פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר מיקרו מכשירים המשמשים לגירוי מכני של סביבות תרבית דו-ממדיות ותלת-ממדיות של תאים. זה מושג על ידי שימוש בטכניקת יציקה וערימה של כריכים רב שכבתיים לייצור מערך של מיקרו עמודים המופעלים אנכית. כשלב שני, מערך המיקרו-פוסט המופעל אנכית משתנה כדי למתוח סרט תרבית, המחיל זנים מבוקרים היטב על תאים שגודלו על הסרט.

לחלופין, ניתן לשנות את המערך כדי לדחוס מבנים ביו-חומריים בדוגמת מיקרו על מנת להפעיל גירוי מכני על תאים. בתרבית במערך של הידרוג'לים תלת מימדיים מתקבלות תוצאות המראות יישום בו זמנית של מגוון זני דחיסה דו-ממדיים דו-ציריים ותלת מימדיים על פני המערך בהתבסס על ניתוח תמונה של סמני נאמנות פלואורסצנטיים. היי, אני כריס מריה מהמעבדות של קרייג סימונס ויו סאן במחלקה להנדסת מכונות ותעשייה והמכון לביו-חומרים והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת טורונטו.

היום נראה לכם נוהל לייצור מכשירי מיקרו המשמשים לגירוי מכני של תאים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים מגיבים למגוון כוחות מכניים בתרבית חוץ גופית. אז בואו נתחיל.

תהליך ייצור תבניות סנדוויץ' כולל הנחת שקיפות תקורה על פולי דימתיל סלואן או PDMS לא נרפא על מאסטר SU שמונה. הכריך מונח בערימת זכוכית ומתכת מוקצף ונרפא בתנור תחת דחיסה. לבסוף, הערימה מפורקת והשקיפות מתקלפת תוך שמירה על שכבת ה-PDMS המעוצבת.

כדי להתחיל בתהליך זה מערבבים היטב PDMS, מונומר ו-crosslinker. ביחס הסטנדרטי של 10 לאחד, הפקידו שלושה מיליליטר של תערובת PDMS לא נרפאה על SU שמונה מאסטר שיוצר בעבר ו-DGA את הפולימר בתא ואקום. לאחר מכן, הנח את כרית הקצף ואת SU 8 master על צלחת בסיס פרספקס.

הורד בזהירות את הצד החלק של שקף הזרקת דיו על ה-PDMS הלא מעובד, והקפד להימנע מלכידת בועות אוויר. לאחר מכן מקם מגלשת זכוכית מבודדת על גבי השקיפות מתחת לכרית הקצף השנייה וצלחת עליונה של פרספקס. מהדקים את הכריך יחד בעזרת C clamp.

מרפאים את כריך ה-PDMS בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הריפוי מוציאים את הכריך מהתנור ומניחים לו להתקרר. לאחר שהתקרר, הסר את המהדק ופרק את הכריך.

קלף בזהירות את השקיפות מהמאסטר SU 8 תוך שמירה על סרט ה-PDMS הפטנט. חתוך את הקצוות של סרט הדוגמה כדי להסיר PDMS עודפים, אחסן את שכבות הדוגמה בסביבה נטולת אבק עד שהן מוכנות לשימוש. החלק הבא של פרוטוקול זה כולל בניית מערך מיקרו מפוברק של עמודים המופעלים אנכית.

נדרש תהליך ייצור רב שכבתי כדי ליצור את מערך המיקרו פוסטים. שכבת ה-PDMS התחתונה ביותר מוכנה על ידי ייצור תבנית כריך. עבור ניסויים אלה נעשה שימוש בתבניות מעגליות בקוטר של 600 עד 1,200 מיקרון.

על מנת להעביר את שכבת ה-PDMS למגלשת זכוכית נקייה, השתמש ביחידת פריקת קורונה לטיפול ב-PDMS ובמשטחי זכוכית בפלזמת חמצן. לאחר מכן הניחו את שני המשטחים במגע זה עם זה. הניחו את הערימה על פלטה חמה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להשלמת תהליך ההדבקה.

יש לקלף את השקיפות ולהשליך. תהליך זה מבטיח שסרט ה-PDMS המעוצב לעולם לא ישתחרר ממצע קשיח, מה שמונע התכווצות של השכבות הבודדות. השכבה המעוצבת השנייה של הכריך נוצרת כתבנית העתק שלילית של הסרעפת ומבנה הפוסט הרצויים.

בהדגמה זו נעשה שימוש בעמודים עגולים בקוטר 500 מיקרון ליצירת שכבה זו. ראשית, הדביקו באופן זמני את תבנית ההעתק השלילית לשקופית זכוכית באמצעות סרט דו צדדי ומבודדים בוואקום להפקיד PDMS לא מרפא על הכריך, שכבת התבנית, דגה וציפוי הסיבוב למשך 45 שניות ב-1000 סיבובים לדקה המניבים דיאפרגמת הפעלה בעובי 60 מיקרון, רפאו חלקית את שכבת ה-PDMS המצופה ספין ב-80 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות או עד שה-PDMS דביק אך אינו מתעוות לצמיתות. כאשר נוגעים בהם, הסר את מגלשת הזכוכית והסרט הדו-צדדי משכבת ה-PDMS שנרפא חלקית וסרט השקיפות הצמד אותו לזוג שקופיות לטיפול בזכוכית ופלזמה.

