Name: Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למד שיטה להקפאה ושחזור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות תמיסת KnockOut SR ללא סרום. הפרוטוקול מדגים שימור חיות התאים לאחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי. הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות הערה: ראה נספח לשימוש CELLstart מנות תרבות מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ&quot;ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ&quot;ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון. הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ&quot;ל למנה 35 מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;ל למנה 60 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה). </li></ol> הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 מ&quot;ל של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יסוד FGF </td><td> 10 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 50 מ&quot;ל של תמיסת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 100 מ&quot;ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> במלאי ריכוז </td><td> הריכוז הסופי </td><td> נפח </td></tr><tr><td> נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (קט &#39;מס&#39; 35050-061) </td><td> 200 מ&quot;מ </td><td> 2 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> bFGF (לא קט. PHG0024). </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ&quot;ל של KSR-Fבינוני F להוסיף μL 182 מ&quot;מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. </li></ol> הכנת הקפאה / cryopreservation בינוני בינוני cryopreservation מורכב משני התקשורת; בינוני מקפיא A ו-B בינוני הקפאת הם הוסיפו לתאים בזמנים שונים חייבים להישאר מופרדים. הם כל אחד 50% מהנפח הכולל של בינונית cryopreservation הצורך. סך היקף בינוני cryopreservation שצריך הוא 1 מ&quot;ל על כל בקבוקון להיות קפוא. צלחת 90% 60mm ומחוברות של hESC יכול לשמש לבנק 2 בקבוקונים של hESC בתקשורת cryopreservation. הכן נפח מספיק בינונית כל הקפאה עם תוספת 2-5 מ&quot;ל כדי להבטיח overage. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (50% של נפח סופי): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (50% של נפח סופי): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> דוגמה: אם אתה מקפיא 20 בקבוקונים של תאים, תצטרך 20mL של cryopreservation בינוני. הוסף 4mL עבור overage עבור סכום כולל של בינונית cryopreservation 24mL. כלומר, תצטרך 12mL של הקפאת בינוני (50% 24mL) ו 12mL של B בינוני הקפאה (50% 24mL). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (12 מ&quot;ל): </td><td> 6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 6 מ&quot;ל KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (12 מ&quot;ל): </td><td> 9.6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 2.4 מ&quot;ל DMSO </td></tr></tbody></table> ההרכב הסופי של המדיום cryopreservation הוא 65% DMEM/F12, KSR 25% ו 10% DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק &#39;for15 ° C אמבט מים. עיין 1below טבלה לקבל פרטים על אמצעי האחסון הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ&quot;ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות &quot;ריסוס את&quot; כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כמות מספקת של cryovials. ברגע שהתאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפיצי בעדינות את הצינור, באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור מחדש להשעות את התאים א בינוני מקפיא [על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות 5 מ&quot;ל סרולוגיות פיפטה]. בעקבות השעיה אחיד של גושים, מוסיפים נפח שווה של B בינוני מקפיא אליו, בצורה טיפה חכם, בעוד בעדינות מתערבל ההשעיה תא לערבב. הערה: בשלב זה, התאים נמצאים בקשר עם DMSO, עבודה חייב להתבצע ביעילות. לאחר התאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של השעיה על התא cryovial כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום בקבוקונים ב פרוסטי מר [במהירות להקפיא] ולהעביר אותו -80 מעלות למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אחסון ולינה -80 ° C, להעביר את התאים מיכל חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך. </li></ol> iPSC להפשיר בקבוקון והתאוששות תא הערה: KSR-FF עשוי להיות מוחלף עם המדיום MEF ממוזג KSR המכילים, או בינוני KSR לשימוש עם המאכיל. ראו נספח הוראות להכנת אמצעי התקשורת. טרום חמים 10 מ&quot;ל של מדיום KSR-FF בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הכמות המתאימה של Geltrex מצופה הכלים בטמפרטורת החדר לשאוב כל נוזל הכלים לפני ציפוי אותךr תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את hESC (או iPSC) בקבוקון מטנק חנקן נוזלי אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון קפוא להפשיר במהירות של תאים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים, רק עד נתח קפוא קטן נשאר הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס בקבוקון עם 70% isopropanol כדי לטהר אותו ולהעביר אותו את מכסה המנוע רקמה סטרילית תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את כל תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבקבוקון עם 1 מ&quot;ל של KSR-FF ולהוסיף את זה צינור 15 צנטריפוגות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט, להוסיף 4 מ&quot;ל של KSR-FF נפתח חכם התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. בעוד הוספת בינוני, בעדינות להזיז את הצינור הלוך ושוב לערבב את התאים. (פעולה זו מפחיתה את הלם אוסמוטי על התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 15 מ&quot;ל עם ההשעיה התא 1000rpm (200 x ז) ​​למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התא גלולה מראש חימם KSR-FF (למשל 4mL/60 צלחת מ&quot;מ) בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה עד התא גלולה מפוזרת באופן מלא. הכדאיות של יותר מ 70% צפויה, אולם אם הכדאיות הוא פחות מ -70%, זה עלול לקחת זמן רב יותר עבור התאים להגיע למפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה אותו, להעביר את ההשעיה תא נפתח חכם צלחת Geltrex מצופה תרבות טרום equilibrated לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה, עם אווירה humidified של CO 4-6% 2 באוויר. בזהירות מערבולת כלי בצפון לדרום, ממזרח למערב דפוס כדי לפזר באופן שווה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות נוזל לשנות את המנה תרבות 24 שעות לאחר ההפשרה ואת יום לאחר מכן להסיר את פסולת התא כדי לספק מזון טרי עד המנה הוא כ 70-80% ומחוברות. עבור התרבות המשך passaging של תאים iPS שלך, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת &quot;מזין ללא התרבות Passaging של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני&quot; </li></ol> תוצאות צפויות התאים צריכים להיות בערך 70-80% ומחוברות לפני cryopreservation. Dispase תוצאות עיכול להתכרבל מתקפלים המושבות בשולי המושבה. לאחר קצירת התאים הם קפואים כמו גושים קטנים בתקשורת cryopreservation. לאחר הבקבוקון הוא מופשר, תאים להתאושש לצרף צלחת מצופה מראש כמו גושים קטנים. הם גדלים במהירות המוביל צלחת ומחוברות בתוך 5-6 ימים. לוח 1 - כרכים מומלצים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> 35mm דיש </td><td> 60mm דיש </td><td> 100mm דיש </td></tr><tr><td> השלם בנוקאאוט SR בינוני </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Geltrex פתרון </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td><td> 4-5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 3-4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> D-PBS עבור שטיפה </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">לחץ כאן כדי לראות את התוספתן</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי החיים טכנולוגיות המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>הערה: ראו את הנספח לשימוש במוצרי DMEM חלופיים GlutaMAX-I (מס' קטלוג 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, חלבון רקומביננטי אנושי, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>הערה: ראו את הנספח לגבי גדלי אריזות חלופיים של bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>הערה: ראו את הנספח לשיטות מעבר תאים חלופיות</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) ללא סידן ומגנזיום</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>מנדף סטרילי לתרבית רקמות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור המכוון ל-37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים המכוון ל-37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה של 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות של 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל אחסון חנקן נוזלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכלי הקפאה של Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials של 1.5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving ו שחזור של תאים ips האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS 1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי. התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים 3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה. ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך מעבר בקלות הירכיים ותרבויות הס תא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

