Name: בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: גלו מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות עוברית ופיזיולוגיה באמצעות מסכי תרופות בקנה מידה גדול בדגי זברה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות ביולוגיות פעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) דג הזברה אוסף ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר והנקבה זה מזה עם מחיצה. לייבל הכלובים לשים מכסה עליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של המסך, להסיר את המחיצות מטנקים הרבייה ולאפשר דג הזברה להזדווג. במשך שעה 1 הבא, לאפשר ביציות מופרות ליפול דרך רשת בתחתית המיכל הפנימי כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, להחזיר דג הזברה הבוגרת חזרה מיכלי אחסון קבועים, להסיר את המיכל הפנימי לאסוף את הביצים על ידי מאמץ את המים במיכל כל הרבייה דרך מסננת תה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך מסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף את מסננת כדי לשטוף בעדינות את הביצים אל תוך צלחת פטרי באמצעות בקבוק המכיל לשטוף את המדיום E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים כל מופרית, אשר מופיעים אטום, יש להסיר בעזרת פיפטה פלסטיק חד פעמיות. כל אחד צריך לעבור הזדווגות להניב כ -200 עוברים. </li></ol> 2) עריכה עוברים 96-גם צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה על 5 עוברים בינוני E3 לבאר כל צלחת 96-היטב באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עוברים הם ערוכים לצלחת 96-היטב, להסיר כמה שיותר המדיום E3 כפי האפשרי של הבארות באמצעות ערוץ 12 (3-30 μL) פיפטה, נזהרת שלא לנקב את העובר. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לספק 250 μL של המדיום E3 המכיל kanamycin 0.5μg/ml זה טוב כמה שיותר מהר כדי לא לאפשר עוברים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את לוחות 96-היטב 28.5 ° C החממה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי כאשר תרכובות להתווסף. </li></ol> 3) העברת ספריית מולקולה קטנה אמנם העברת המתחם יכול להיות אוטומטי עם שיטות העברת רובוטית, נתאר את שיטת העברה ידנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריות מולקולה קטנה מסופקים בדרך כלל בפורמט 96-היטב, עם כל תרכובת מאוחסנים DMSO כמו מניה 10 מ&quot;מ. כ -60 דקות לפני העוברים מגיעים לשלב שבו הם תרכובות להתווסף, הפשרה המספר הרצוי של 96-היטב צלחות המכילות aliquots של מולקולות קטנות (צלחת מקור). שימו לב מספר זיהוי סדרתי או אחר של צלחות המקור. כדי למזער עיבוי על הצלחות, מפשיר יכול להתרחש בתא התייבשות המכיל Drierite (WA המונד DRIERITE CO, קסניה, OH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה את לוחות בצנטריפוגה השולחן מצויד מתאם רב גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט איטום אלומיניום מהצלחת המקור. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לדלל את התרכובות בצלחת מקור לריכוז של 0.5 מ&quot;מ (לדוגמה, אם מתחילים עם 250 aliquots NL של המניה 10mm, להוסיף 4.75 μL של DMSO זה טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים בצלחת 96-היטב (צלחת הנמען) מגיעים לשלב הרצוי, השתמש 12 ערוצים (20-20 μL) פיפטה להעביר 2.5μL של תרכובות (0.5mm) מהצלחות מקור לתוך צלחות הנמען המכיל את עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הזיהוי של מקור צלחות על צלחות העובר הנמען. מכסים את הצלחות הנמען עכשיו המכיל את העוברים ותרכובות עם מכסים, מערבבים בעדינות את הצלחות על ידי בעדינות מתערבל, ולמקם אותם בתוך 28.5 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל צלחת מקור המכיל מולקולות קטנות שאינן בשימוש (0.5 מ&quot;מ) עם סרט אלומיניום איטום ומניחים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 4) הקרנת עבור אפקטים של מולקולות קטנות, על ידי בדיקה ויזואלית של פנוטיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע המסך, לגבש אמת מידה ספציפית מה יהווה &quot;מכה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפעמים הרצוי בפיתוח, להסיר את פלטות 96-תרכובת המכילה גם מטופלים העוברים מן החממה ולבחון היטב תחת כל stereomicroscope. עבור ויזואליזציה טובה יותר של שינויים עדינים, כגון שינויים בדפוס הדם, מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך יכול לשמש. מיקרוסקופיה פלורסנט יכול לשמש כדי לבחון ההפרעות הביטוי של ה-GFP או חלבונים DsRed תחת האמרגן רקמות ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות הסריקה 96-היטב הצלחות גם כל אשר לפחות 3 מתוך 5 עוברים התערוכה הקבועה פנוטיפ &quot;מכה&quot;. הקלט את זהותו של הצלחת ומיקום טוב של כל נפגע פוטנציאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשרר להיט פוטנציאלי על ידי retesting על השפעותיה של התרכובת במינונים שונים (1 אממ, 5 UM, 10 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר). עבור כל מנה, 10 עוברים נבדקים 0.5 מ&quot;ל של התקשורת E3 בפורמט 48-היטב צלחת. עיתוי בנוסף מתחם עבור retesting צריך להיות זהה לזה של ההקרנה המקורי. מכה כאשר הוא אישר את הפנוטיפ שהושרו מתנוסס על retesting של compounד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מתחם פגע ממסד הנתונים של מולקולות קטנות בספריה כימיים. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חייב להיות ממופה החוצה בדיוק לפני שיזם את המסך כדי למנוע גבוה בלתי מתקבל על הדעת שיעורי חיובי כוזב. עם תכנון קפדני, מסכי דג הזברה כימיים, אשר דורשים השקעות הון צנוע, יכולה להוביל לגילוי של אפנן הרומן של תא הא...

