בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך
30 בדצמבר 2010
דג הזברה התפתחה חזקה In vivo פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגלות מולקולות קטנות המודולות באופן ספציפי היבטים מרכזיים של התפתחות עוברית ופיזיולוגיה. מטרה זו מושגת על ידי הנחת מספר רב של ביצים מופריות בלוחות של 96 בארות, כאשר השלב השני הוא סריקה. מנות מספרה של ספריית מולקולות קטנות מתווספות ללוחות 96 הבארות לצד העובריים בלוחות.
לוחיות הבארים נבחנות לאיתור פנוטיפים שהושרים על ידי המולקולות הקטנות. התוצאות המתקבלות מראות אילו מולקולות קטנות משפיעות באופן ספציפי על ההתפתחות או הפיזיולוגיה של דגי העל. שלום, שמי צ'ארלס הונג מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ונדרבילט.
במעבדה שלנו, אנו מבצעים סריקות כימיות בסביבה של תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דגי zebrafish. זוהי טכניקה פשוטה יחסית שניתן להתאימה באופן נרחב לגילוי תרכובים ביו-אקטיביים חדשים. אחר הצהריים שלפני יום הסריקה הכימית, הכינו בין 10 ל-20 מיכלי רבייה לדגי zebrafish.
הניחו מחיצה בכל מיכל ומלאו כל מיכל במים ממערכת החקלאות הימית. העבירו בעזרת רשת לדגים זכר בוגר אחד ונקבה בוגרת אחת עד שתיים אל המכל הפנימי. בבוקר הסינון, סמנו את מיכלי הרבייה והניחו עליהם מכסה. הסירו את המחיצות ממיכלי הרבייה ואפשרו לדגי הזברה להתרבית.
במהלך השעה הבאה, יש לאפשר לביצים המופריות לנפול דרך הרשת שבתחתית של כל מכל פנימי. לאחר שעה אחת, החזירו את דגי ה-seber הבוגרים למכלי האחסון הקבועים.
הוציאו את המכל הפנימי ואספו את הביצים על ידי סינון המים מכל מיכל גידול באמצעות מסננת תה מפלסטיק. הפכו את המסננת מעל צלחת פטרי ושטפו אותה בעדינות כדי להעביר את הביצים לתוך הצלחת. בעזרת בקבוק שטיפה המכיל תווך E three, הסירו את כל הביצים שאינן מופיות, הנראות עכירות.
באמצעות פיפטת פלסטיק חד-פעמית, כל הצלבה להרבעה צריכה להניב כ-200 עוברים. לאחר מכן, העבירו כחמישה עוברים במדיום E3 לכל באער של פלטת 96 באערים באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית. לאחר שהעוברים סודרו על פלטת 96 באערים.
הסיר כמה שיותר ממדיום E3 מהבארות באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, תוך הקפדה לא לדקור את העובריים. באמצעות פיפטת 12 הערוצים, העבר 250 µl של E3.
יש להוסיף לכל באר מילה של מצע המכיל 0.5 µg/mL של kan mycin במהירות האפשרית, כדי למנוע מהעוברים להתייבש. יש להכניס את פלטות ה-96 באר לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיגיעו לשלב הרצוי להוספת התרכובות. בפרוטוקול זה, אנו מחפשים תרכובות המשבשות את דפוס ההתפתחות העוברית המוקדם, ונדגור את העוברים למשך שלוש שעות או עד שמעל ל-90% מהעוברים יגיעו לשלב של 1000 תאים, כפי שסופקו בדרך כלל בספריות המולקולות הקטנות.
בפלטת מקור בעלת 96 בארות שבה כל תרכובת מאוחסנת ב-DMSO כמלאי של 10 millimolar, כ-60 דקות לפני שהעובריים יגיעו לשלב הרצוי, הפשיר מספר מתאים של פלטות 96 בארות המכילות מנות של מולקולות קטנות. רשום את המספר הסידורי או מספר זיהוי אחר של פלטות המקור כדי למזער התעבויות על הפלטות. הנח אותן בתא ייבוש המכיל חומר מייבש.
סובב קצרה את הפלטות בצנטריפוגת שולחנית המצוידת במתאם לפלטות רב-בארות. הסר את סרט האלומיניום מהפלטה המקורית, ובאמצעות פיפטה בעלת 12 ערוצים, דלל את התרכובות בפלטת המקור לריכוז הרצוי באמצעות DMSO. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בריכוז סופי של 0.5 millimolar ומוסיפים 4.75 microliters של DMSO כדי לדלל את פלטת המלאי בריכוז 10 millimolar.
