ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

תאי שוואן (Schwann cells) הם תאי גליה של מערכת העצבים ההיקפית ששימשו לשיקום פגיעות בחוט השדרה. ביסודם, הם מפרישים גורמי גדילה התומכים בניוון אקסונלי ומספקים מולקולות של מטריקס חוץ-תאי ואדהזיה המעודדות צמיחה. בנוסף, הם מבצעים מיאליניזציה של אקסונים באתר הפגיעה.

למרבה הצער, תאי swan מושתלים אינם נודדים מאתר ההשתלה ואינם מתערבבים עם האסטרוציטים של המארח. דבר זה מוביל להיווצרות של גבול חד, המונע מאקסונים גדלים להשתלב ברקמת המארח. בסרטון זה, נעשה שימוש בשתי שיטות לבחינת האינטראקציות בין תאי swan לאסטרוציטים in vitro.

ראשית, מוצג ניסוי גבול שבו מוקמים ומגודלים על גבי סלייד אזורים של תאי שוואן ואסטרוציטים. לאחר מכן, מתווספים לסלייד ריאגנטים שונים ומתבצעת גידול נוסף. הסליידים מדויקים ואנואלים כדי לקבוע את השפעת הריאגנטים על נדירת תאי שוואן אל תוך אזור האסטרוציטים או להיפך.

בשלב הבא, מוצג ניסוי נדידה שבו רסיסי לכיסוי (cover slip) המכוסים בקני תאי שוואן (Schwann cells) מועמדים הפוך על שכבות מונולייר של אסטרוציטים. שוב, ריאגנטים שונים מתווספים למצע הגידול, ולאחר מכן מבוצע דימוי של התרבית כדי להעריך את היקף ומרחק הנדידה של תאי שוואן על שכבות המונולייר של האסטרוציטים. בסופו של דבר, סוג זה של ניסוי אמור לסייע בפיתוח אסטרטגיות לאופטימיזציה ולשיפור של השילוב של השתלות תאי שוואן לאחר הטרנספלנטציה.

היתרון של בדיקות in vitro אלו על פני שיטות קיימות שבהן מוערת נדידה על מצעים טהורים הוא שהן רלוונטיות יותר לבדיקות in vivo שבהן תאים מושתלים באים במגע עם אסטרוציטים. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות in vitro אלו בתחומים אחרים, כגון ביולוגיה של התא, כדי לענות על שאלות מפתח כגון פלישה ונדידה של תאי גידול. לפני תחילת הבדיקה, יש להכין את הפריטים הבאים: שקופיות עם תאי גידול מצופים ב-poly D lysine, שקופיות זכוכית סטריליות, מצע גידול תאים ובקבוק סידן.

תמיסת מקור של Hanks balanced salt solution נטולת מגנזיום; התחל בעיבוד תאי שוואן (schwan cells) ראשוניים עם טריפסין למשך שלוש דקות ותאי אסטרוציטים ראשוניים של חולדה למשך חמש דקות. ברגע שהתאים ניתקו, בטל את פעולת הטריפסין על ידי הוספת מצע גידול לתאים. לאחר מכן, העבר את תאי השוואן והאסטרוציטים למבחנות פלקון (falcon tubes) נפרדות של 15 מיליליטר וסבב אותם בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות.

בינתיים, השתמש בחיתוך זכוכית כדי לחתוך לוחות כיסוי מזכוכית בצורה מלבנית לאורכה, כך שיתאימו לרוחב של שקופיות תא (chamber slides) המשמשות לבדיקות גבול (boundary assays) ויאפשרו את מריחת טיפת תרחיף התאים. לאחר ה-spin Resus, השהה את תאי השוואן (schwan cells) והאסטרוציטים בריכוז של 2×10⁶ תאים למילליליטר. בקצה אחד של שקופית תא מצופה פוליליזין, הנח טיפה אחת של 50 µL מתרחיף תאי השוואן.

השתמשו בפס זכוכית כדי למרוח את הטיפה לכיוון מרכז התא כדי ליצור קו ישר. לאחר מכן, הניחו טיפה שנייה של 50 microliter מתליון האסטרוציטים בקצה opposite של אותה באר ומרוחו אותה לכיוון המרכז. כדי ליצור קו ישר המקביל לראשון, יש להשאיר רווח של 0.2 millimeter ביניהם.

הניחו את שקופית התא הכוללת את הטיפות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים, שטפו את התרביות ב-DMEM כדי להסיר שאריות תאיים שאינן דבוקות.

כדי לעבות את התרבויות של תאי שוואן, יש להוסיף מצע למשטחי התאיים (chamber slides). מצע זה מועשר ב-four galin ובמיצוי בלוטת הפיתוئیט של בקר (bovine pituitary extract). ה-four galin מעלה את רמות ה-cyclic A MP בתוך תאי השוואן כדי להשרות התרבות, וה-BPE יספק גורמי גדילה הדרושים לתרבית ארוכת טווח.

דגרו את הפיתיח למשך שמונה עד 10 ימים. שתי חזיתות התאים יגיעו בסופו של דבר זו לזו, וגבול חד ייווצר בין שני סוגי התאים. בשלב זה, ניתן לבצע את הניסויים.

