פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר במיקרו-פבריקציה התקנים המשמשים לגירוי מכני של תאים בסביבות גידול דו-ממדיות ותלת-ממדיות. דבר זה מושג באמצעות שימוש בטכניקת יציקה וערימה של שכבות "סנדוויץ'", כדי להפיק מערך של מיקרו-עמודים המופעלים אנכית. כשלב שני, מערך המיקרו-עמודים המופעל אנכית משונה כך שימתח קרום גידול, דבר המפעיל מאמצים מבוקרים היטב על תאים המגודלים על גבי הקרום.

לחלופין, ניתן לשנות את המערך כדי לדחוס מבני ביו-חומרים בעלי תבניות מיקרוסקופיות, במטרה להפעיל גרייה מכנית על תאים. גידול במערך של הידרוגלים תלת-ממדיים מניב תוצאות המראות הפעלה סימולטנית של טווח מאמצי דחיסה דו-ממדיים בי-אקסיאליים ותלת-ממדיים על פני המערך, בהתבסס על ניתוח תמונות של סמני ייחוס פלואורסצנטיים. שלום, אני כריס מריהס מהמעבדות של קרייג סימונס ו-U Sun במחלקה להנדסה מכנית ותעשייתית ובמכון לביומטריאלים והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת טורונטו.

היום נראה לכם הליך לייצור התקנים מיקרוסקופיים המשמשים לגירוי מכני של תאים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים מגיבים למגוון כוחות מכניים בתרבית in vitro. אז בואו נתחיל.

תהליך ייצור תבנית הסנדוויץ' כולל הנחת שקיפות עליונה על גבי poly dimethyl siloxane או PDMS שאינו מאובק על גבי תבנית SU-8. הסנדוויץ' ממוקם בתוך ערימה של זכוכית קצפית ומתכת ומאובק בתנור תחת דחיסה. לבסוף, הערימה מפורקת והשקיפות מקולפת, תוך השארת שכבת ה-PDMS בעלת התבנית.

כדי להתחיל בתהליך זה, ערבבו ביסודיות PDMS, מונומר ומקשר צולב (crosslinker). ביחס סטנדרטי של 10 ל-1, שפכו שלושה מיליליטרים של תערובת PDMS שאינה מאובקעת על גבי תבנית SU-8 שהוכנה מראש, ובצעו דגזינג (degassing) של הפולימר בתא ואקום. לאחר מכן, הניחו את רפידת הספוג ואת תבנית ה-SU-8 על לוח בסיס מפלקסיגלאס.

הנח בעדינות את הצד החלק של דף שקיפות להדפסת הזרקת דיו על ה-PDMS שטרם נרפא, תוך הקפדה להימנע מלכידת בועות אוויר. לאחר מכן, מקם תגית זכוכית מסילוסיליזציה (Siloized) מעל דף השקיפות, מתחת לרפידת הספוג השנייה וללוח עליון מפלקסיגלס. הדק את השכבות יחד באמצעות מלחצי C.

בצעו פולימריזציה (Curing) של ה"סנדוויץ'" PDMS בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הפולימריזציה, הוציאו את ה"סנדוויץ'" מהתנור והמתינו לקירורו. לאחר הקירור, הסירו את התפסן ופרקו את ה"סנדוויץ'".

קלפו בזהירות את השקיפות מה-SU eight master תוך שמירה על סרט ה-PDMS שנוצר. קצצו את קצות סרט התבנית כדי להסיר עודפי PDMS ושמרו את שכבות התבנית בסביבה נקייה מאבק עד למועד השימוש בהן. החלק הבא של פרוטוקול זה עוסק בבניית מערך מיוצר במיקרו של עמודים המופעלים אנכית.

תהליך ייצור רב-שכבתי נדרש להכנת המערך של העמודי-מיקרו. שכבת ה-PDMS התחתונה ביותר המעוצבת מוכנה באמצעות ייצור תבנית מסוג סנדוויץ'. עבור ניסויים אלו, נעשה שימוש בתבניות מעגליות בקוטר שבין 600 ל-1,200 מיקרון.

