Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני
15 ביולי 2010
פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא שימור בהקפאה (cryopreservation) והשבה של תאי IPS בתנאי תרבית מבוססי תאי מאכיל (feeder) או ללא תאי מאכיל. דבר זה מושג תחילה על ידי אריזה של תאי ה-IPC כפי שנעשה בדרך כלל. השלב השני של הפרוצדורה הוא העברת התאים לתווך הקפאה נטול סרום.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע הקפאה בשיטת cryopreserve כפי שאתם רגילים לעשות. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הפשרת התאים ותחילת התחזוקה שלהם. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הקפאה והפשרה מוצלחות של תאי IPS במדיום הקפאה נטול סרום, כפי שבא לידי ביטוי במורפולוגיה בריאה ובהתאוששות לאחר ההפשרה.
שלום, אני קייט ואגנר מאתר GCO ב-Life Technologies. הדגמה ויזואלית של פרוטוקול זה היא קריטית מכיוון ש-IPCs יכולים להיות רגישים מאוד להקפאה ולטמפרטורה. מה שהופך את הפרוטוקול הזה לקל יותר הוא שניתן להשתמש בתחליף סרום knockout לאורך כל תהליך העבודה.
כיום משפחת מוצרי KSR כוללת רשימה מלאה של מצעים וריאגנטים לתרבית של תאי גזע עובריים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, המבוססת על תאי מאכיל (feeder), נטולת תאי מאכיל (feed free) ונטולת רכיבים מהחי (xeno free). ניתן להשתמש ב-KSR לצורך בידוד, גידול, שימור בהקפאה, הרחבה והשלבים הראשוניים של דיפרנציאציה. הסרטון הבא יציג בפניכם את תהליכי ההפשרה וההקפאה של תאים באמצעות KSR במערכת נטולת תאי מאכיל.
כדי להתחיל בהליך זה, תחילה יש לחמם כמות מתאימה של מצע הזנה מלא ללא תאי מאכיל (complete feeder free medium) ל-37 °C באמבט מים, לשאוב את המצע המשומש מכלי התרבית, שהוא צלחת של 60 מילימטר, ובמקרה זה, לשטוף את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים של בני אדם פעמיים עם DPBS.
לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של dispa לצלחית. הדגירו את הצלחית בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאבו את תמיסת ה-dispa ושטפו בעדינות את התאים באמצעות DPBS.
בשלב הבא, הוסיפו מצע ללא תאי מאכילה (feeder free medium) מלא כדי לכסות את הצלחת, והשתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי לגרד בעדינות את התאים ולהעבירם למבחנת צנטריפוגה סטרילית בנפח 15 milliliter. שטפו את הצלחת עם מצע ללא תאי מאכילה מלא, תוך התזה עדינה כדי להסיר תאים שטרם ניתקו. העבירו את תמיסת השטיפה לאותה מבחנת 15 milliliter המכילה את התאים.
שטפו את הצלחת פעם שנייה עם מצע גידול ושאיפו את תמיסת השטיפה עם התאים; השקיעו את התאים על ידי סבוב ב-1000 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות והשליכו את העלייה (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים. נקו בעדינות את המבחנה כדי לשחרר לחלוטין את משקע התאים מהתחתית.
לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תווך הקפאה A, באמצעות פיפט סרולוגית של 5 mL, ושחזרו את התאים על ידי שאיבה והזרקה עדינה (pipetting). לאחר קבלת סספנסיה אחידה של הגושים, הוסיפו למבחנה 1 mL של תווך הקפאה B באופן טיפתי, תוך כדי סיבוב עדין של סספנסיית התאים לערבוב. העבירו 1 mL של סספנסיית תאים לכל מבחנה לקריו (cryovial), והקפיאו את התאים בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה בתוך תא איזופרופנול.
ביום למחרת, העבירו את מבחנות התאים למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הפשירו במהירות את מבחנת התאים הקפואה על ידי הנחתה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך כשלוש עד ארבע דקות, עד שיישאר במבחנה רק גוש קפוא קטן. לאחר הוצאת המבחנה מאמבט המים, רססו אותה ב-70%isopropanol לצורך דה-קונטמינציה, ולאחר מכן השתמשו בפיפט של 5 ml כדי להעביר באופן אספטי את כל תכולת המבחנה לשפופרת קונית של 15 ml.
