פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר במיקרו-פבריקציה התקנים המשמשים לגירוי מכני של תאים בסביבות גידול דו-ממדיות ותלת-ממדיות. דבר זה מושג באמצעות שימוש בטכניקת עיצוב ושכבה של "סנדוויץ'" רב-שכבתי ליצירת מערך של מיקרו-עמודים המופעלים אנכית. כשלב שני, מערך המיקרו-עמודים המופעלים אנכית עובר שינוי כדי למתוח סרט גידול, דבר המפעיל מאמצים מבוקרים היטב על תאים המגודלים על גבי הסרט.

לחלופין, ניתן לשנות את המערך כדי לדחוס מבני חומרים ביו-מסננים בעלי תבנית מיקרוסקופית, במטרה להפעיל גירוי מכני על התאים. גידול במערך של הידרוג'לים תלת-ממדיים מניב תוצאות המראות הפעלה סימולטנית של טווח מאמצי דחיסה דו-צירים דו-ממדיים ותלת-ממדיים ברחבי המערך, בהתבסס על ניתוח תמונה של סימני ייחוס פלואורסצנטיים. שלום, אני כריס מריהס מהמעבדות של קרייג סימونس ו-U Sun במחלקה להנדסה מכנית ותעשייתית ובמכון לחומרי ביו ומסגרות הנדסה ביו-רפואיות באוניברסיטת טורונטו.

היום נדגים לכם הליך לייצור מכשירים מיקרוסקופיים המשמשים לגירוי מכני של תאים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים מגיבים למגוון כוחות מכניים בתרבית in vitro. אז בואו נתחיל.

תהליך ייצור תבנית הסנדוויץ' כולל הנחת דף שקיפות מעל poly dimethyl siloxane או PDMS שאינו מאומח על גבי מאסטר של SU-8. הסנדוויץ' מונח בתוך ערימה של זכוכית קצפית ומתכת ומאומח בתנור תחת דחיסה. לבסוף, הערימה מפורקת ודף השקיפות מקולף, תוך השארת שכבת ה-PDMS המעובת.

כדי להתחיל בתהליך זה, ערבבו היטב את ה-PDMS, המonomer וה-crosslinker. ביחס סטנדרטי של 10 ל-1, שפכו 3 mL של תערובת PDMS שאינה מאובחית על גבי תבנית SU-8 שיוצרה מראש, ובצעו degas לפולימר בתא ואקום. לאחר מכן, הניחו את פד הספוג ואת תבנית ה-SU-8 על פלטת בסיס מפלקסיגלס.

הנח בעדינות את הצד החלק של שקיפות למדפסת הזרנקה על ה-PDMS שטרם נרפא, תוך הקפדה על מניעת כליאת בועות אוויר. לאחר מכן, מקם פרוסת זכוכית סילוזילית (Siloized) מעל השקיפות, מתחת לרפדי הספוג השניים ולוח עליון של פלקסיגלס. הדק את ה"סנדוויץ'" באמצעות תפס C (C clamp).

בצעו פילוס (Cure) של סנדוויץ' ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הפילוס, הוציאו את הסנדוויץ' מהתנור והניחו לו להתקרר. לאחר הקירור, הסירו את התסבכת ופרקו את הסנדוויץ'.

קלפו בזהירות את השקיפות מה-SU-8 master תוך שמירה על שכבת ה-PDMS המודפסת. קצצו את קצוות שכבת התבנית כדי להסיר שאריות PDMS, ואחסנו את שכבות התבנית בסביבה נטולת אבק עד למועד השימוש בהן. החלק הבא של פרוטוקול זה כולל בנייה של מערך מיוצר במיקרו של עמודי הפעלה אנכיים.

תהליך ייצור רב-שכבתי נדרש להכנת המערך של המיקרו-עמודים. שכבת ה-PDMS התחתית ביותר המעוצבת מוכנה באמצעות ייצור תבנית סנדוויץ'. עבור ניסויים אלו, נעשה שימוש בתבניות מעגליות שקוטרן נע בין 600 ל-1,200 מיקרון.