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינימום של 20 זוגות של דג הזברה הבוגרת הגנוטיפ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג רשתות, טנקים רבייה, עם מיכל פנימי נשלף חוצצים (גידול Aquatic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (10 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תה מסננת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף containg בקבוק מים העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנויה להעביר פוליאתילן pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליסטירן 96-היטב מסביב לתחתית assay צלחות (קורנינג שחקן המשנה; לואל, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית פיפטה פסטר (פישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה ידנית פיפטה, 10 מ&quot;ל (Bel-Art מוצרים, Pequannock, NJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר בינוני E3: 5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4, המכיל 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma, סנט לואיס, מיזורי). PTU יכול להיות מוכן כפתרון 10x ידי המסת 0.3 גרם PTU ב L 1 של מדיה העובר E3. פתרונות המכיל PTU צריך להיות מוגן מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ערוצים pipettes, 20-20 μL (Eppendorf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ערוצים pipettes, 300-300 μL (Eppendorf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנויה פוליסטירן פיפטה אגן, 50 מ&quot;ל (פישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מולקולה ספרייה קטנה של תרכובות שונות מבנית ערוכים בפורמט 96-wll בבית מניות 10 מ&quot;מ DMSO. צלחת כל אב aliquoted תוך 96-היטב אחסון צלחות פוליפרופילן (קורנינג), ומאוחסנים ב -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלומיניום איטום סרט עבור 96-היטב צלחות (Nunc, רוצ&#39;סטר, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMSO (Sigma, סנט לואיס, מיזורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסוד חממה, 28.5 ° C (פישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stereomicroscope עם בסיס האור המועבר (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה<em&gt; In vivo</em&gt; פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.

דג הזברה התפתחה חזקה<em&gt; In vivo</em&gt; פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.