הגילוי בשנת 2006 כי ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים של בני אדם ועכברים כדי לייצר תאי iPS 1-3 עם תכונות דומות להפליא לתאי גזע עובריים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא שימור בהקפאה (cryopreservation) והשבה של תאי IPS בתנאי תרבית מבוססי תאי מאכיל (feeder) או ללא תאי מאכיל. דבר זה מושג תחילה על ידי אריזה של תאי ה-IPC כפי שנעשה בדרך כלל. השלב השני של הפרוצדורה הוא העברת התאים לתווך הקפאה נטול סרום.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע הקפאה בשיטת cryopreserve כפי שאתם רגילים לעשות. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הפשרת התאים ותחילת התחזוקה שלהם. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הקפאה והפשרה מוצלחות של תאי IPS במדיום הקפאה נטול סרום, כפי שבא לידי ביטוי במורפולוגיה בריאה ובהתאוששות לאחר ההפשרה.שלום, אני קייט ואגנר מאתר GCO ב-Life Technologies. הדגמה ויזואלית של פרוטוקול זה היא קריטית מכיוון ש-IPCs יכולים להיות רגישים מאוד להקפאה ולטמפרטורה. מה שהופך את הפרוטוקול הזה לקל יותר הוא שניתן להשתמש בתחליף סרום knockout לאורך כל תהליך העבודה.כיום משפחת מוצרי KSR כוללת רשימה מלאה של מצעים וריאגנטים לתרבית של תאי גזע עובריים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, המבוססת על תאי מאכיל (feeder), נטולת תאי מאכיל (feed free) ונטולת רכיבים מהחי (xeno free). ניתן להשתמש ב-KSR לצורך בידוד, גידול, שימור בהקפאה, הרחבה והשלבים הראשוניים של דיפרנציאציה. הסרטון הבא יציג בפניכם את תהליכי ההפשרה וההקפאה של תאים באמצעות KSR במערכת נטולת תאי מאכיל.כדי להתחיל בהליך זה, תחילה יש לחמם כמות מתאימה של מצע הזנה מלא ללא תאי מאכיל (complete feeder free medium) ל-37 °C באמבט מים, לשאוב את המצע המשומש מכלי התרבית, שהוא צלחת של 60 מילימטר, ובמקרה זה, לשטוף את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים של בני אדם פעמיים עם DPBS.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של dispa לצלחית. הדגירו את הצלחית בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאבו את תמיסת ה-dispa ושטפו בעדינות את התאים באמצעות DPBS.בשלב הבא, הוסיפו מצע ללא תאי מאכילה (feeder free medium) מלא כדי לכסות את הצלחת, והשתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי לגרד בעדינות את התאים ולהעבירם למבחנת צנטריפוגה סטרילית בנפח 15 milliliter. שטפו את הצלחת עם מצע ללא תאי מאכילה מלא, תוך התזה עדינה כדי להסיר תאים שטרם ניתקו. העבירו את תמיסת השטיפה לאותה מבחנת 15 milliliter המכילה את התאים.שטפו את הצלחת פעם שנייה עם מצע גידול ושאיפו את תמיסת השטיפה עם התאים; השקיעו את התאים על ידי סבוב ב-1000 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות והשליכו את העלייה (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים. נקו בעדינות את המבחנה כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהתחתית.לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תווך הקפאה A, באמצעות פיפט סרולוגית של 5 mL, ושחזרו את התאים על ידי שאיבה והזרקה עדינה (pipetting). לאחר קבלת סספנסיה אחידה של הגושים, הוסיפו למבחנה 1 mL של תווך הקפאה B באופן טיפתי, תוך כדי סיבוב עדין של סספנסיית התאים לערבוב. העבירו 1 mL של סספנסיית תאים לכל מבחנה לקריו (cryovial), והקפיאו את התאים בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה בתוך תא איזופרופנול.ביום למחרת, העבירו את מבחנות התאים למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הפשירו במהירות את מבחנת התאים הקפואה על ידי הנחתה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך כשלוש עד ארבע דקות, עד שיישאר במבחנה רק גוש קפוא קטן. לאחר הוצאת המבחנה מאמבט המים, רססו אותה ב-70%isopropanol לצורך דה-קונטמינציה, ולאחר מכן השתמשו בפיפט של 5 ml כדי להעביר באופן אספטי את כל תכולת המבחנה לשפופרת קונית של 15 ml.השלב הבא עשוי להיות ההיבט המורכב ביותר של הפרוצדורה. יש להוסיף את המצע נטול התאיים המזינים (feeder free medium) לתאים באיטיות ובזהירות. כדי להפחית שוק אוסמוטי, הוסיפו באיטיות ארבעה מיליליטר של מצע נטול תאיים מזינים מלא בטפטוף לתאים בתוך המבחנה הקונית בנפח 15 מיליליטר.בעת הוספת המצע, הניעו בעדינות את המבחנה קדימה ואחורה כדי לערבב את התאים. פעולה זו תפחית את ההלם האוסמוטי עבור התאים. ניתן להחליף את ה-Complete feeder free medium ב-knockout serum replacement המכיל meth conditioned medium או ב-knockout serum replacement medium לשימוש עם feeders; עיינו בטקסט הפרוטוקול להוראות להכנת המצעים.לאחר הוספת כל ארבעת המיליליטרים של המצע, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, שאב בזהירות והשלך את הנוזל ללא הפרעה למשקע התאים. השהה בעדינות את משקע התאים בארבעה מיליליטרים של מצע מלא ללא תאי מאכילה (feeder free medium).באמצעות פיפט של 5 mL, הוסיפו בעדינות את תרחיף התאים בטפטוף לצלוחית תרבית של 60 mm המצופה ב-gelt trucks. הניחו את צלוחית התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 36 עד 38 °C עם אטמוספירה מלחית של 4% עד 6% carbon dioxide באוויר. סובבו בעדינות את הצלוחית בתנועות מצפון לדרום וממזרח למערב כדי לפזר את התאים באופן שווה.24 שעות לאחר ההפשרה. החלף את המצע בצלחת במצע טרי. החלף את המצע המשומש מדי יום לאחר מכן עד שהתאים יגיעו למסף של כ-70 עד 80% confluence.תמונת ניגודיות זו מציגה תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים שגודלו בצלחות תרבית מצופות gelt TRX תוך שימוש בתחליף סרום מלא, במצע ללא תאי מאכיל (feeder free). ה-iPSCs מראים מורפולוגיה דומה לתאי גזע עובריים אנושיים, המאופיינת בגרעינים גדולים וציטופלזמה דלילה. דוגמה של תאים לאחר הפשרה ותחליף סרום knockout.כאן מוצג מצע לגידול ללא תאי מאכיל (Feeder free medium) על ג'ל TrackX. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על גודל אחיד של כל מושבות התאים. במהלך שימור בהקפאה (cryopreserving), דבר זה משפר את התאוששות התאים.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב"ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