על מנת להעביר את שכבת ה-PDMS לפלטת זכוכית נקייה, השתמש ביחידה לפריקת קורונה (Corona discharge) כדי לטפל במשטחי ה-PDMS והזכוכית באמצעות פלזמה של חמצן. לאחר מכן, הבא את שני המשטחים במגע זה עם זה. הנח את המבנה על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות כדי להשלים את תהליך ההדבקה.

קלפו את השקיפות והשליכו אותה. תהליך זה מבטיח שסרט ה-PDMS בעל התבנית לא ישוחרר לעולם ממצע קשיח, דבר המונע התכווצות של השכבות הבודדות. השכבה השנייה של תבנית הסנדוויץ' נוצרת כהעתק שלילי של מבנה הדיאפרגמה והעמודים הרצויים.

בהדגמה זו, עמודי מעגלים בקוטר 500 מיקרון שימשו ליצירת שכבה זו. ראשית, הצמידו באופן זמני את תבנית השכבה השלילית למסבכת זכוכית באמצעות סרט דביק דו-צדדי, ובתוך מייבש בוואקום שפכו PDMS שאינו מאובחה על גבי תבנית השכבה. בצעו דגזינג (Degas) וספין-קוטינג למשך 45 שניות ב-1000 סל"ד, כדי להשיג דיאפרגמה של הפעלה בעובי 60 מיקרון. בצעו אבחה חלקית לשכבת ה-PDMS שעברה ספין-קוטינג ב-80 °C למשך כ-20 דקות, או עד שה-PDMS הופך לדביק אך אינו מעוות באופן קבוע בעת מגע. הסירו את מסבכת הזכוכית והסרט הדביק הדו-צדדי משכבת ה-PDMS המאובחת חלקית, והצמידו סרט שקיפות לזוג מסבכות טיפול מזכוכית ובצעו פלסמה.

טפל ב-PDMS שהתקשה חלקית, לאחר מכן הפוך את ה-PDMS והנח אותו בתוך מתאם יישור בהתאמה אישית. המתאם מורכב מראש ואקום המורכב על מניפולטור מיקרוסקופי. לאחר מכן, בצע טיפול בפלזמה לשכבת ה-PDMS הראשונה, והנח אותה על במה מסתובבת מתחת לראש הוואקום.

בחן את היישור בין שתי השכבות באמצעות מערכת ראייה ממוחשבת עם הגדלה של 12 פעמים. בעזרת המניפולטור, יישר את השכבות והבא אותן למגע בזהירות. הפעל לחץ קל בעזרת אצבע כדי להדביק את השכבות זו לזו.

לאחר מכן הוצא את ה"סנדוויץ'" מהמיישר. הסר את שקופיות הטיפול בזכוכית וודא שהשכבות נמצאות במגע מלא זו עם זו. בצע פתיקה בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך 30 דקות נוספות.

לאחר 30 דקות, ניתן לקלף מהמכשיר את תבנית ה-PDMS השקופה והמבודדת ולהשליכה. לאחר מכן, המכשיר עובר תהליך ריפוי מלא בטמפרטורה של 80 °C למשך ארבע שעות לפחות, כדי לבצע ניסויים בתאים המגודלים על מצע דו-ממדי שעובר דפורמציה. מערך המיקרו-אקטואטורים משונה על ידי הדבקת שכבת PDMS שלישית למכשיר.

שכבת ה-PDMS השלישית מורכבת ממבנה דו-שכבתי. המעגל התחתון תואם לגודלה של חלל ההפעלה שמתחת למיקרו-עמודים המופעלים. קוטרו של המעגל העליון גדול ב-100 microns מקוטר עמודי הטעינה.

מיקרו-תעלה ברוחב 200 micron מחברת בין המבנים הללו לאזור חיבור, ותשמש לסיכוך של מוטות הטעינה ושל קולט התרבית. כדי להתאים את ההתקן לתרבית דו-ממדית (2D), ראשית ייצרו והדביקו אליו את המחברים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של שכבת PDMS בעובי 10 עד 15 micron על הצד החלק של שקופית, והבקיעו אותה.

