Name: מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שבס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למדו להתאים ולטפח תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתרבית ללא תאי מאכלי באמצעות מדיום KSR-FF. שיטה זו מייעלת את העבודה ומבטיחה עקביות בתוצאות הגידול והשמירה על תכונות הגזעיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי. הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות הערה: ראה נספח לשימוש מנות CELLstart תרבות מצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ"ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ"ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון. הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ"ל למנה 35 מ"מ, 1.5 מ"ל למנה 60 מ"מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה). </li></ol> הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יסוד FGF </td><td> 10 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 50 מ"ל של תמיסת מ"ג / מ"ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 מ"ג </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 מ"ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 100 מ"ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בינוני בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> במלאי ריכוז </td><td> הריכוז הסופי </td><td> נפח </td></tr><tr><td> נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 מ"ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (קט 'מס' 35050-061) </td><td> 200 מ"מ </td><td> 2 מ"מ </td><td> 1 מ"ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 מ"ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 מ"ל </td></tr><tr><td> bFGF (לא קט. PHG0024) </td><td> 10 מיקרוגרם / מ"ל </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ"מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ"ל של מדיום KSR-FF להוסיף μL 182 מ"מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות עד שבוע. </li></ol> התאמת iPSCs ל KSR-FF בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, טרום לאזן מאכלים Geltrex שלך מצופה לטמפרטורת החדר בשכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות iPSCs על תאים MEF מזין עד שהם ומחוברות 70-80%. נא עיין בהוראות עכבר עובריים פיברובלסטים GIBCO MEF עבור פרוטוקולים מבוססי תרבות. </li> טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מן הכלים התרבות, להוסיף כמות מתאימה של פתרון Dispase. דגירה את הכלים על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון Dispase מספינת כל תרבות לשטוף את מזין תאים MEF בעדינות עם D-PBS (2 עד 3 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות המתאימה של המדיום בנוקאאוט להשלים SR לכלי כל תרבות. השתמש מגרד התא או פיפטה 5 מ"ל בעדינות כדי לגרד תאים מעל פני השטח של כלי התרבות. הערה: ראה נספח בפרוטוקולים הסתגלות חלופי להסתגל iPS קווי קשה התא, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא מצלחת כל תרבות לתוך 15 צינורות נפרדים חרוטי מ"ל. יש לשטוף את כל כלי תרבות עם כמות מתאימה של המדיום בנוקאאוט להשלים SR, ולהוסיף את D-PBS לשטוף בינוני לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל המכיל את ההשעיה התא. היזהר שלא לשבור את גושי תאים לתוך תאים בודדים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 15 צינורות חרוטי מ"ל ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה iPSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מן גלולה iPSC. Resuspend גלולה בסכום המתאים של המדיום KSR-FF על פי יחס הפיצול (טבלה 1). לא לשבור את גושי התאים לגודל קטן יותר, כי גושים קטנים לא לצרף גם אל פני השטח. הערה: אנו ממליצים על יחס של 1:02 לפצל את 3 הקטעים הראשונים לאחר iPSCs כבר passaged ישירות בינוני התרבות iPSC MEF עד בינוני KSR-FF. בדרך כלל, יחס לפצל 1:03-01:05 מתאים, אבל passaging בשעה 01:02 מבטיח את צפיפות גבוהה יותר של תאים הדרושים כאשר הסתגלות לתרבות מזין חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ציפוי iPSCs על מנות Geltrex מצופה, לשאוב שיורית פתרון Geltrex מצלחת מראש מצופה, ולאט לאט להוסיף כמות מתאימה של השעיה התא לצלחת כל תרבות. הערה: אין לשטוף כלים לפני ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את צלחת תרבות הלוך ושוב מצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח של המנה. בעדינות במקום צלחת תרבות 37 ° C חממה עם אווירה humidified של CO 4-6% 2 באוויר. החלף את המדיום בילה עם KSR-FF כל יום. </li></ol> Passaging iPS תאים אנושיים באמצעות KSR-FF <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב iPSCs האדם גדל להשלים KSR-FF תחת מיקרוסקופ כדי לאשר כי התאים הם 70-80% ומחוברות ומוכן להיות subcultured. עיין באיור 1. הערה: אם המושבות נעשים צפופים מדי או גדול מדי, בידול מוגברת מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור והסר מושבות iPSC הבדיל לפני passaging התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ"ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ"מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות "ריסוס את" כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קפיצי הצינור באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התאים מראש equilibrated KSR-FF בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות. אל triturate. הערה: זה הוא קריטי בשלב כדי resuspend בעדינות את התאים ללא שימוש בכוח כדי למנוע נזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים אל צלחת מתוקים Geltrex מצופה 60 מ"מ ביחס הפיצול הרצוי ולעבור את המנה תרבות הלוך ושוב מצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה עם אווירה של humidified4-6% CO 2 באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בעדינות להחליף את מדיום בילה עם KSR-FF להסיר פסולת התא. החלף את המדיום בילה יום לאחר מכן. שים לב בתאי iPS יומי המעבר אותם לפי הצורך (בערך כל 4-5 ימים). Passaging מומלץ כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80%. עבור cryopreservation תא השב"ס הפשרה, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת "Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני". </li></ol> תוצאות צפויות <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="תרבית תאים במיקרוסקופ; חקר צמיחת תאים; הדמיית מיקרוסקופיה; מחקר ביולוגי." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הניגוד שלב התמונה שלהלן מציגה iPSCs גדל על Geltrex מצופה מנות התרבות באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני. IPSCs התערוכה מורפולוגיה דומה ל hESCs, המאופיינת גרעינים גדולים הציטופלסמה דלים. (בהגדלה 40X) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> 35mm דיש </td><td> 60mm דיש </td><td> 100mm דיש </td></tr><tr valign="top"><td> השלם בנוקאאוט SR בינוני </td><td> 2 מ"ל </td><td> 4 מ"ל </td><td> 10 מ"ל </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex פתרון </td><td> 1 מ"ל </td><td> 1.5 מ"ל </td><td> 4-5 מ"ל </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0.5 מ"ל </td><td> 1 מ"ל </td><td> 3-4 מ"ל </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS עבור שטיפה </td><td> 2 מ"ל </td><td> 4 מ"ל </td><td> 10 מ"ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מומלץ כרכים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">אנא לחץ כאן כדי לראות את התוספתן</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי החיים טכנולוגיות המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>מס' קטלוג 12660-012</td><td>הערה: ראו את הנספח לשימוש במוצרי DMEM חלופיים</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>מס' קטלוג 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, מס' קטלוג 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, מס' קטלוג A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, חלבון רקומביננטי אנושי, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, מס' קטלוג PHG0024</td><td>הערה: ראו את הנספח לגדלי אריזה חלופיים של bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>מס' קטלוג 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>מס' קטלוג 17105-041</td><td>הערה: ראו את הנספח לשיטות מעבר חלופיות.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>מס' קטלוג A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) ללא סידן ומגנזיום</td><td></td><td>מס' קטלוג 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>מבת תרביות רקמה סטרילית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור המכוון ל-37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר עזר לפיפטה (Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקלחת מים המכוונת ל-37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה של 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרביות רקמה treated בגודל 60mm</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מזין ללא עיבוד, התרבות passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS 1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי. התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים 3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה. ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך בקלות מעבר תרבויות הירכיים שלך לתא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב&quot;ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