כאשר העוברים בלוחית 96 הבארים מגיעים לשלב הרצוי, השתמשו בפיפט 12 ערוצים כדי להעביר 2.5 µL של תרכובות מלוחיות המקור ללוחיות המקבלות המכילות את העוברים. כסו במכסים את הלוחיות המכילות כעת את העוברים והתרכובות, ורשמו את מספר הזיהוי של לוחיות המקור על לוחות העוברים. ערבבו את הלוחיות באמצעות סיבוב עדין והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C.
כסו כל פלטת מקור המכילה מולקולות קטנות שאינן בשימוש בתקרת אלומיניום, הדביקו בסרט דבק והניחו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לפני ביצוע הסריקה הוויזואלית, הגדירו קריטריון פגיעה (hit criterion) ספציפי. לדוגמה, בסריקה למולקולות קטנות המעכבות את ה-four brainin development, פגיעה עשויה להיות תרכובת הגורמת לאובדן של המוח הקדמי.
היעדר עיניים הוא סמן חזותי פשוט לאובדן המוח הקדמי ואינו דורש פלואורסצנציה לצורך בדיקה בנקודות הזמן הרצויות במהלך ההתפתחות. הוציאו מהאינקובטור את פלטות ה-96 בארות המכילותו Embryos שעברו טיפול בתרכובות, ובחנו כל בארה תחת מיקרוסקופ סטריאו. בעת סריקה לאיתור מעכבים של מולקולות קטנות של התפתחות המוח הקדמי, בחנו את הפלטות לאחר 28 שעות כדי לזהות היעדר עיניים כסמן לעיכוב התפתחות המוח הקדמי. רשמו את מזהה הפלטה ואת מיקום הבארה עבור כל בארה שבה לפחות שלושה מחמשת ה-Embryos מראים את הפנוטיפ המוגדר. החזירו את פלטת ה-96 בארות לאינקובטור.
יש לאשר מחדש את היעדר העיניים והמוח הקדמי לאחר 48 שעות. למרות שלעוברים לא יהיה מוח קדמי, הם ישרידו למשך ארבעה ימים לפחות. יש לאשר מחדש פגיעה פוטנציאלית על ידי בדיקה חוזרת של השפעות התרכובת במספר מינונים; עבור כל מינון, נבדקים 10 עוברים ב-0.5 milliliters של מצע E3 בפורמט של פלטת 48 בארות.
עיתוי עריכת התרכובת לבדיקה חוזרת צריך להיות זהה לזה של הסריקה המקורית. HIIT מאושר כאשר הפנוטיפ שהופעל משתחזר באופן תלוי מינון בבדיקה חוזרת של התרכובת. לבסוף, זהה את תרכובת ה-hi מתוך מאגר המולקולות הקטנות בספרייה הכימית.
באמצעות סריקה כימית ויזואלית המבוססת על דגי zebrafish, גילינו מולקולה קטנה המעכבת את אות ההדג'הוג (hedgehog), בהתבסס על השפעתה על ציר הגוף. תמונה זו מציגה עוברים שנחשפו למעכב ההדג'הוג המראים כיפוף ונטרלי בולט של הזנב. עוברים אלו, שנבדקו לאחר 24 שעות, עדיין מראים את הפנוטיפ של כיפוף ונטרלי גם בבדיקה לאחר 48 שעות.
תמונה זו מציגה עובר שטופל בתרכובת בהשוואה לעובר מוטנטי במסלול ה-hedgehog. לאחר שולטים בטכניקה זו, אדם אחד יכול לסנן כ-400 תרכובות בשבוע תוך מספר שעות בלבד. טכניקה זו סללה את הדרך עבור ביולוגים כימיים לחקור תהליכים כגון התפתחות תאים, מסלולי איתות תאיים והתפתחות עוברית.
בעבודה עם מולקולות קטנות שאינן מאופיינות, חשוב להקפיד על כללי בטיחות מתאימים ולהשתמש בחלוקי מעבדה ובכפפות, שכן מולקולות לא מאופיינות אלו עלולות להיות מסוכנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה מעשית לסריקה רחבת היקף של מולקולות קטנות באמצעות עוברים של דגי זברה. המטרה היא לזהות תרכובות המשפיעות על ההתפתחות העוברית והפיזיולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- דגי זברה הם מודל בעל ערך לסריקת תרופות.
- הם מאפשרים ניתוח של מולקולות קטנות המבוסס על פנוטיפ.
- ההתפתחות העוברית היא קריטית להבנת תהליכים פיזיולוגיים.
