מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב"ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

המטרה הכללית של הליך זה היא להתאים ולשמר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם לתרבית ללא תאי מאכיל (feeder free) באמצעות מצע גידול ללא תאי מאכיל המכיל תחליף סרום knockout מלא. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת פלטות מצופות gelt, TRX או cell start. השלב השני של ההליך הוא מעבר של ה-IPS מתאי MEFs למצע ללא תאי מאכיל באמצעות שיטת הדיסקיות (disc space).

השלב האחרון של הפרוצדורה הוא שמירה רציפה של תאי ה-IPS שלכם ללא תאי מאכיל (feeder free). בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות צמיחת תאים ותכונות של תאי גזע (stemness) הדומות לאלו שנמצאות בתרביות עם meth, באמצעות צביעה אימונו-היסטוכימית של סממנים פלוריפוטנטיים. שלום, אני קייט וגנר מהאתר GIB co ב-Life Technologies.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות הוא היכולת לחסוך בזמן ולהגביר את העקביות בתרבית התאים כאשר משתמשים בתחליף סרום knockout לאורך כל זרימת העבודה. כיום, משפחת מוצרי knockout כוללת רשימה מלאה של מצעים וריאגנטים לתנאים מבוססי-פיד (feeder based), נטולי-פיד (feeder free) ונטולי-קסנו (xeno free) עבור תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע עובריים של עכברים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. ניתן להשתמש ב-KSR לצורך גזירה, צמיחה, הרחבה, שימור בהקפאה והשלבים הראשוניים של דיפרנציאציה.

הסרטון הבא ידגים את תהליך ההסגרה והאריזה של תאיכם באמצעות KSR בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder free). להסגרה ואריזה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים (hiPSCs) בתנאים ללא תאי מאכיל נדרשות צלחות תרבית מצופות GelTRX. יום אחד לפני הכנת הצלחות המצופות, הפשיר ゆっくり שפברון אחד של GelTRX על ידי השארתו במקרר למשך הלילה. למחרת, דלל את שפברון ה-GelTRX שהופשר ביחס של 1:100 במקלול בסיסי (basal medium), על ידי העברת 1 mL של GelTRX לבקבוק המכיל 99 mL של מקלול בסיסי. ערבב את התמיסה בעדינות.

אנו ממליצים להשתמש ב-knockout D-M-E-M-F 12 כמצע בסיסי, אך אנא עיינו בטקסט של הפרוטוקול לאפשרויות אחרות. כסו את כל שטח הפנים של כל צלחת תרבית בתמיסת gel Rex. עבור כל צלחת של 60 מילימטר, הוסיפו 1.5 מיליליטר של תמיסת gel trek.

דגרו את הצלחות למשך שעה אחת ב-37 °C. ניתן לעטוף צלחות נוספות ב-parfum ולאחסנן במקרר למשך עד ארבעה שבועות. ניתן להקצות TRX מדולל נוסף ולאחסנו ב-20- עד 80- °C, אך יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה מרובים לפני השימוש.

העבירו את הצלחות המצופות ב-gelt TRX למבוף או למערכת זרימה למינרית (flow hood) והמתינו להשאתן לטמפרטורת החדר. בנוסף, הכינו את כל שאר הרכיבים הנדרשים וודאו שכל מצעי הגדילה הגיעו לטמפרטורה של 37 °C והועשרו בגזים באופן המתאים. לצורך התאמת IPCs אנושיים למצע ללא תאי מאכל (feeder free), בצעו תחילה תרבית ראשונה.

תאי ה-IPSC גדלים על תאי מזין (feeder cells) מסוג meth עד להגעה ל-70 עד 80% התלכדות (confluency). שאבו את המצע מכל צלחת תרבית של 60 מילימטר והוסיפו כמות מתאימה של תמיסת dispa, שהיא 1 מיליליטר. במקרה זה, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.

שאבו את תמיסת ה-dispa מכל צלחת תרבית ושטפו בעדינות את תאי המזין (feeder cells) מסוג meth באמצעות DPBS פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הוסיפו כמות מתאימה של מצע החלפת סרום מלא (complete serum replacement medium) לכל צלחת תרבית. בעזרת גורד תאים (cell scraper), גרדו בעדינות את התאים מפני השטח של הצלחת.