על מנת להעביר את שכבת ה-PDMS לשקופית זכוכית נקייה, השתמש ביחידה לפריקת קורונה (Corona discharge) כדי לטפל במשטחי ה-PDMS והזכוכית באמצעות פלזמה של חמצן. לאחר מכן, הצמד את שני המשטחים זה לזה. הנח את הערימה על פלטה מחממת בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות כדי להשלים את תהליך ההדבקה.

קלפו את השקיפות והשליכו אותה. תהליך זה מבטיח שסרט ה-PDMS בעל התבנית לא ישוחרר מעולם ממצע קשיח, דבר המונע התכווצות של השכבות הבודדות. שכבת הסנדוויץ' המעוצבת השנייה נוצרת כהעתק שלילי של הדיאפרגמה ומבנה העמודים הרצויים.

בהדגמה זו, נעשה שימוש בעמודים מעגליים בקוטר 500 microns ליצירת שכבה זו. ראשית, הצמדו זמנית את תבנית השכבה השלילית לפסליית זכוכית באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי, ובתוך מכשיר ליישון בוואקום, השקיפו PDMS שאינו מאובק על שכבת התבנית; בצעו Degas ו-spin coat למשך 45 שניות במהירות של 1000 rotations per minute, כדי לקבל דיאפרגמה של הפעלה בעובי 60 microns. אבקו חלקית את שכבת ה-PDMS שעברה spin coating בטמפרטורה של 80 °C למשך כ-20 דקות, או עד שה-PDMS הופך לדביק אך אינו משתנה צורה באופן קבוע בעת מגע. הסירו את פסליית הזכוכית ואת הסרט הדו-צדדי משכבת ה-PDMS המאובקת חלקית ומסרט השקיפות, הצמידו אותה לזוג פסלייות זכוכית לטיפול ובצעו plasma.

טפל ב-PDMS שהתקשח באופן חלקי, לאחר מכן הפוך את ה-PDMS והנח אותו בתוך מיישר (aligner) שהוכנה במיוחד. המיישר מורכב מראש ואקום (vacuum chuck) המורכב על מיקרו-מניפולטור. לאחר מכן, בצע טיפול בפלזמה לשכבת ה-PDMS הראשונה, והנח אותה על במה מסתובבת מתחת לראש הוואקום.

בחן את היישור בין שתי השכבות באמצעות מערכת ראייה ממוחשבת עם זום של 12 פעמים. בעזרת המניפולטור, יישר את השכבות והבא אותן למגע זה בזה בזהירות. הפעל לחץ קל עם אצבע כדי להדביק את השכבות זו לזו.

לאחר מכן הוציאו את ה"סנדוויץ'" מהמיישר (aligner). הסירו את שקפי הזכוכית המקבעים וודאו שהשכבות נמצאות במגע מלא זו עם זו. בשלו בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך 30 דקות נוספות.

לאחר 30 דקות, ניתן לקלף את תבנית ה-PDMS השקופה והמבודדת מההתקן ולהשליכה. לאחר מכן, ההתקן עובר תהליך פולימריזציה מלא בטמפרטורה של 80 °C למשך ארבע שעות לפחות, כדי לבצע ניסויים עבור תאים המגודלים על מצע דו-ממדי דפורמטיבי. מערך המיקרו-אקטואטורים משונה על ידי הצמדה של שכבת PDMS שלישית להתקן.

שכבת ה-PDMS השלישית מורכבת ממבנה בעל שתי שכבות. המעגל התחתון תואם בגודלו לחלל ההפעלה הנמצא מתחת למיקרו-עמודים המופעלים. קוטר המעגל העליון גדול ב-100 מיקרונים מקוטר עמודי הטעינה.

מיקרו-תעלה ברוחב 200 micron מחברת בין מאפיינים אלו לאזור חיבור, ותשמש לסיכוך של עמודי הטעינה וסרט התרבית. כדי להתאים את ההתקן לתרבית דו-ממדית (2D), ייצרו תחילה את המחברים והדביקו אותם להתקן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של שכבת PDMS בעובי 10 עד 15 micron על הצד החלק של דף שקיפות והקשיחו אותה.

