסופו של דבר להגיע לזה גבול חד יהוו בין שני סוגי התאים. בשלב זה הניסויים ניתן לבצע ניתוח הגורמים המעורבים ביצירת גבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות ניתן לתקן באמצעות פורמלדהיד 4% ותאי שוואן ניתן immunostained עם נוגדן אנטי P75 ו האסטרוציטים עם אנטי GFAP הנוגדנים לזהות את התאים בתרבית משותפת. P75 נוגדן מזהה זיקה נמוכה NGF הקולטן בתאי שוואן אשר האסטרוציטים העדר. Anti-GFAP נוגדן מזהה חלבון גליה firbrillary חומצי אשר localizes אל הציטופלסמה astrocyte. (ראה איור 1A עבור הגבול נציג) </li></ol> 2. הגירה Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 צלחות היטב (15mm בארות) הם PDL מצופה לילה ומוכן ליצירת monolayers astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות astrocyte ראשונית היא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. טריפסין הוא מובטל ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים לבין תא centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות. (ראה תרשים 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסטרוציטים הם מחדש מושעה ב 1x10 5 תאים / מ"ל. 1 מ"ל של פתרון זה מתווסף מצופה כל PDL היטב 4 צלחות היטב. האסטרוציטים הם מתורבת של 24-48 שעות עד monolayer הוא ומחוברות לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך הגירה תא שוואן על monolayers astrocyte, במקביל ליצירת monolayers astrocyte, מעגלי PDL מצופה זכוכית coverslips ממוקמות בתוך שפופרת 50 מ"ל ומחץ בעזרת פיפטה פלסטיק ליצירת שברים קטנים של זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי זכוכית מועברים לתוך באר בצלחת 6 צלחת היטב באמצעות מלקחיים מתאים שברים בגודל נבחרים והושמו בארות אחרות. 5 שברי זכוכית ממוקמים היטב כל 6 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי שוואן תאים בתרבית בקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. Trypsinized בתאי שוואן מועברים נפרד צינור 15 מ"ל בז ו centrifuged ב G 300 במשך 5 דקות. בתאי שוואן הם מחדש מושעה ב 2x 10 6 תאים / מ"ל% DMEM/10 כוחות הביטחון הפלסטינים FCS / 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 טיפות μL ההשעיה בתאי שוואן נוסף על כל 5 שברי coverslip להציב 6 צלחות התאים היטב מודגרת ב 37 ° C CO, 7% 2 עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, התאים שוואן מחוברים שברי coverslip ו DMEM/10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים (בתוספת 2μM של forskolin 10μg ו / mL של BPE מתווסף גם כל כך שברי מכוסים לחלוטין עם בינוני) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 צלחות היטב המכיל שברי ממוקמות אז עבור 24-48 שעות בחממה עד שברי זכוכית הם con מלאשוטפת עם תאים שוואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שברי הם ומחוברות עם תאים שוואן, שבר כל הרים בזהירות בעזרת מלקחיים חד טבול HBSS להסיר תאים פנויים, ואז פנים הפוך על מנת monolayer astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוב כל כך מכוסה עם 1 מ"ל של% DMEM/10 FCS / 1% תאים כוחות הביטחון הפלסטינים לבין שוואן מותר להעביר לתקופה 24-48. במהלך תקופה זו ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה ניתן להוסיף על מנת להעריך את השפעתם על מספר ומרחק של הגירה של תאים שוואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הנדידה, שברי הזכוכית קבועים לתחתית גם כל על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות. בעקבות קיבעון, immunostain בתאי שוואן עבור p75 (הכרה נמוכה לקולטן זיקה NGF), לאחר מכן הכתם אותם באמצעות ערכת-ABC strepavidin diaminobenzidine (DAB), כדי לאפשר ויזואליזציה של תאים שוואן תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 3. נציג תוצאות: לאחר 8-10 ימים שוואן-astrocyte שיתוף תרבויות להראות גבול חד בין שני סוגי התאים. גבול זה בולט יותר אם forskolin ו BPE משמש בתרבות כמו התפשטות שוואן תאים מוגברת. אם אין גבול הוא ציין במהלך תקופה של 10 יום, זמן של התרבות ניתן להגדיל עוד יותר את הגבולות עד מבוססים. שינוי היחס בין צפיפות התאים היא דרך חלופית כדי להגביר את היווצרות הגבול. יחס של 3:01 שוואן: צפיפות התאים astrocyte ניתן להשתמש בעת הכנת תרחיפים תא 8,18. בעקבות immunostaining לזהות את התאים שוואן ואת האסטרוציטים, כדי להעריך את תא קו עירוב ניתן להסיק היכן הגבול הוא הקים את מספר התאים שוואן נודדים לשטח astrocyte ניתן לספור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להלן שתי דוגמאות של תמונות גבולות שהושגו, אחד עם הפרדה בנוי היטב בתאי שוואן ואת האסטרוציטים (איור 1A) ואחד שבו התאים לא מופרדים היטב לשטחים שונים בגלל טכניקה גרועה (איור 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> . איור 1 assay גבול: שוואן-astrocyte אינטראקציה. א) ביום 10 שיתוף תרבות assay בנוכחות forskolin ו BPE לעורר התפשטות שוואן תא מדגים גבול חד בין שני סוגי תאים (אדום = P75, ירוק = GFAP). ב) יום 10 שיתוף תרבות assay היכן הגבול לא נוצרו שתי חזיתות תא מעורבת. זה היה בגלל ערבוב של שתי טיפות טיפות תוך שימת תא astrocyte ו שוואן סמוכים זה לזה במהלך תקופת ההכנה של הגבול (אדום = P75, ירוק = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הדימוי נציג monolayer astrocyte ומחוברות מבחני הגירה להעריך את התנועה של סוג תא אחד על פני השטח של סוג תא אחר ולכן להעריך תופעה שונה מזו של היווצרות הגבול. תרגול נחוץ כדי להבטיח היפוך coverslips על monolayers אינה מובילה לנזק שוואן תא מכוסה שברי זכוכית monolayers astrocyte ידי מלקחיים חדה. כדי להעריך את הנדידה של תאים שוואן, המרחק המקסימלי של הגירה ואת מספר התאים נודדים מקצה coverslip ניתן למדוד במיקרוסקופ אור. להלן תמונה של תאים שוואן מוכתם נוגדן P75 באמצעות מכתים DAB על פני השטח של monolayer astrocyte (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור הגירה באמצעות assay assay coverslip הפוכה. א) בתאי שוואן (חום, immunostained עם נוגדן p75) נודדות הרחק בקצה coverslip. החץ מצביע על כיוון של הגירה התא הרחק coverslip.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מבחני שתוארו לעיל שימשו במחקרים שונים הוכחת את התפקיד של גורמים רבים המעורבים היווצרות הגבול בין שוואן, האסטרוציטים ומוגבל הגירה שוואן תאים בסביבה astrocytic. הבנת המנגנונים האירועים הללו הוא חיוני כמו זה יאפשר פיתוח של אסטרטגיות כדי לייעל ולשפר את שילובם של שתלי שוואן תא הבאים השתלת ובכך להקל את היציאה של האקסונים התחדשות מאחורי השתל לרקמת הפונדקאי ומאפשר היווצרות של קשרים עם רקמה המארח.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי (מלבניות)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>שקפי תא (Chamber slides)</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>פלטות 4 בארות, פלטות 6 בארות</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>פלטות 4 בארות, פלטות 6 בארות</td></tr><tr><td>נוגדן p75 של חולדה</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים (מצומדים ל-Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>עיז נגד עכבר 568, עיז נגד ארנב 488</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים ביוטיניליים</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>עיז נגד עכבר</td></tr><tr><td>טבליות DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