- סריקה רחבת היקף יכולה להאיץ את גילוי התרופות.
מטרת המחקר
- לגילוי מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות עוברית.
- להערכת ההשפעות הפיזיולוגיות של תרכובות אלו.
- שימוש בדגי zebrafish כפלטפורמה in vivo לסריקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצי דגי זברה מופריות מוצבות בלוחות של 96 בארות.
- ספרייה של מולקולות קטנות מתווספת ללוחות.
- הפנוטיפים נבדקים כדי לזהות תגובות לתרכובות.
- התוצאות מצביעות על המולקולות המשפיעות על ההתפתחות או הפיזיולוגיה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות דגי זברה.
- הערכת שינויים פיזיולוגיים בעוברים.
- הדגמת יעילותה של שיטת הסריקה.
- השלכות פוטנציאליות על גילוי תרופות וביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה חסונה לסריקת תרופות.
- עוברי Zebrafish יעילים לחקר תהליכי התפתחות.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את הבדיקה של התרכובות שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקת מולקולות קטנות בקנה מידה רחב in vivo המבוססת על דגי zebrafish מאפשרת זיהוי מהיר, מונחה-פנוטיפ, של תרכובות ביו-אקטיביות המשפיעות על התפתחות ופיזיולוגיה של חולייתנים. גישה זו מספקת ביטחון ניבוי עבור תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ותומכת במיון פורטפוליו על ידי חשיפת השפעות התרכובות בהקשר של אורגניזם שלם. יכולת ההרחבה והתפוקה שלה הופכות אותה לנכס אסטרטגי עבור צוותי גילוי השואפים להפחית סיכונים במנגנונים ביולוגיים לפני קידום מועמדים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מסלולי התפתחות ותהליכים פיזיולוגיים במערכת של חולית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור חשיפה לתרכובת לתוצאות פנוטיפיות ניתנות לצפייה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת השפעות on-target ו-off-target in vivo.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מהירה של השערות על פני ספריות כימיות מגוונות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק סריקה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור באמצעות פורמטים סטנדרטיים של פלטות עם 96 בארות.
- מייצר קריאות פנוטיפיות כמותיות ואיכותיות לצורך מיון תרכובות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של ספריות תרכובות לבחינת השפעות התפתחותיות ופיזיולוגיות.
- תומך בפיתוח בדיקות המשך באמצעות זיהוי נקודות קצה פנוטיפיות חסונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם ממצאי גילוי מוקדמים עם מסלולים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה כאשר הפנוטיפים שמורים.
- מספק רציפות מסריקה in vivo לבחירת מודל פרה-קליני המבוססת על תובנות מכניסטיות.
- מפחית סיכונים בהחלטות קידום על ידי אישור השפעות התרכובת בהקשר של אורגניזם שלם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת סריקה זו המבוססת על דגי זברה מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה, in vivo, של פעילות תרכובות לפני ביצוע מחקרים ביונקים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מונחות-השערה של מולקולות קטנות לצורך מודולציה של מסלולים והשפעה התפתחותית.
- סריקה: מציע בדיקות פנוטיפיות ניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב, עם קריטריונים ברורים לזיהוי "פגיעות" (hits) לצורך בחירת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת דירוג פנוטיפי כמותי ואישור של תגובת מינון להשוואה חסונה של נתונים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמת פגיעות ראשוניות לביולוגיה רלוונטית למחלה, כאשר הדבר ישים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה עבור קמפיינים מתמשכים של גנטיקה כימית וגילוי תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מנגנונית בשלבים מוקדמים של הגילוי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של סריקה בתפוקה גבוהה באמצעות תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של פיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים שעברו ולידציה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול דגי זברה, אמבריולוגיה וניתוח פנוטיפי.
- נדרשת גישה לתשתיות לטיפול בפלטות רב-באיריות, אינקובציה ומיקרוסקופיה סטריאוסקופית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריונים לזיהוי "להיטים" (hits) ודירוג פנוטיפי.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שלבי התפתחות שונים או נקודות קצה פנוטיפיות שונות.
- פרוטוקולי בטיחות הם חיוניים בעת טיפול במולקולות קטנות שאינן מאופיינות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Introduction
1:02
Zebrafish Egg Collection and 96-Well Plate Preparatin
2:52
Small Molecule Library
4:23
Screening for Effects of Small Molecules by Visual Inspection of Phenotypes
5:51
Small Molecule Detection with Zebrafish Chemical Screening Assay
6:21
Conclusion