הגילוי בשנת 2006 כי ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים של בני אדם ועכברים כדי להפיק תאי iPS 1-3 בעלי תכונות הדומות באופן ניכר לתאי גזע עובריים...

המטרה הכללית של הליך זה היא להתאים ולשמר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם לתרבית ללא תאי מאכיל (feeder free) באמצעות מצע גידול ללא תאי מאכיל המכיל תחליף סרום knockout מלא. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת פלטות מצופות gelt, TRX או cell start. השלב השני של ההליך הוא מעבר של ה-IPS מתאי MEFs למצע ללא תאי מאכיל באמצעות שיטת הדיסקיות (disc space).השלב האחרון של הפרוצדורה הוא שמירה רציפה של תאי ה-IPS שלכם ללא תאי מאכיל (feeder free). בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות צמיחת תאים ותכונות של תאי גזע (stemness) הדומות לאלו שנמצאות בתרביות עם meth, באמצעות צביעה אימונו-היסטוכימית של סממנים פלוריפוטנטיים. שלום, אני קייט וגנר מהאתר GIB co ב-Life Technologies.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות הוא היכולת לחסוך בזמן ולהגביר את העקביות בתרבית התאים כאשר משתמשים בתחליף סרום knockout לאורך כל זרימת העבודה. כיום, משפחת מוצרי knockout כוללת רשימה מלאה של מצעים וריאגנטים לתנאים מבוססי-פיד (feeder based), נטולי-פיד (feeder free) ונטולי-קסנו (xeno free) עבור תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע עובריים של עכברים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. ניתן להשתמש ב-KSR לצורך גזירה, צמיחה, הרחבה, שימור בהקפאה והשלבים הראשוניים של דיפרנציאציה.הסרטון הבא ידגים את תהליך ההסגרה והאריזה של תאיכם באמצעות KSR בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder free). להסגרה ואריזה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים (hiPSCs) בתנאים ללא תאי מאכיל נדרשות צלחות תרבית מצופות GelTRX. יום אחד לפני הכנת הצלחות המצופות, הפשיר ゆっくり שפברון אחד של GelTRX על ידי השארתו במקרר למשך הלילה. למחרת, דלל את שפברון ה-GelTRX שהופשר ביחס של 1:100 במקלול בסיסי (basal medium), על ידי העברת 1 mL של GelTRX לבקבוק המכיל 99 mL של מקלול בסיסי. ערבב את התמיסה בעדינות.אנו ממליצים להשתמש ב-knockout D-M-E-M-F 12 כמצע בסיסי, אך אנא עיינו בטקסט של הפרוטוקול לאפשרויות אחרות. כסו את כל שטח הפנים של כל צלחת תרבית בתמיסת gel Rex. עבור כל צלחת של 60 מילימטר, הוסיפו 1.5 מיליליטר של תמיסת gel trek.דגרו את הצלחות למשך שעה אחת ב-37 °C. ניתן לעטוף צלחות נוספות ב-parfum ולאחסנן במקרר למשך עד ארבעה שבועות. ניתן להקצות TRX מדולל נוסף ולאחסנו ב-20- עד 80- °C, אך יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה מרובים לפני השימוש.העבירו את הצלחות המצופות ב-gelt TRX למבוף או למערכת זרימה למינרית (flow hood) והמתינו להשאתן לטמפרטורת החדר. בנוסף, הכינו את כל שאר הרכיבים הנדרשים וודאו שכל מצעי הגדילה הגיעו לטמפרטורה של 37 °C והועשרו בגזים באופן המתאים. לצורך התאמת IPCs אנושיים למצע ללא תאי מאכל (feeder free), בצעו תחילה תרבית ראשונה.תאי ה-IPSC גדלים על תאי מזין (feeder cells) מסוג meth עד להגעה ל-70 עד 80% התלכדות (confluency). שאבו את המצע מכל צלחת תרבית של 60 מילימטר והוסיפו כמות מתאימה של תמיסת dispa, שהיא 1 מיליליטר. במקרה זה, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.שאבו את תמיסת ה-dispa מכל צלחת תרבית ושטפו בעדינות את תאי המזין (feeder cells) מסוג meth באמצעות DPBS פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הוסיפו כמות מתאימה של מצע החלפת סרום מלא (complete serum replacement medium) לכל צלחת תרבית. בעזרת גורד תאים (cell scraper), גרדו בעדינות את התאים מפני השטח של הצלחת.אספו את תרחיף התאים מכל צלחית לשפרונות קוניים נפרדים של 15 מיליליטר. שטפו כל צלחית תרבית בכמות מתאימה של מצע החלפת סרום מלא והוסיפו את מצע השטיפה לשפרונות הקוניים של 15 מיליליטר המכילים את תרחיף התאים. סובבו את השפרונות הקוניים של 15 מיליליטר ב-200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את התאים.