אספו את תרחיף התאים מכל צלחית לשפרונות קוניים נפרדים של 15 מיליליטר. שטפו כל צלחית תרבית בכמות מתאימה של מצע החלפת סרום מלא והוסיפו את מצע השטיפה לשפרונות הקוניים של 15 מיליליטר המכילים את תרחיף התאים. סובבו את השפרונות הקוניים של 15 מיליליטר ב-200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את התאים.

לאחר סבוב במערך הצנטריפוגה, שאיב בעדינות והשלך את העילאי (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים. נער את המבחנה בטלטול עדין כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהתחתית. הוסף כמות מתאימה של תחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכיל (feeder free medium), בהתאם ליחס הפיצול הרצוי.

שחזר בעדינות את המשקע. אין לפרק את גושי התאים לגודל קטן יותר, מכיוון שגושים קטנים אינם נצמדים היטב לפני השטח. שאב כל תמיסת gel TRE שנותרה מתוך צלחות התרבית המצופות ב-gel Rex שהוכנו מראש, והוסף לאט כמות מתאימה של תרחיף תאים לכל צלחת תרבית.

הניעו את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני שטח הצלחת. הניחו בעדינות את צלחות התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אטמוספירה לחה של 4% עד 6% CO2 באוויר. החליפו את המצע השגור מדי יום לאחר מכן, עד שהתאים יגיעו לכ- 70% עד 80% confluence.

כאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושגים מאדם, הגדלים במצע ללא תאי מאכיל (feeder free) עם תחליף סרום מלא, מגיעים ל-70 עד 80% התלכדות (confluent), הם מוכנים לתתי-תרבית. אם קיימים תאים מובחנים, יש להסירם לפני המעבר. שאבו את המצע המשומש מצלחת התרבית בגודל 60 מילימטר באמצעות פיפטה ושטפו את התאים פעמיים.

בעזרת DPBS, הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של תמיסת דיסק המחוממת מראש לצלחת התרבית. סובבו את צלחת התרבית כדי לצפות את כל פני השטח של התאים. הדגירו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות.

בשלב הבא, שאבו את תמינת ה-dis space ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS, הוסיפו תחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכיל (feeder free medium), וגרדו בעדינות את התאים מפני השטח של צלחת התרבית. בעזרת גורד תאים, העבירו את התאים לפרוכת צנטריפוגה סטרילית של 15 מיליליטר. שטפו את צלחת התרבית פעמיים עם תחליף סרום מלא.

הסpray עדין של מצע ללא תאי מאכל (Feeder free medium) להסרת תאים שלא ניתקו. שאבו את המצע משני השטיפות יחד עם התאים אל תוך מבחנה של 15 מיליליטר. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את התאים מבלי להפריע למשקע התאים.

שאבו בזהירות והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). נערו קלות את המבחנה כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהקרקעית. השביו בעדינות את התאים בתוך תחליף סרום מלא.

העבירו את המצע ללא תאי מאכילה (Feeder free medium) באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר. אין לבצע טיטרציה. העבירו את התאים לצלח גלטtrx (gelt TRX) מצופה חדש בקוטר 60 מילימטר ביחס הפיצול הרצוי.

הנע את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח שלה. מקם את צלחת התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אטמוספירה רטובה של 4% עד 6% carbon dioxide באוויר. למחרת, החלף בעדינות את המצע המשומש במצע החלפה של סרום מלא.

הזנה של מצע נקי להסרת שאריות תאים. יש להחליף את המצע המרוקן מדי יום לאחר מכן. תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) זו מראה תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם שגודלו בצלחות תרבית מצופות gelt TRX תוך שימוש במחליף סרום מלא, מצע ללא תאי מאכל (feeder free medium).

המורפולוגיה של תאי ה-IPC דומה לזו של תאי גזע עובריים אנושיים, והיא מאופיינת בגרעינים גדולים ובציטופלזמה דלה. צביעה אימונוהיסטוכימית מראה כי תאי IPC שגודלו במצע knockout serum replacement בתוספת תערובת גורמי גדילה, ביטאו את הסמנים הפלוריפוטנטיים OCT four ו-SSEA four. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ההסתגלות והתחזוקה של תאי ה-IPC שלכם בתנאי knockout serum replacement ללא תאי מאכילה (feeder free). וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.