אפיון קבוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כדי לוודא שמירה על מצבם הפלוריפוטנטי, הוא צעד חשוב לפני שתאים אלה משמשים ליישומים אחרים. כאן אנו מתארים שיטה להתפשטות בקנה מידה קטן של iPSCs אנושיים שתוכננה במיוחד כדי לאפשר אפיון קל ושגרתי שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי נפוצות של זרע וגם ביצים. PGCs עובריים אנושיים מצוינים מתאי epiblast pluripotent באמצעות אינטראקציות של ציטוקינים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום של גרימת transcriptomally תאים אנושיים הדומה PGCs על פני השטח של גופים embryoid מתאי גזע pluripotent טענתי-pluripotency המושרה.

דור של תאים אנושיים כמו תא הנבט הקדמונים על פני השטח של גופים Embryoid מן pluripotency בשלה המושרה בתאי גזע Pluripotent

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימור קריוגני יעיל של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים.

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

כאן, אנו מציגים שיטה להבדיל ולהרחיב תאי הרג טבעיים המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) אנושי שמקורו ב-iPSC עם הרג משופר כנגד ממאירויות שונות. פרוטוקול זה מדגים את ההתמיינות וההרחבה של תאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC אופטימליים של הרג טבעי (NK) ומדידת פעילות אנטי-גידולית כנגד קווי תאי גידול שונים.

התקדמות בתאי הרג טבעיים המבטאים קולטני אנטיגן כימריים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למד שיטה להקפאה ושחזור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות תמיסת KnockOut SR ללא סרום. הפרוטוקול מדגים שימור חיות התאים לאחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

גלה סרטונים נוספים