לאחר סבוב במערך הצנטריפוגה, שאיב בעדינות והשלך את העילאי (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים. נער את המבחנה בטלטול עדין כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהתחתית. הוסף כמות מתאימה של תחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכיל (feeder free medium), בהתאם ליחס הפיצול הרצוי.שחזר בעדינות את המשקע. אין לפרק את גושי התאים לגודל קטן יותר, מכיוון שגושים קטנים אינם נצמדים היטב לפני השטח. שאב כל תמיסת gel TRE שנותרה מתוך צלחות התרבית המצופות ב-gel Rex שהוכנו מראש, והוסף לאט כמות מתאימה של תרחיף תאים לכל צלחת תרבית.הניעו את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני שטח הצלחת. הניחו בעדינות את צלחות התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אטמוספירה לחה של 4% עד 6% CO2 באוויר. החליפו את המצע השגור מדי יום לאחר מכן, עד שהתאים יגיעו לכ- 70% עד 80% confluence.כאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושגים מאדם, הגדלים במצע ללא תאי מאכיל (feeder free) עם תחליף סרום מלא, מגיעים ל-70 עד 80% התלכדות (confluent), הם מוכנים לתתי-תרבית. אם קיימים תאים מובחנים, יש להסירם לפני המעבר. שאבו את המצע המשומש מצלחת התרבית בגודל 60 מילימטר באמצעות פיפטה ושטפו את התאים פעמיים.בעזרת DPBS, הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של תמיסת דיסק המחוממת מראש לצלחת התרבית. סובבו את צלחת התרבית כדי לצפות את כל פני השטח של התאים. הדגירו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות.בשלב הבא, שאבו את תמינת ה-dis space ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS, הוסיפו תחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכיל (feeder free medium), וגרדו בעדינות את התאים מפני השטח של צלחת התרבית. בעזרת גורד תאים, העבירו את התאים לפרוכת צנטריפוגה סטרילית של 15 מיליליטר. שטפו את צלחת התרבית פעמיים עם תחליף סרום מלא.הסpray עדין של מצע ללא תאי מאכל (Feeder free medium) להסרת תאים שלא ניתקו. שאבו את המצע משני השטיפות יחד עם התאים אל תוך מבחנה של 15 מיליליטר. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את התאים מבלי להפריע למשקע התאים.שאבו בזהירות והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). נערו קלות את המבחנה כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהקרקעית. השביו בעדינות את התאים בתוך תחליף סרום מלא.העבירו את המצע ללא תאי מאכילה (Feeder free medium) באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר. אין לבצע טיטרציה. העבירו את התאים לצלח גלטtrx (gelt TRX) מצופה חדש בקוטר 60 מילימטר ביחס הפיצול הרצוי.הנע את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח שלה. מקם את צלחת התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אטמוספירה רטובה של 4% עד 6% carbon dioxide באוויר. למחרת, החלף בעדינות את המצע המשומש במצע החלפה של סרום מלא.הזנה של מצע נקי להסרת שאריות תאים. יש להחליף את המצע המרוקן מדי יום לאחר מכן. תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) זו מראה תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם שגודלו בצלחות תרבית מצופות gelt TRX תוך שימוש במחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכל (feeder free medium).המורפולוגיה של תאי ה-IPC דומה לזו של תאי גזע עובריים אנושיים, והיא מאופיינת בגרעינים גדולים ובציטופלזמה דלה. צביעה אימונוהיסטוכימית מראה כי תאי IPC שגודלו במצע knockout serum replacement בתוספת תערובת גורמי גדילה, ביטאו את הסמנים הפלוריפוטנטיים OCT four ו-SSEA four. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ההסתגלות והתחזוקה של תאי ה-IPC שלכם בתנאי knockout serum replacement ללא תאי מאכילה (feeder free). וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