את שכבת ה-PDMS הדקה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. השלב הבא הוא הפעלת ואקום על המפעילים (actuators) והדבקת שכבת ה-PDMS למכשיר. כדי להשיג זאת.

ראשית, החילו ואקום ברמה נמוכה מהמפעילים כדי להוריד את מערך העמודים שעברו טיפול בפלזמה והדבקה. בעקבות ציפוי הספין של שכבת ה-PDMS על המיקרו-מכשיר המופעל, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, העמודים ושכבת התרבית יישארו הידרופיליים למשך זמן קצר. לאחר מכן, חברו את מזרק חומר ההחלקה למכשיר ומלאו את תעלות הסיכה בתמיסה של 90% glycerol במים דה-יוניים.

בנוסף לשימון, פורמולציה זו שומרת על ההידרופיליות של ה-PDMS לאורך זמן ובכך מפחיתה את מקדמי החיכוך. הניחו את המכשיר על פלטה חמה בטמפרטורה של 40 °C והמשיכו להזריק חומר סיכה לתוך התעלה, מה שיגרום לעלייה קלה בלחץ. לאחר מספר דקות, בועות האוויר יתפזרו דרך ה-PDMS וכל המשטחים ישומנו.

בשלב האחרון, הסירו את הלחץ השלילי ושחררו את העמודים באמצעות סכיליל. גזרו מסביב לשכבת ה-PDMS הדקה. קלפו בזהירות את תמיכת השקיפות מהקשר הפלזמה של המכשיר.

אטם PDMS חתוך ידנית סביב אזור התרבית של המכשיר. סטריליזציה של המכשיר תתבצע על ידי השריה ב-70% ethanol למשך חמש דקות, ולאחר מכן טיפול תחת אור UV קוטל חיידקים בתוך קביינט בטיחות ביולוגית למשך 45 דקות. טיפול בפלזמה של פני השטח ודגירה עם 100 µg/mL קולגן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר דגירה למשך לילה, שטפו את המכשיר בתמיסת פוספט בופר סלין סטרילית או PBS וזריעו תאים בריכוז של 10 עד 15,000 תאים לסנטימטר רבוע. בהתאם לפרוטוקולי תרביות תאים סטנדרטיים, ניתן להתאים את מערך המיקרו-אקטיואטורים לביצוע ניסויים עבור תאים המגודלים במבני הידרוג'ל תלת-ממדיים בעלי תבנית פוטוغرافית. ראשית, מייצרים פלטפורמה רב-שכבתית מבוססת PDMS.

לאחר כיסוי פלטפורמת הבסיס בשיטה זו, מזריקים תמיסת קדם-הידרוג'ל של כיסוי זכוכית קשורה. לאחר מכן, חומר ביולוגי הניתן לספיגה ופולימרי-פוטואקטיבי מודפס בדפוס מיקרו למערך, ותמיסות קדם-הידרוג'ל שנותרו נשטפות החוצה. ניתן להשתמש במערך העמודים המפעילים עומס באופן אנכי כדי להפעיל כוחות מכניים דוחסים על תאים המגודלים בחומרים ביולוגים תלת-ממדיים, כאשר רצועות סרט דביק (Scotch) ממסכות את האזורים סביב העמודים לפני ציפוי המכשיר ב-Parylene C במערכת PDS 2010 lab COATER 2.

פעולה זו תשפר את קינטיקת הפולימריזציה עבור מערכת הביומטריאל. לאחר הציפוי, הוצא את ההתקן ממערכת הציפוי והסר את סרט ההדבקה, כך שתישאר שכבה קונפורמלית של paraline C מעל העמודים. לאחר מכן, בצע מתילציה לכיסוי הזכוכית מסוג ACRL על ידי טבילה בתמיסה של 2% נפח לנפח של trimethoxy propyl methacrylate ב-95% ethanol למשך שתי דקות.