השלב הבא עשוי להיות ההיבט המורכב ביותר של הפרוצדורה. יש להוסיף את המצע נטול התאיים המזינים (feeder free medium) לתאים באיטיות ובזהירות. כדי להפחית שוק אוסמוטי, הוסיפו באיטיות ארבעה מיליליטר של מצע נטול תאיים מזינים מלא בטפטוף לתאים בתוך המבחנה הקונית בנפח 15 מיליליטר.
בעת הוספת המצע, הניעו בעדינות את המבחנה קדימה ואחורה כדי לערבב את התאים. פעולה זו תפחית את ההלם האוסמוטי עבור התאים. ניתן להחליף את ה-Complete feeder free medium ב-knockout serum replacement המכיל meth conditioned medium או ב-knockout serum replacement medium לשימוש עם feeders; עיינו בטקסט הפרוטוקול להוראות להכנת המצעים.
לאחר הוספת כל ארבעת המיליליטרים של המצע, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, שאב בזהירות והשלך את הנוזל ללא הפרעה למשקע התאים. השהה בעדינות את משקע התאים בארבעה מיליליטרים של מצע מלא ללא תאי מאכילה (feeder free medium).
באמצעות פיפט של 5 mL, הוסיפו בעדינות את תרחיף התאים בטפטוף לצלוחית תרבית של 60 mm המצופה ב-gelt trucks. הניחו את צלוחית התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 36 עד 38 °C עם אטמוספירה מלחית של 4% עד 6% carbon dioxide באוויר. סובבו בעדינות את הצלוחית בתנועות מצפון לדרום וממזרח למערב כדי לפזר את התאים באופן שווה.
24 שעות לאחר ההפשרה. החלף את המצע בצלחת במצע טרי. החלף את המצע המשומש מדי יום לאחר מכן עד שהתאים יגיעו למסף של כ-70 עד 80% confluence.
תמונת ניגודיות זו מציגה תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים שגודלו בצלחות תרבית מצופות gelt TRX תוך שימוש בתחליף סרום מלא, במצע ללא תאי מאכיל (feeder free). ה-iPSCs מראים מורפולוגיה דומה לתאי גזע עובריים אנושיים, המאופיינת בגרעינים גדולים וציטופלזמה דלילה. דוגמה של תאים לאחר הפשרה ותחליף סרום knockout.
כאן מוצג מצע לגידול ללא תאי מאכיל (Feeder free medium) על ג'ל TrackX. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על גודל אחיד של כל מושבות התאים. במהלך שימור בהקפאה (cryopreserving), דבר זה משפר את התאוששות התאים.
זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את ההליך להקפאה (cryopreservation) של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPS) אנושיים באמצעות תוך הקפאה KnockOut SR, ושחזורם בתוך KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) מלא או בתוך KnockOut SR מבוסס תאי מאכילה (feeder-based).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
- טכניקות הקפאה (Cryopreservation)
רקע
- תאי iPS אנושיים רגישים לתהליכי הקפאה והפשרה.
- מוצרי KnockOut SR מקלים על שלבים שונים של תרבית תאי גזע.
- קריו-שימור נכון הוא קריטי לשמירה על חיוניות התאים.
- ניתן להשתמש בתנאי תרבית ללא תאי מאכיל (Feeder-free) ובתנאי תרבית עם תאי מאכיל (Feeder-based) עבור תאי iPS.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מהימן להקפאה (cryopreservation) של תאי iPS.
- הבטחת התאוששות מוצלחת של תאים לאחר הפשרה.
- הדגמת השימוש במוצרי KSR לאורך כל תהליך העבודה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי iPS להקפאה (cryopreservation).
- שימוש במדיום הקפאה נטול סרום לשימור תאים.
- הקפאה בטמפרטורה של -80 degrees Celsius ולאחריה אחסון בחנקן נוזלי.
- הפשרה והשעיה מחדש של התאים במדיום מלא נטול תאי מאכילה (feeder-free).
תוצאות עיקריות
- הקפאה והפשרה מוצלחות של תאי iPS הודגמו על ידי מורפולוגיה בריאה.