טפל ב-PDMS שנרפא חלקית, ולאחר מכן הפוך את ה-PDMS והנח אותו ליישור מותאם אישית. היישור מורכב מצ'אק ואקום המותקן על מיקרו מניפולטור. לאחר מכן, פלזמה מטפלת בשכבת ה-PDMS הראשונה, ואז מניחה אותה על במה סיבובית מתחת לצ'אק הוואקום.

שימו לב ליישור בין שתי השכבות עם מערכת ראיית מכונה של אווטאר פי 12. בעזרת המניפולטור, יישר את השכבות והביא אותן בזהירות למגע. הפעל לחץ קל עם אצבע כדי להדביק את השכבות זו לזו.

לאחר מכן הסר את הכריך מהיישור. הסר את שקופיות הטיפול בזכוכית וודא שהשכבות נמצאות במגע מלא זו עם זו. ריפוי תנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות.

לאחר 30 דקות, ניתן לקלף את תבנית ה-PDMS השקופה והעתק המבודד מהמכשיר ולזרוק אותה. לאחר מכן המכשיר נרפא במלואו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לערוך ניסויים בתאים שגודלו על מצע דו-ממדי מעוות. מערך המיקרו-מפעילים משתנה על ידי הדבקת שכבת PDMS שלישית להתקן.

שכבת ה-PDMS השלישית מורכבת ממבנה דו-שכבתי. המעגל התחתון תואם את גודל חלל ההפעלה מתחת לעמודי המיקרו המופעלים. קוטר המעגל העליון גדול ב -100 מיקרון מקוטר עמודי הטעינה.

ערוץ מיקרו ברוחב 200 מיקרון מחבר את התכונות הללו לאזור חיבור וישמש לשימון עמודי הטעינה וסרט התרבית. כדי לשנות את המכשיר לתרבית דו-ממדית, תחילה יש לייצר ולחבר אליו את המחברים כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן סובב שכבה של 10 עד 15 מיקרון של PDMS על הצד החלק של תרופת שקיפות.

סרט ה-PDMS הדק ב-80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. השלב הבא הוא להחיל ואקום על המפעילים ולהצמיד את שכבת ה-PDMS למכשיר. כדי להשיג זאת.

ראשית, החל ואקום ברמה נמוכה על המפעילים ומוריד את מערך הפוסטים לטיפול בפלזמה ולקשר. סרט ה-PDMS המצופה ספין למכשיר המיקרו המופעל כמתואר בפרוטוקול הכתוב, העמודים וסרט התרבות יישארו הידרופיליים לזמן קצר. לאחר מכן חבר את מזרק חומר הסיכה למכשיר ומלא את תעלות הסיכה בגליצרול 90% בתמיסת מים נטולת יונים.

בנוסף לשימון, נוסחה זו שומרת על ההידרופיליות של ה-PDMS ללא הגבלת זמן ומפחיתה מקדמי חיכוך. הנח את המכשיר על פלטה חמה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס והמשיך להזריק חומר סיכה לתעלה, מה שגורם לעליית לחץ קטנה. לאחר מספר דקות, בועות האוויר התפזרו דרך ה-PDMS וכל המשטחים ישומנים.

לשלב האחרון, הסר את הלחץ השלילי המשחרר את העמודים באמצעות אזמל. חותכים סביב סרט ה-PDMS הדק. קלף בזהירות את גב השקיפות הרחק מקשר הפלזמה של המכשיר.

אטם PDMS חתוך ביד סביב אזור תרבית המכשיר. עקרו את המכשיר על ידי השרייתו באתנול 70% למשך חמש דקות, ולאחר מכן טיפול תחת אור UV קוטל חיידקים בארון בטיחות ביולוגי למשך 45 דקות. פלזמה, לטפל במשטח ולדגור עם 100 מיקרוגרם למיליליטר קולגן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה של הלילה, שטפו את המכשיר עם מי מלח סטריליים עם פוספט או PBS ותאי זרעים ב-10 עד 15,000 תאים לסנטימטר מרובע. בעקבות פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים, ניתן לשנות את מערך המיקרו-מפעיל לביצוע ניסויים בתאים שגודלו במבנים תלת מימדיים של הידרוג'ל בדוגמת צילום. ראשית, מיוצרת פלטפורמה רב-שכבתית מבוססת PDMS.