לניתוח הגורמים המעורבים ביצירת הגבול ובחינתו, קבעו את התרבית המשולבת (co-culture) באמצעות 4% formaldehyde. כדי להבדיל בין תאי שוואן (Schwann cells) לתאי אסטרוציטים, בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדן anti-P75 ונוגדן anti-GFAP, בהתאמה. נוגדן P75 מזהה את רצפטור NGF בעל האפיניות הנמוכה בתאי שוואן, אשר אינו קיים באסטרוציטים; נוגדן GFAP מזהה את החלבון glial fibrillary acidic protein, הממוקם באסטרוציטים, לצורך ביצוע בדיקת נדידה (migration assay).

התחל את הזריעה. זרע 1×10⁵ אסטרוציטים ב-1 מיליליטר מצע גידול בכל באער של פלטה עם ארבעה באערים בקוטר 15 מילימטר. הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות, עד להגעה של השכבה המנקבית למצב של התלכדות (confluence) מלאה.

במקביל, כדי להכין תאי swan להערכת הנדידה על שכבות מונואלייר של אסטרוציטים, הניחו כיסויי זכוכית עגולים מצופים ב-polylysine במבחנה של 50 milliliter והשתמשו בפיפט פלסטיק כדי לרסק אותם, ליצירת רסיסי זכוכית קטנים. העבירו את רסיסי הזכוכית לאחת הבארות של פלטת שש בארות באמצעות פינצטה. בחרו רסיסים שרוחבם כ-5 millimeters והעבירו חמישה רסיסים לכל אחת מהבארות האחרות.

גשי את תאי השוואן בטריפסין למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירי את התאים למבחנה של 15 מיליליטר וסובבי אותם בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. השעי את תאי השוואן בריכוז של 2 × 10⁶ תאים למשמליליטר בתוך תווך תרבית.

לאחר מכן, הוסף 20 µL מת сусפנזיית תאי השוואן מעל כל פרגמנט והדגר ב-37 °C וב-7% carbon dioxide למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הוצא את תאי השוואן מהאינקובטור. הוסף לכל באר כמות מספקת של מצע גידול מועשר ב-2 µM, four scale in ו-10 µg/mL של BPE.

כעת, יש לכסות לחלוטין את הפסיגמנטים עם התאים צמודים במצע דגירה למשך 24 עד 48 שעות, עד שהשברים של הזכוכית יהיו מכוסים לחלוטין בתאי swan. ברגע שהשברים מכוסים בתאי swan, הוצא את תאי ה-swan ואת האסטרוציטים מהאינקובטור. השתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות כל שבר עם תאי swan צמודים.

טבל את הפסמנט ב-HBSS כדי להסיר תאים שאינם קשורים, ולאחר מכן הפוך אותו כשהפנים כלפי מטה על שכבת המונואלייר של האסטרוציטים. לאחר שכל הפסמנטים הועברו, הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול תאים לכל באר.

אם ייבחנו השפעות של ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה, יש להוסיפם למצע. החזירו את הפלטה לאינקובטור ואפשרו לתאי השוואן (schwan cells) לנדוד למשך 24 עד 48 שעות לאחר תקופת הנדידה. רסיסי הזכוכית מקובעים לתחתית של כל באר על ידי הוספת 4% para formaldehyde למשך 30 דקות לאחר הקיבוע.

בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית של תאי השוואן ל-P 75, ולאחר מכן צבעו אותם באמצעות ערכת ABC Strept ADIN בתוספת DIAM benadine כדי לאפשר ויזואליזציה של תאי השוואן תחת מיקרוסקופ אור לאחר 10 ימים. קולטורה משותפת של תאי שוואן ואסטרוציטים מראה גבול חד בין שני סוגי התאים. כאן, תאי השוואן מזוהים על ידי P 75.

צביעה של קולטן NGF בעל זיקה נמוכה מוצגת בצבע אדום, ואסטרוציטים מזוהים על ידי צביעת GFAP המוצגת בצבע ירוק. הגבול בין תאים אלו בולט יותר כאשר משתמשים בפורסקולין וב-BPE בתרבית, מכיוון ששגשוג תאי שוואן מוגבר. לעומת זאת, במבחן תרבית משותפת זה של 10 ימים, התאים לא הופרדו היטב לטריטוריות שונות.

הדבר נבע מטכניקה לקויה וערבוב של שני סוגי התאים. בעוד שבדיקת הגבולה (boundary assay) נערכת, בדיקות נדידה (migration assays) מעריכות תנועה של סוג תא אחד על פני שטח פנים של סוג תא אחר, ולפיכך הן מעריכות תופעה השונה מזו של היווצרות גבולה. תמונה זו מראה תאי swan נודדים הרחק מקצה לבידה הזכוכית (cover slip), והחץ מצביע על כיוון נדידת התאים.

בעת ביצוע בדיקות vitro אלו, חשוב לזכור כי השפעת הרכיבים עשויה להיות על אסטרוציטים או על תאי שוואן (Schwann cells), ולכן נדרשים ניסויים המשכיים כדי להראות בדיוק איזה סוג תא אחראי להגברת או להפחתת הנדידה שנצפתה. בנוסף, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון אימונוכימיה, ובמיוחד בבדיקת הגבול (boundary assay), כדי להראות אילו מולקולות מופעלות יותר (upregulated) או פחות (down-regulated) בגבול שבין תאי שוואן לאסטרוציטים.