שטפו את כיסוי הזרימה. טבלו ב-100% ethanol, ולאחר מכן חממו בתנור בטמפרטורה של 100 °C, כדי להשאיר קבוצות methacrylate על פני השטח. יצקו מפריד PDMS בעובי של 200 micron.

יש לצפות בפיליאם צלחת פטרי ולחתוך אותה למקטעים קטנים. הדבק באמצעות פלזמה ארבעה ממקטעים קטנים אלו מסביב לקצה של ה-cover slip הקשור ל-meac. לאחר מכן, הדבק באמצעות פלזמה את הרווחים לאזורי ה-PDMS של המכשיר המכסה את ה-Lene C coated.

לבסוף, יש לעקר את המכשיר על ידי שטיפה ב-70% ethanol וחשיפה לחומר חיטוי או לאור UV בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית למשך 45 דקות. כדי ליצור תבנית פוטוליתוגרפית של הידרוג'לים מסוג PEG טעונים בתאים בתוך המכשירים, יש להכין את תמיסות הפרקורסור והפוטו-איניציאטור כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ולערבב אותן היטב עד לקבלת תמיסה בריכוז של 0.4% weight per volume של פוטו-איניציאטור.

סננו את התערובת דרך מסנן מזרק של 0.45 micron כדי לעקר ולהסיר חלקיקים, בצעו trypsin לתרביות תאים קפואות, והכינו סספנסיון תאים במצע גידול בריכוז תאים כפול מהריכוז הרצוי לסוף התהליך. לאחר מכן, ערבבו את סספנסיון התאים ואת תמיסת הפוטורכיב של חומר המוצא להידרוג'ל המסוננת ביחס של אחד ለአחד. הזריקו את התמיסה אל המכשיר המיקרוסקופי באמצעות מחט ארוכה במידה 25 gauge.

הימנעו בזהירות מכליאת בועות במכשיר. יישרו מסכת שקיפות מודפסת אל סימני היישור על פני השטח של המכשיר. הגדירו מערכת הקרנה ב-UV כדי לספק מינון UV באורך גל של 365 nanometer בעוצמה של 17.5 milliwatt per square centimeter על פני השטח של המכשיר.

האיר את ההידרוג'ל דרך המסכה למשך 195 שניות לאחר ההארה. שטוף את תמיסת חומר המוצא של ההידרוג'ל שלא פולימרה באמצעות PBS והחלף את ה-PBS במצע גידול; הפעל את מוטוני הטעינה כדי לדחוס את מבני ההידרוג'ל. כאן מוצג התקן דגימה מושלם לתרבית עם גירוי מכני בדו-ממד (2D).

צבע אדום משמש לסימון תעלות הולכת לחץ ההפעלה וצבע כחול משמש לסימון תעלות הסיכוך לאפיון מאמץ. ניתן להשתמש בניסויים כדי לקבוע שדות מאמץ מופעלים על ידי מעקב אחר תנועת חרוזי פלואורסצנציה על התשתיות. נקודות אדומות מייצגות את מיקום החרוזים לפני העיוות, בעוד שנקודות ירוקות מייצגות את המיקומים לאחר העיוות.

ניתן לראות כאן התקן לדגימה עבור ניסויי דחיסה תלת-ממדיים, שבו נעשה שימוש בצבע ירוק לסימון ערוצי לחץ ההפעלה. המבט מלמעלה על מערך המיקרו-עמודים חושף את מבנה ההידרוג'ל המודפס על גבי העמודים; תמונות משוחזרות של חרוזי פלואורסצנציה בתוך מבנה ההידרוג'ל תחת מצב מנוחה ולחצי הפעלה של 55 kPa מדגימות את תהליך אפיון המאמץ במערכת תרבית תלת-ממדית.

הראינו לכם כיצד לייצר התקנים המשמשים לגירוי מכני של תאים במערכות תרבית דו-ממדיות או תלת-ממדיות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על התקנים נקיים וללא אבק ככל האפשר ולהיות סבלניים, במיוחד במהלך שלבי היישור. וזהו.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.