- התאים שמרו על חיוניות וצמיחה הן בתנאים ללא תאי מאכלה (feeder-free) והן בתנאים מבוססי תאי מאכלה (feeder-based).
- יעילות הפרוטוקול אוששה באמצעות הערכה ויזואלית של התאוששות התאים.
- שמירה על גודל אחיד של מושבות התאים שיפרה את שיעורי ההתאוששות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה שיטתית להקפאה (cryopreserving) של תאי iPS.
- מוצרי KnockOut SR יעילים לשמירה על בריאות התאים במהלך התהליך.
- הדגמות חזותיות משפרות את ההבנה ואת הביצוע של הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקפאה (cryopreservation) והשבה מהימנות של תאי iPS אנושיים באמצעות מצע גידול מוגדר וללא תאי מאכילה (feeder-free) נותנות מענה ישיר לאתגרי השרידות והסטנדרטיזציה במחקרים תרגומיים ובשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול זה מאפשר הקמה עקבית של בנק תאים פלוריפוטנטיים, התומך בפיתוח מערכי בדיקה (assays) חסונים וביישומים המשכיים בפורטפוליו של גילוי תרופות. תהליכי עבודה ללא תאי מאכילה מפחיתים את השונות הביולוגית, ובכך משפרים את רמת הביטחון בחיזוי ואת תעדוף הפורטפוליו בנקודות הכרעה מרכזיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר שמירה עקבית של תאים פלוריפוטנטיים לצורך בדיקה חוזרת של השערות ובחינת מסלולים ביולוגיים.
- מפחית שונות ביולוגית על ידי ביטול שכבות תאי מאכיל (feeder layers), ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שמירה על בריאות התאים ועל הפלוריפוטנטיות שלהם לאחר הפשרה.
- תומך בביטחון חיזוי בשלבי סריקה מוקדמים ובקבלת החלטות בנוגע למיון (triage).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת סטנדרטית ללא תאי מאכיל (feeder-free) להכנת תאי iPS מאושרים עבור בדיקות בסריקה רחבה (high-throughput assays).
- משפר את השחזוריות והניתנות להרחבה (scalability) של בדיקות מבוססות תאים באמצעות שימוש ברכיבי מדיום מוגדרים.
- מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות על ידי הבטחת התאוששות של תאים בריאים שאינם מובחנים (undifferentiated).
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה ובסטנדרטיזציה של בדיקות בין צוותי מחקר ופיתוח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- שומר על מודלי תאים רלוונטיים למחלה עבור מחקרי ביומרקרים טרנסלציונליים בעת שימוש בתאי iPS המופקים מחולים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה בהשבה ובהתרחבות תאיות רובסטית.
- מפחית את הסיכון לשונות בין סדרות (batch-to-batch variability) בפיתוח מודלים פרה-קליניים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת מקורות תאים אמינים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול הקריו-שימור וההשבה זה מתאים לשלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשר מעברים חלקים בין שלבי האחסון בבנק, ההרחבה ופריסת הבדיקות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות אספקת תאים פלוריפוטנטיים בריאים לפי דרישה.
- סריקה: מספקת תאי iPS מוכנים לבדיקה עם מורפולוגיה וחיוניות הניתנות לשחזור עבור תוצאות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה עקבית של בריאות התאים והתאוששותם, ובכך תומכת בהשוואות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות עבור מידול מחלות והתאמה של סממנים ביולוגיים בעת שימוש בקווי תאים המופקים מחולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך עבודה ללא תאי מאכילה (feeder-free), הניתן לשימוש חוזר לניהול תאים פלוריפוטנטיים במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הקפאה (cryopreservation) והשבה, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) ויעילות הונית על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות גילוי ותוכניות תרגומיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים ובטכניקות של תרבית ללא תאי מאכילה (feeder-free).
- נדרשת גישה למדיום מוגדר, לציוד הקפאה (cryopreservation) ולתשתית מבוקרת להפשרה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של גודל מושבות התאים ושל נהלי הטיפול לצורך התאוששות מיטבית.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שורות תאי iPS שונות או מודלים של מחלות.
- ניהול קפדני של הלם אוסמוטי הוא קריטי לשמירה על חיות התאים לאחר ההפשרה.