את שכבת ה-PDMS הדקה בטמפרטורה של 80 °C למשך ארבע שעות לפחות. השלב הבא הוא הפעלת ואקום על המפעילים (actuators) והדבקת שכבת ה-PDMS למכשיר. כדי להשיג זאת.

ראשית, החילו ואקום ברמה נמוכה מהמפעילים (actuators) כדי להוריד את מערך העמודים לטיפול בפלזמה ולהדבקה. צפו את המכשיר המיקרו-מופעל בסרט PDMS בשיטת spin coating כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב; העמודים וסרט התרבית יישארו הידרופיליים למשך זמן קצר. לאחר מכן, חברו את מזרק החומר הסיכוך למכשיר ומלאו את תעלולי הסיכוך בתמיסה של 90% glycerol במים דאיוניים.

בנוסף לסיכוך, פורמולציה זו שומרת על ההידרופיליות של ה-PDMS ללא הגבלה ובכך מפחיתה את מקדמי החיכוך. הניחו את ההתקן על פלטה מחממת בטמפרטורה של 40 °C והמשיכו להזריק חומר סיכוך אל התעלה, דבר שיגרום לעלייה קלה בלחץ. לאחר מספר דקות, בועות האוויר יתפזרו דרך ה-PDMS וכל המשטחים יסוככו.

בשלב הסופי, הסירו את הלחץ השלילי ושחררו את העמודים באמצעות סקלפל. גזרו מסביב לשכבת ה-PDMS הדקה. קלפו בזהירות את תמיכת השקיפות מהחיבור של הפלזמה במכשיר.

אטם PDMS חתוך ידנית מסביב לאזור התרבית של המכשיר. סטריליזציה של המכשיר תתבצע על ידי השריה ב-70% ethanol למשך חמש דקות, ולאחר מכן טיפול תחת אור UV קוטל חיידקים במabilis בטיחות ביולוגית למשך 45 דקות. טיפול בפלסמה של הפני השטח ודגירה עם 100 µg/mL קולגן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר דגירה למשך לילה, שטפו את המכשיר בתמיפת סליין פוספטית מאובנת (phosphate buffered saline) סטרילית או PBS, וזריעו תאים בריכוז של 10 עד 15,000 תאים לסנטימטר רבוע. בהתאם לפרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים, ניתן להתאים את מערך המיקרו-אקטואטורים לביצוע ניסויים בתאים המגודלים במבני הידרוג'ל תלת-ממדיים המודפסים פוטו-גרפית. ראשית, יוצרת פלטפורמה רב-שכבתית המבוססת על PDMS.

לאחר כיסוי פלטפורמת הבסיס בבתחליל הידרוג'ל של כיסוי זכוכית רלוונטי, מזריק את תמיסת הפרה-ג'ל. לאחר מכן, מבצעים דפוס מיקרו של חומר ביולוגי הניתן לשימור באמצעות פוטו-פולימריזציה לתוך המערך, ואת שארית תמיסת הפרה-ג'ל שוטפים החוצה. ניתן להשתמש במערך של עמודי העמסה המופעלים אנכית כדי להפעיל כוחות מכניים דוחסים על תאים המגודלים בחומרים ביולוגים תלת-ממדיים, כאשר רצועות של סרט דביק (scotch tape) ממסכות את האזורים שסביב העמודים; מצפים את המכשיר ב-paraline C במערכת PDS 2010 lab COTER two.

פעולה זו תשפר את קינטיקת הפולימריזציה של מערכת הביומטריאל. לאחר הציפוי, הוציאו את המכשיר ממערכת הציפוי והסירו את סרט ההדבקה (scotch tape), כך שתישאר שכבה קונפורמית של paraline C מעל העמודים. לאחר מכן, בצעו מתילציה של הלוחית זכוכית ה-ACRL על ידי טבילה בתמיסה בריכוז של 2% (נפח לנפח) של trimethoxy propyl methacrylate ב-95% ethanol למשך שתי דקות.