בתאי שוואן אחד של תאים נפוץ אסטרטגיות לתקן בעקבות פגיעות בעמוד השדרה. בתאי שוואן מסוגלים לתמוך התחדשות axonal ומצמיח 1,2 על ידי הפרשת גורמי גדילה ומתן לקידום צמיחה מולקולות הדבקה 3 ומולקולות תאי מטריקס 4. בנוסף הם myelinate אקסונים demyelinated באתר של פגיעה 5. זאת בעקבות השתלת תאים שוואן לא להעביר מהאתר של השתל ולא להתערבב עם האסטרוציטים מארח 6,7. התוצאה היא היווצרות של גבול חד בין התאים שוואן ואת האסטרוציטים, יצירת מכשול עבור אקסונים הגוברת מנסה לצאת בחזרה השתל לרקמת מארח proximally ו distally. האסטרוציטים במגע עם תאים שוואן גם לעבור היפרטרופיה-up להסדיר את מולקולות המעכבות 8-13. ב מבחני חוץ גופית שימשו מודל שוואן תאים astrocyte אינטראקציות היה חשוב בהבנת המנגנון שבבסיס ההתנהגות הסלולר. אלה מבחני חוץ גופית כוללים assay הגבול, שם שותף תרבות נעשית באמצעות שני תאים שונים עם כל סוג תא הכובש בשטחים שונים עם פער קטן בלבד בין שני חזיתות התא. כאשר התאים להתחלק להגר, בשתי החזיתות הסלולר להתקרב זה לזה, ולבסוף מתנגשים. זה מאפשר את ההתנהגות של שתי האוכלוסיות הסלולר להיות מנותח בגבול. עוד וריאציה של הטכניקה היא אותו כדי לערבב את שתי האוכלוסיות הסלולר בתרבות לאורך זמן את שני סוגי תאים להפריד עם תאים שוואן בכבדות יחד איים בין האסטרוציטים יחד ליצירת מספר רב של שוואן-astrocyte גבולות. Assay second המשמשים בחקר האינטראקציה של שני סוגי התאים הוא assay הגירה שבו התנועה הסלולר יכול להיות מועבר על פני השטח של סוג תא אחר monolayer 14,15. Assay זה הידוע בכינויו assay coverslip הפוכה. בתאי שוואן הם מתורבתים על שברי זכוכית קטנים הם הפוכים עם הפנים כלפי מטה על פני השטח של monolayers astrocyte והגירה נבחנת מקצה coverslip. מבחני שניהם כבר סייעה בחקר המנגנונים המעורבים למעט הסלולר היווצרות הגבול. חלק זיהו מולקולות באמצעות טכניקות אלה כוללות N-Cadherins 15, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs) 16,17, FGF / הפרין 18, יבצע אפרים את גזר / Ephrins 19. בכוונת מאמר זה לתאר את הגבול ו assay assay הגירה באופן הדרגתי ולברר את הבעיות הטכניות אפשרי שעלול להתרחש.

מאמר זה מתכוון לתאר באופן הדרגתי נפוץ<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני המשמש ללימוד שוואן תאים asrtocyte אינטראקציות.

תאי שוואן (Schwann cells) הם מאחדים הסוגים הנפוצים של תאים המשמשים באסטרטגיות שיקום לאחר פגיעות בחוט השדרה. תאי שוואן מסוגלים לתמוך בצמיחה אקסונלית...

תאי שוואן (Schwan cells) הם תאי גליה של מערכת העצבים ההיקפית ששימשו לשיקום פגיעות בחוט השדרה. הם מספקים גורמי גדילה התומכים ברגנרציה של אקסונים ומספקים מולקולות של מטריקס חוץ-תאי והצמדה המעודדות גדילה. בנוסף, הם מבצעים מיאלינציה של אקסונים באתר הפגיעה.למרבה הצער, תאי swan מושתלים אינם נודדים מאתר ההשתלה ואינם מתערבבים עם האסטרוציטים של המארח. דבר זה מוביל להיווצרות של גבול חד ומונע מאקסונים גדלים להשתלב ברקמת המארח. בסרטון זה, נעשה שימוש בשתי שיטות לבחינת האינטראקציות בין תאי swan לאסטרוציטים in vitro.ראשית, מוצג ניסוי למדידת גבולות, שבו מוקמים ומטפחים על גבי שקופית אזורי טריטוריה של תאי swan ותאי astrocytes. לאחר מכן, מוסיפים לשקופית ריאגנטים שונים וממשיכים בתרבית. השקופיות מצולמות ומנותחות כדי לקבוע את השפעת הריאגנטים על הגירה של תאי swan לתוך הטריטוריה של ה-astrocytes או להיפך.