לאחר כיסוי פלטפורמת הבסיס במת', מוזרקת תמיסת מבשר הידרוג'ל להחלקה של כיסוי זכוכית. לאחר מכן חומר ביולוגי הניתן לשימור פוטו פולימר מעוצב במיקרו לתוך המערך ותמיסת המבשר שנותרה נשטפת. לאחר מכן ניתן להשתמש במערך עמדות הטעינה המופעלות אנכית כדי להפעיל כוחות מכניים דחיסה על תאים שגודלו בביו-חומרים תלת מימדיים עם חתיכות סקוטש המסווה את האזורים סביב העמודים מצפים את המכשיר בפרלין C במעבדת PDS 2010 COTER 2 מערכת.

זה ישפר את קינטיקה של פילמור עבור מערכת הביו-חומרים. לאחר הציפוי, הסר את המכשיר ממערכת הציפוי וקילף את הסקוטש, והשאיר שכבה קונפורמית של פרלין C מעל העמודים. ואז כיסוי הזכוכית של מת' ACRL מחליק על ידי טבילה בתמיסה של 2% נפח לנפח של פרופיל אוקסי של שלושה טרימת' מתאקרילט ב-95% אתנול למשך שתי דקות.

שוטפים את הכיסוי. החלק פנימה 100% אתנול, ולאחר מכן אפייה ב-100 מעלות צלזיוס, והשאיר קבוצות מתאקרילט על פני השטח. יצוק מרווח PDMS בעובי 200 מיקרון.

מצלמים בצלחת פטרי וחותכים אותו לחלקים קטנים. פלזמה קושרת ארבעה מהקטעים הקטנים הללו סביב קצה החלקת הכיסוי הקשורה ל-meac. לאחר מכן פלזמה קושרת את החללים לאזורי ה-PDMS של המכשיר המכסה את ציפוי Lene C.

לבסוף עיקר את המכשיר על ידי שטיפה באתנול 70% וחשיפתו לקוטל חיידקים או לאור UV בארון בטיחות ביולוגי למשך 45 דקות. כדי לצלם דפוס ליטוגרפי של התא עמוס PEG הידרוג'לים לתוך המכשירים. הכן את פתרונות הקודמן ויוזם הצילום כמתואר בפרוטוקול הכתוב וערבב אותם היטב לקבלת תמיסה בריכוז של 0.4% משקל לנפח של יוזם צילום.

סנן את התערובת דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרון כדי לעקר ולהסיר חלקיקים, תרביות תאי קרח טריפסין, והכין תרחיף תאים במצע תרבית בריכוז כפול של תאי הקצה הרצויים. לאחר מכן מערבבים את תרחיף התא ואת תמיסת יוזם הצילום של מבשר ההידרוג'ל המסונן ביחס של אחד לאחד. הזרקו את התמיסה למכשיר המיקרו באמצעות מחט ארוכה בגודל 25.

הימנע בזהירות מלכידת בועות במכשיר. יישר מסיכת שקיפות מודפסת לסימני היישור על פני ההתקן. הגדר מערכת תאורת UV שתספק מינון UV באורך גל של 365 ננומטר של 17.5 מילי-וואט לסנטימטר רבוע על פני השטח של המכשיר.

האירו את ההידרוג'ל דרך המסכה למשך 195 שניות לאחר ההארה. שטפו את תמיסת מבשר ההידרוג'ל הלא מפולימר עם PBS והחליפו את ה-PBS באמצעי תרבית, הפעילו את עמודי הטעינה כדי לדחוס את מבני ההידרוג'ל. כאן, מוצג מכשיר מדגם שלם לתרבית גירוי מכאנו דו-ממדית.

צבע אדום משמש לסימון תעלות אספקת הלחץ המפעילות וכחול D משמש לסימון אפיון המתח של תעלות הסיכה. ניתן להשתמש בניסויים כדי לקבוע שדות מתח מיושמים על ידי מעקב אחר תנועת חרוזים פלואורסצנטיים על המצעים. כתמים אדומים מייצגים את המיקום הלא מעוצב של החרוזים ואילו כתמים ירוקים מייצגים את המיקומים המעוותים.

לראות כאן מכשיר לדוגמה לניסויי דחיסה תלת מימדיים שבו משתמשים בצבע ירוק לסימון תעלות לחץ הפעלה. התצוגה מלמעלה למטה של מערך המיקרו פוסט חושפת את מבנה ההידרוג'ל המעוצב על גבי צד העמוד תמונות משוחזרות של חרוזי פלורסנט במבנה ההידרוג'ל. תחת מנוחה ולחצי הפעלה של 55 קילו פסקל מדגימים את תהליך אפיון הזן במערכת תרבית תלת מימדית.

אז זה עתה הראינו לכם כיצד לייצר מכשירים המשמשים לגירוי מכני של תאים במערכות תרבית דו-ממדיות או תלת-ממדיות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על המכשירים שלך נקיים וללא אבק ככל האפשר ולהיות סבלניים, במיוחד במהלך שלבי היישור. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.