feeder-free-adaptation-culture-passaging-human-ips-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

יש תאי רכס עצבי (NC) שמקורם בתאים אנושיים גזע pluripotent (hPSC) פוטנציאל גדול לפיתוח מודלים ומחלות של בני אדם ועבור טיפולי החלפת תא. הנה, הסתגלות מזין ללא ממשמש כיום באופן...

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

אפיון קבוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כדי לוודא שמירה על מצבם הפלוריפוטנטי, הוא צעד חשוב לפני שתאים אלה משמשים ליישומים אחרים. כאן אנו מתארים שיטה להתפשטות בקנה מידה קטן של iPSCs אנושיים שתוכננה במיוחד כדי לאפשר אפיון קל ושגרתי שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

כדי להימנע מהמגבלות הקשורות למעבר אנזימטי או מכני של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בתרבית על תאי הזנה, ביססנו שיטה מהירה, יעילה, חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לקצירת מושבות hESC או hiPSC המתוחזקות על שכבת תאי הזנה של פיברובלסטים אנושיים של עורלה באמצעות דיס-הדבקה בתיווך EDTA.

העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

כאן, אנו מציגים שיטה להבדיל ולהרחיב תאי הרג טבעיים המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) אנושי שמקורו ב-iPSC עם הרג משופר כנגד ממאירויות שונות. פרוטוקול זה מדגים את ההתמיינות וההרחבה של תאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC אופטימליים של הרג טבעי (NK) ומדידת פעילות אנטי-גידולית כנגד קווי תאי גידול שונים.

התקדמות בתאי הרג טבעיים המבטאים קולטני אנטיגן כימריים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למדו להתאים ולטפח תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתרבית ללא תאי מאכלי באמצעות מדיום KSR-FF. שיטה זו מייעלת את העבודה ומבטיחה עקביות בתוצאות הגידול והשמירה על תכונות הגזעיות.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב"ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

גלה סרטונים נוספים