בשלב הבא, מוצג ניסוי נדידה שבו פיסות של זכוכית כיסוי המכוסות בקני תאי שוואן (Schwann cells) מועמדות באופן הפוך על שכבות מונושכבה של אסטרוציטים. שוב, ריאגנטים שונים מתווספים למצע הגידול, ולאחר מכן מבוצע דימוי של התרבית כדי להעריך את היקף ומרחק הנדידה של תאי שוואן על שכבות המונושכבה של האסטרוציטים. בסופו של דבר, סוג זה של ניסוי אמור לסייע בפיתוח אסטרטגיות לאופטימיזציה ולשיפור של השילוב של השתלי תאי שוואן לאחר השתלה.היתרון של בדיקות in vitro אלו על פני שיטות קיימות שבהן נמדדת נדידה על תשתיות טהורות הוא שהן רלוונטיות יותר לבדיקות in vivo שבהן תאים מושתלים באים במגע עם אסטרוציטים. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות in vitro אלו בתחומים אחרים, כגון ביולוגיה של התא, כדי לענות על שאלות מפתח כגון פלישה ונדידה של תאי גידול. לפני תחילת הבדיקה, יש להכין את הפריטים הבאים: שקופיות תא (chamber slides) מצופות poly D lysine, שקופיות זכוכית סטריליות, מצע גידול תאים ובקבוק סידן.התחל את הכנת תמיסת המקור של Hanks balance ללא מגנזיום על ידי עיכול של תאי שוואן ראשוניים במשך שלוש דקות ותאי אסטרוציטים ראשוניים של חולדה במשך חמש דקות באמצעות טריפסין. לאחר שהתאים ניתקו, בטל את פעולת הטריפסין על ידי הוספת מצע גידול תאים. לאחר מכן, העבר את תאי השוואן והאסטרוציטים לנבובות פלקון נפרדות של 15 מיליליטר וסבב אותן בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות.במקביל, בעזרת חותך זכוכית, חתכו כיסויות זכוכית מלבניות לאורכן כך שיתאימו לרוחב של שקופיות תא (chamber slides) המשמשות לבדיקות גבול (boundary assays) ויסייעו במריחה של טיפת תרחף התאים. לאחר השחזור בצנטריפוגה (spin Resus), השעיקו את תאי השוואן (schwan cells) ואת האסטרוציטים בצפיפות של 2*10⁶ תאים למיליליטר. בקצה אחד של שקופית תא מצופה פוליליזין, הניחו טיפה אחת של 50 µL מתרחף תאי השוואן.השתמשו ברצועת זכוכית כדי למרוח את הטיפה לכיוון מרכז התא כדי ליצור קצה ישר. לאחר מכן, הניחו טיפה שנייה של 50 µL של תמיחת אסטרוציטים בקצה הנגדי של אותה באר ומרוחו אותה לכיוון המרכז. כדי ליצור קצה ישר המקביל לראשון, יש להשאיר רווח של 0.2 mm ביניהם.הניחו את שקופית התא הכוללת את הטיפות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעתיים. לאחר שעתיים, שטפו את התרביות ב-DMEM כדי להסיר שאריות תאים שאינן דבוקות.כדי לעודד פרוליפרציה של תאי שוואן, יש להוסיף מדיום לשקופיות התא (chamber slides). מדיום זה מועשר ב-four galin וב-bovine pituitary extract. ה-four galin מעלה את רמות ה-cyclic A MP בתוך תאי השוואן כדי להשרות פרוליפרציה, וה-BPE יספק גורמי גדילה הדרושים לתרבית לטווח ארוך.דגרו את השקופית במשך שמונה עד 10 ימים. שני חזיתות התאים יגיעו בסופו של דבר זו לזו וגבול חד ייווצר בין שני סוגי התאים. בשלב זה ניתן לבצע את הניסויים.לצורך ניתוח הגורמים המעורבים ביצירת הגבול ובחינתו, קבעו את התרבית המשותפת (co-culture) באמצעות 4% formaldehyde. כדי להבדיל בין תאי שוואן (Schwann cells) לתאי כוכב (astrocytes), בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדן anti-P75 ונוגדן anti-GFAP, בהתאמה. נוגדן P75 מזהה את קולטן ה-NGF בעל זיקה נמוכה הנמצא על תאי שוואן, שאינו קיים בתאי כוכב; נוגדן GFAP מזהה את החלבון glial fibrillary acidic protein, הממוקם בתאי כוכב, לצורך ביצוע מבחן נדידה (migration assay).התחל את הזריעה. זרע 10⁵ אסטרוציטים ב-1 מיליליטר מצע גידול בכל באער של פלטת 4 באערים עם באערים בקוטר 15 מילימטר. הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות עד להגעה למצב של התלכדות מלאה (confluence) של השכבה החד-שכבתית.במקביל, כדי להכין תאי swan להערכת נדידה על שכבות מונו-שכבה של אסטרוציטים, הניחו לביות זכוכית עגולות מצופות פוליליזין במבחנה של 50 milliliter והשתמשו בפיפט פלסטיק כדי לרסק אותן, ובכך ליצור רסיסי זכוכית קטנים. העבירו את רסיסי הזכוכית לבאר אחת של פלטת שש בארות באמצעות פינצטה. בחרו רסיסים שקוטרם כ-5 millimeters והעבירו חמישה מהם לכל אחת מהבארים האחרות.