Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני
15 ביולי 2010
פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.
המטרה הכוללת של הליך זה היא שימור בהקפאה ושחזור תאי IPS בתנאי תרבית מבוססי מזין או ללא מזין. זה מושג על ידי התחלת אריזת ה-IPC שלך כרגיל. השלב השני של ההליך הוא העברת התאים למדיום הקפאה חופשי מסרום.
השלב השלישי של ההליך הוא שימור בהקפאה כרגיל. השלב האחרון של ההליך הוא הפשרת התאים והתחלת תחזוקה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הקפאה והפשרה מוצלחת של תאי IPS במדיום הקפאה חופשי בסרום באמצעות מורפולוגיה בריאה והתאוששות לאחר ההפשרה.
היי, אני קייט וגנר באתר ה-GCO ב-Life Technologies. הדגמה ויזואלית של פרוטוקול זה היא קריטית מכיוון ש-IPCs יכולים להיות רגישים מאוד להקפאה ו-T בסדר. מה שמקל על פרוטוקול זה הוא שניתן להשתמש בהחלפת סרום נוקאאוט לאורך כל זרימת העבודה שלך.
כיום, משפחת המוצרים של KSR כוללת רשימה מלאה של מדיה וריאגנטים לתרבית נטולת הזנה ונטולת קסנו של תאי גזע עובריים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. ניתן להשתמש ב-KSR לצמיחת נגזרות, שימור בהקפאה, הרחבה והשלבים הראשונים של בידול. הסרטון הבא יראה לכם להפשיר ולהקפיא את עצמכם באמצעות KSR במכונה ללא פיטר.
כדי להתחיל בהליך זה. ראשית לחמם בכמות מתאימה של מזין שלם ללא מדיום עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים שואבים מדיום מבוזבז מכלי התרבות, שהוא צלחת של 60 מילימטר. במקרה זה, שטפו את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם פעמיים עם DPBS.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של דיספה לתבשיל. דגרו את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הדיספה ושטפו בעדינות את התאים עם DPBS.
לאחר מכן, הוסף מדיום שלם ללא מזין כדי לכסות את הכלי והשתמש במגרד תאים כדי לגרד בעדינות את התאים להעביר תאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. שוטפים את הכלי בהזנה מלאה של מדיום חופשי, מרססים בעדינות את כל התאים שלא התנתקו. העבירו את תמיסת השטיפה לאותו צינור של 15 מיליליטר המכיל את התאים.
שטפו את המנה פעם שנייה עם מדיום ומשכו את תמיסת השטיפה עם תאי הכדור של התאים על ידי צנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. החלק בעדינות את הצינור כדי לעקור את כדור התא במלואו מתחתית הצינור.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיום הקפאה A, באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, והשהה מחדש את התאים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. לאחר השעיה אחידה של גושים, הוסף מיליליטר אחד של מדיום הקפאה B לצינור בצורה טיפתית תוך כדי סיבוב עדין של תרחיף התא לערבוב. הקצו מיליליטר אחד של תרחיף תאים לכל תאי הקפאה קריו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא איזופרופנול.
למחרת, העבירו את בקבוקוני התאים למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך. הפשירו במהירות את בקבוקון התאים הקפוא על ידי הנחתו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך כשלוש עד ארבע דקות עד שנשאר רק גוש קפוא קטן בבקבוקון. לאחר הוצאת הבקבוקון מתרסיס אמבט המים עם 70% איזופרופנול כדי לטהר אותו, השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להעביר באופן אספטי את כל תכולת הבקבוקון לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
השלב הבא עשוי להיות ההיבט הקשה ביותר של ההליך. יש להוסיף את המדיום נטול המזין לאט ובזהירות לתאים. כדי להפחית זעזועים אוסמוטיים הוסף לאט ארבעה מיליליטר של מדיום שלם ללא מזין טיפה לתאים בצינור החרוטי של 15 מיליליטר.