בשל גודלם הקטן של העוברים, התפתחותם המהירה, השקיפות שלהם, הפריון הגבוה והדמיון הרב ברמה המולקולרית, המורפולוגית והפיזיולוגית ל...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגלות מולקולות קטנות המווסתות באופן ספציפי היבטים מרכזיים של התפתחות עוברית ופיזיולוגיה. דבר זה מושג על ידי הנחת מספר רב של ביצים מופרית בלוחות 96 בארות כשלב שני של סינון. מנות (Aliquots) של ספריית מולקולות קטנות מתווספות ללוחות ה-96 בארות לצד העוברים בלוחות ה-96.הפלטות של בארות נבחנות לאיתור פנוטיפים שהופעלו על ידי המולקולות הקטנות. התוצאות המתקבלות מראות אילו מולקולות קטנות משפיעות באופן ספציפי על ההתפתחות או הפיזיולוגיה של דגי ה-super fish. שלום, שמי צ'ארלס הונג מהבית ספר לרפואה של אוניברסיטת ונדרבילט.במעבדה שלנו, אנו מבצעים סריקות כימיות בעתק גבוה באמצעות עוברי דגי זהב. זוהי טכניקה פשוטה יחסית שניתן להתאימה באופן נרחב לגילוי תרכובים ביו-אקטיביים חדשים. אחר הצהריים שלפני יום הסריקה הכימית, הכינו 10 עד 20 מיכלי רבייה לדגי זהב.הנח מחיצה בכל מיכל ומלא כל מיכל במים ממערכת האקוואקולטורה; העבר באמצעות רשת דגים זכר בוגר אחד ונקבה בוגרת אחת עד שתיים למכל הפנימי. בכל מיכל רבייה, סמן את המיכלים והנח עליהם מכסה בבוקר של הסינון. הסר את המחיצות ממיכלי הרבייה ואפשר לדגי הזברה להזדווג.במהלך השעה הבאה, אפשרו לביצים המופריות לנפול דרך הרשת שבתחתית של כל מכל פנימי. לאחר שעה, החזירו את דגי ה-seber הבוגרים למכלי האחסון הקבועים.הסירה את המכל הפנימי ואסוף את הביצים על ידי סינון המים מכל מיכל רבייה באמצעות מסננת תה מפלסטיק. הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ושטוף אותה בעדינות כדי להעביר את הביצים אל צלחת הפטרי. באמצעות בקבוק שטיפה המכיל תווך E three, יש להסיר את כל הביצים שאינן מופיות, הנראות אטומות.באמצעות פיפטת פלסטיק חד-פעמית, כל הצלבה של זיווג צריכה להניב כ-200 עוברים. לאחר מכן, העבירו בערך חמישה עוברים במדיום E3 לכל באר של פלטה בעלת 96 בארות, באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית. לאחר שהעוברים סודרו על פלטה בעלת 96 בארות.הסיר כמה שיותר ממרקא E three מבארות באמצעות פיפט רב ערוצי (12 ערוצים), תוך הקפדה שלא לנקב את העובריים. בעזרת הפיפט רב הערוצי, הוסף 250 microliters של E three.הוסיפו למעמקים מצע המכיל 0.5 µg/mL של canmycin במהירות האפשרית כדי למנוע מהעוברים להתייבש. הכניסו את פלטות ה-96 בארות לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיגיעו לשלב הרצוי להוספת התרכובות. בפרוטוקול זה, אנו מחפשים תרכובות המשבשות את התבניות העובריות המוקדמות, ונדגור את העוברים למשך שלוש שעות או עד שמעל 90% מהעוברים יגיעו לשלב של 1000 תאים; ספריות של מולקולות קטנות מסופקות בדרך כלל.בפלטת מקור של 96 בארות, שבה כל תרכובת מאוחסנת ב-DMSO כחומר מוצא בריכוז 10 millimolar, כ-60 דקות לפני שהעוברים יגיעו לשלב הרצוי, הפשיר מספר מתאים של פלטות 96 בארות המכילות מנות של מולקולות קטנות. רשום את המספר הסידורי או מספר זיהוי אחר של פלטות המקור כדי למזער התעבות על הפלטות. הנח אותן בתא ייבוש המכיל חומר מייבש.סובב בקצרה את הפלטות בצנטריפוגת שולחנית המצוידת במתאם לפלטות רב-בארות. הסר את סרט האלומיניום מהפלטה המקורית; באמצעות פיפטה בעלת 12 ערוצים, דלל את התרכובות בפלטה המקורית לריכוז הרצוי באמצעות DMSO. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בריכוז סופי של 0.5 millimolar ומוסיפים 4.75 µL של DMSO כדי לדלל את פלטת המלאי בריכוז 10 millimolar.כאשר העוברים בפלטת 96 הבארות מגיעים לשלב הרצוי, השתמשו בפיפט 12 ערוצים כדי להעביר 2.5 µL של תרכובות מפלטות המקור לפלטות המקבלות המכילות את העוברים. כסו את הפלטות המכילות כעת את העוברים והתרכובות במכסים, ורשמו את מספר הזיהוי של פלטות המקור על פלטות העוברים. ערבבו את הפלטות באמצעות סיבוב עדין והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C.כסו כל פלטת מקור המכילה מולקולות קטנות שאינן בשימוש בתקרת אלומיניום, הדביקו בסרט דביק והניחו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לפני ביצוע הסריקה הוויזואלית, הגדירו קריטריון ספציפי לזיהוי "להיט" (hit). לדוגמה, בסריקה למולקולות קטנות המעכבות את התפתחות המוח, "להיט" עשוי להיות תרכובת הגורמת לאובדן של המוח הקדמי.היעדר עיניים הוא אינדיקטור ויזואלי פשוט לאובדן של המוח הקדמי (forebrain) ואינו דורש פלואורסצנציה לצורך בדיקה בנקודות זמן רצויות במהלך ההתפתחות. הוצא את פלטות 96 הבארים המכילות עוברים שטופלו בתרכובות מהאינקובטור ובדוק כל באר תחת מיקרוסקופ סטריאו; כאשר מבצעים סריקה של מעכבים של מולקולות קטנות של התפתחות המוח הקדמי, יש לבחון את הפלטות לאחר 28 שעות כדי לזהות היעדר עיניים כסמן לעיכוב התפתחותי של המוח הקדמי. רשום את זהות הפלטה ומיקום הבאר עבור כל באר שבו לפחות שלושה מתוך חמישה עוברים מראים את הפנוטיפ המוגדר. החזר את פלטת 96 הבארים לאינקובטור.יש לאשר מחדש את אובדן העיניים והמוח הקדמי לאחר 48 שעות. למרות שלעוברים לא יהיה מוח קדמי, הם ישרידו לפחות ארבעה ימים. יש לאשר מחדש פגיעה פוטנציאלית על ידי בדיקה חוזרת של השפעות התרכובת במספר מינונים; עבור כל מינון, נבדקים 10 עוברים ב-0.5 milliliters של מצע E three בפורמט של פלטה בעלת 48 בארות.התזמון של הכנת התרכובת לבדיקה חוזרת צריך להיות זהה לזה של הסריקה המקורית. HIIT מאושר כאשר הפנוטיפ שהופעל משתחזר בצורה תלוית-מינון בבדיקה חוזרת של התרכובת. לבסוף, זהו את התרכובת ה-hi מתוך מאגר המולקולות הקטנות בספריה הכימית.באמצעות סריקה כימית ויזואלית המבוססת על דגי zebrafish, גילינו מולקולה קטנה המעכבת את אות ה-hedgehog, על סמך השפעתה על ציר הגוף. תמונה זו מציגה עוברים שנחשפו למעכב hedgehog המפגינים כיפוף ונטרלי בולט של הזנב. בבדיקה של אותם עוברים לאחר 48 שעות, הם עדיין מפגינים את הפנוטיפ של כיפוף ונטרלי, כפי שנצפה ב-24 שעות.תמונה זו מציגה עובר שטופל בתרכובת בהשוואה לעובר מוטנטי של מסלול ה-hedgehog. לאחר השליטה בטכניקה זו, אדם אחד יכול לסרוק כ-400 תרכובות בשבוע בתוך מספר שעות בלבד. טכניקה זו סללה את הדרך עבור ביולוגים כימיים לחקור נושאים כגון התפתחות תאים, מסלולי אותיות תאיים והתפתחות עוברית.בעת עבודה עם מולקולות קטנות שאינן מאופיינות, חשוב להקפיד על בטיחות נאותה ולהשתמש בחלוקי מעבדה ובכפפות, שכן מולקולות לא מאופיינות אלו עלולות להיות מסוכנות.

large-scale-zebrafish-based-in-vivo-small-molecule-screen

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

גלו מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות עוברית ופיזיולוגיה באמצעות מסכי תרופות בקנה מידה גדול בדגי זברה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות ביולוגיות פעילות.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

גלה סרטונים נוספים