גדלו את תאי השוואן (Schwann cells) בעזרת Trypsin במשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו את התאים לפסולת של 15 מיליליטר וסבבו אותם בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות. השעו את תאי השוואן בריכוז של 2 × 10⁶ תאים למיליליטר במצע תרבית.לאחר מכן, הוסף 20 µL מתליה של תאי השוואן מעל כל פרגמנט והדגר ב-37 °C וב-7% CO2 למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הוצא את תאי השוואן מהאינקובטור. הוסף לכל באר כמות מספקת של מצע גידול המועשר ב-2 µM של scale in ו-10 µg/mL של BPE.כך שהפרגמנטים עם התאים ההצמודים מכוסים לחלוטין במדיום; דגרו למשך 24 עד 48 שעות עד שהפרגמנטים הזכוכיתיות מלאים לחלוטין בתאי swan. ברגע שהפרגמנטים מלאים בתאי swan, הוציאו הן את תאי ה-swan והן את האסטרוציטים מהאינקובטור. השתמשו בפינצטה כדי להרים בזהירות כל פרגמנט עם תאי swan הצמודים אליו.טבול את הפרגמנט ב-HBSS כדי להסיר תאים שאינם דבקים, ולאחר מכן הפוך אותו כשהוא פונה כלפי מטה על שכבת המונו-שכבה של האסטרוציטים. לאחר שכל הפרגמנטים הועברו, הוסף מילילטר אחד של מצע גידול תאים לכל באער.במידה ויבחנו את ההשפעות של ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה, יש להוסיפם למצע. החזירו את הפלטה לאינקובטור ואפשרו לתאי השוואן (schwan cells) לנדוד במשך 24 עד 48 שעות לאחר תקופת הנדידה. רסיסי הזכוכית מקובעים לתחתית של כל באר על ידי הוספת 4%para formaldehyde למשך 30 דקות לאחר הקיבוע.בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית של תאי שוואן ל-P 75, ולאחר מכן צבעו אותם באמצעות ערכת ABC Strept ADIN עם תגובת DAB כדי לאפשר ויזואליזציה של תאי השוואן תחת מיקרוסקופ אור לאחר 10 ימים. תרבית משותפת של תאי שוואן ואסטרוציטים מראה גבול חד בין שני סוגי התאים. כאן, תאי שוואן מזוהים על ידי P 75.צביעה של קולטן NGF בעל זיקה נמוכה מוצגת בצבע אדום, ואסטרוציטים מזוהים על ידי צביעת GFAP המוצגת בצבע ירוק. הגבול בין תאים אלו בולט יותר כאשר משתמשים ב-forskolin וב-BPE בתרבית, מכיוון שפרוליפרציה של תאי שוואן מוגברת. לעומת זאת, במערך תרבית משולבת זה של 10 ימים, התאים לא הופרדו היטב לאזורים שונים.הדבר נבע מטכניקה לקויה ומערבוב של שני סוגי התאים. בעוד שבדיקת הגבול (boundary assay) מכינה את הממשק, בדיקות נדידה (migration assays) מעריכות את תנועתם של תאי סוג אחד על פני שטחם של תאים מסוג אחר, ולכן הן מעריכות תופעה השונה מזו של היווצרות גבול. תמונה זו מראה תאי swan נודדים הרחק מקצהה של זכוכית הכיסוי, כאשר החץ מצביע על כיוון נדידת התאים.בעת ביצוע בדיקות in vitro אלו, חשוב לזכור כי השפעת الريאגנטים יכולה להיות על אסטרוציטים או על תאי שוואן (Schwann cells), ולכן נדרשים ניסויים המשכיים כדי להראות בדיוק איזה סוג תא אחראי לנדידה המוגברת או המופחתת שנצפתה. בנוסף, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון אימונוכימיה, ובמיוחד בבדיקת הגבול (boundary assay), כדי להראות אילו מולקולות מופעלות בעוצמה גבוהה (upregulated) או נדחקות (down-regulated) בגבול שבין תאי שוואן לאסטרוציטים.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

חקור אינטראקציות בין תאי שוואן לאסטרוציטים במבחנה לחקר שיקום פציעות חוט השדרה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח הגירה ושילוב תאים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות משופרות.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

גלה סרטונים נוספים