שטפו את כיסוי הזריקה. טבלו ב-100% ethanol, ולאחר מכן בשלו בטמפרטורה של 100 °C, כדי להשאיר קבוצות methacrylate על פני השטח. יצקו מפריד PDMS בעובי של 200 micron.

כסו את צלחת פטרי ביריעה וחלקו אותה למקטעים קטנים. הצמידו באמצעות פלזמה ארבעה ממקטעים קטנים אלו מסביב לקצה של ה-cover slip הקשור ל-meac. לאחר מכן, הצמידו באמצעות פלזמה את הרווחים לאזורי ה-PDMS של המכשיר המכסה את ה-Lene C coated.

לבסוף, עקרו את המכשיר על ידי שטיפה ב-70% ethanol וחשיפה לחומר קוטל חיידקים או לאור UV בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית למשך 45 דקות. כדי ליצור תבניות פוטוליתוגרפיות של הידרוג'לים מסוג PEG המכילים תאים בתוך המכשירים, הכינו את תמיסות הפרקורסור והפוטו-איניציאטור כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, וערבבו אותן ביסודיות כדי לקבל תמיסה בריכוז של 0.4% משקל לנפח של פוטו-איניציאטור.

סננו את התערובת דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרון כדי לעקר אותה ולהסיר חלקיקים, בצעו עיכול בטריפסין של תרביות תאי קרח, והכינו תרחיף תאים במצע גידול בריכוז תאים כפול מהריכוז הרצוי בנקודת הסיום. לאחר מכן, ערבבו את תרחיף התאים ואת תמיסת הפוטו-איניצ'יטור של חומר המוצא להידרוג'ל המסוננת ביחס של אחד לאחד. הזריקו את התמיסה אל תוך המיקרו-מכשיר באמצעות מחט ארוכה בכיל 25.

הימנעו בזהירות מכליאת בועות בתוך ההתקן. יישרו מסכת שקיפות מודפסת לסימני היישור שעל פני ההתקן. הגדירו מערכת הקרנת UV שתספק מנה של UV באורך גל של 365 nanometer בעוצמה של 17.5 milliwatt per square centimeter על פני ההתקן.

האיר את ההידרוג'ל דרך המסכה למשך 195 שניות לאחר ההארה. שטוף את תמיסת חומר המוצא של ההידרוג'ל שלא פולימרה באמצעות PBS והחלף את ה-PBS במצע תרבית; הפעל את מוטוני הטעינה כדי לדחוס את מבני ההידרוג'ל. כאן מוצג מכשיר דגימה הושלם לתרבית עם גירוי מכני דו-ממדי (2D).

צבע אדום משמש לסימון תעלות הולכת לחץ ההפעלה וצבע כחול משמש לסימון תעלות הסיכוך לאפיון מאמץ. ניתן להשתמש בניסויים כדי לקבוע שדות מאמץ מופעלים על ידי מעקב אחר תנועת חרוזי פלואורסצנציה על המצעים. נקודות אדומות מייצגות את המיקום המקורי של החרוזים בעוד שנקודות ירוקות מייצגות את המיקומים לאחר הדפורמציה.

ניתן לראות כאן התקן לדגימה עבור ניסויי דחיסה תלת-ממדיים, שבו נעשה שימוש בצבע ירוק לסימון ערוצי לחץ ההפעלה. מבט מלמעלה על מערך המיקרו-עמודים חושף את מבנה ההידרוג'ל המודפס על גב העמודים; תמונות שחזרו של חרוזי פלואורסצנציה במבנה ההידרוג'ל במצב מנוחה ותחת לחצי הפעלה של 55 kilo pascal מדגימות את תהליך אפיון המתיחה במערכת תרבית תלת-ממדית.

הראינו לכם כיצד לייצר התקנים המשמשים לגירוי מכני של תאים במערכות תרבית דו-ממדיות או תלת-ממדיות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ההתקנים נקיים ככל האפשר וללא אבק, ולהיות סבלניים, במיוחד במהלך שלבי הכיוונון. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.