תוך כדי הוספת המדיום הזיזו בעדינות את הצינור קדימה ואחורה כדי לערבב את התאים. זה יפחית את ההלם האוסמוטי לתאים. ניתן להחליף את המדיום המלא ללא מזין בהחלפת סרום נוקאאוט המכיל מדיום מותאם מת' או מדיום החלפת סרום נוקאאוט לשימוש עם מזינים, עיין בטקסט הפרוטוקול להוראות הכנת מדיה.
לאחר הוספת כל ארבעת המיליליטרים של המדיום, צנטריפוגה את התאים ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוב בזהירות ולהשליך את השפוי מבלי להפריע לכדור התא. השעו בעדינות את כדור התא בארבעה מיליליטר של מדיום שלם ללא מזין.
בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, הוסף בעדינות את מתלה התא בכיוון טיפתי לצלחת תרבית מצופה 60 מילימטר של משאיות ג'לט. מניחים את צלחת התרבות בחממה של 36 עד 38 מעלות צלזיוס עם אווירה לחה של ארבעה עד 6% פחמן דו חמצני באוויר. סובבו בזהירות את המנה בתבנית מצפון לדרום, ממזרח למערב כדי לפזר את התאים באופן שווה.
24 שעות לאחר ההפשרה. החלף את המדיום במנה במדיום טרי. החלף את המדיום המושקע מדי יום לאחר מכן עד שהתאים הופכים לכ-70 עד 80% מתלכדים.
תמונת ניגודיות זו מציגה תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים הגדלים על צלחות תרבית מצופות ג'ל TRX תוך שימוש בתחליף סרום מלא, מדיום ללא מזין. ה-IPC מציגים מורפולוגיה הדומה לתאי גזע עובריים אנושיים המאופיינים בגרעינים גדולים וציטופלזמה דלה. דוגמה לתאים לאחר הפשרה והחלפת סרום נוק-אאוט.
מדיום נטול מזין על ג'לט TrackX מוצג כאן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל מושבות התאים שלך באותו גודל. כאשר שימור קריו זה משפר את התאוששות התאים.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הנוהל לשימור קריופרזרבציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושרים (iPS) באמצעות מדיום שימור קריופרזרבציה KnockOut SR ושיקוםם באמצעות מדיום KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) מלא או מדיום KnockOut SR מבוסס פידר. השיטה מדגישה את החשיבות של הדגמה ויזואלית בשל הרגישות של תאי iPS במהלך הקפאה והפשרה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מחקר תאי גזע
- טכניקות שימור קריופרזרבציה
רקע
- תאי iPS אנושיים רגישים לתהליכי הקפאה והפשרה.
- מוצרי KnockOut SR מאפשרים שלבים שונים של תרבית תאי גזע.
- שימור קריופרזרבציה נכון הוא קריטי לשמירה על חיוניות התאים.
- ניתן להשתמש בתנאי תרבית ללא פידר ובתנאי תרבית מבוססי פידר עבור תאי iPS.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול אמין לשימור קריופרזרבציה של תאי iPS.
- לוודא שיקום מוצלח של תאים לאחר הפשרה.
- להדגים את השימוש במוצרי KSR לאורך כל זרימת העבודה.
שיטות בשימוש
- הכנת תאי iPS לשימור קריופרזרבציה.
- שימוש במדיום הקפאה ללא סרום לשימור תאים.
- שימור קריופרזרבציה ב- -80 מעלות צלזיוס ואחסון בחנקן נוזלי.
- הפשרה ושחרור תאים מחדש במדיום מלא ללא פידר.
תוצאות עיקריות
- הקפאה והפשרה מוצלחת של תאי iPS שהוכחה על ידי מורפולוגיה בריאה.
- תאים שמרו על חיוניות וצמיחה בשני תנאי תרבית ללא פידר ובתנאי תרבית מבוססי פידר.
- יעילות הפרוטוקול אושרה באמצעות הערכה ויזואלית של התאוששות התאים.
- שמירה על גודל אחיד של מושבות התאים שיפרה את שיעורי ההתאוששות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה שיטתית לשימור קריופרזרבציה של תאי iPS.
- מוצרי KnockOut SR יעילים לשמירה על בריאות התאים במהלך התהליך.
- הדגמות ויזואליות משפרות את ההבנה והביצוע של הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
