ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע מידע מטרי ומבני על חלבון. כל קומפלקסי הרצועות המבטאים תאים ביולוגיים חיים, תאי שמרים מהונדסים גנטית כדי לבטא את החלבונים המעניינים המחוברים לתורם או לבדיקה פלואורסצנטית מקבלת. ניתן לעורר בדיקות תורם ישירות על ידי לייזר.

בעוד שמקבלים יכולים להתרגש רק באמצעות העברת אנרגיה מתורם נרגש קרוב, התאים נחשפים לאור מלייזר אינפרא אדום פועם. ההזרעה הפלואורסצנטית מהגשושיות מופרדת למרכיביה הספקטרליים על ידי סורג שידור ומוקרנת על פני מערך CCD המכפיל אלקטרונים. לכן, ספקטרום פלואורסצנטי שלם מפרט, כל הרצועות מתקבלות עבור כל מיקום בדגימה.

הפרופיל הספקטרלי של הקרינה שזוהתה תלוי באינטראקציה הספציפית של החלבונים המעניינים. הנתונים מנותחים כדי לקבוע עבור כל פיקסל תמונה של תא סריקה, את הפליטות הנפרדות מבדיקות התורם והמקבל. יעילות העברת האנרגיה נקבעת בכל פיקסל בתמונה, ואז הפיקסלים מתכופפים בהתאם ליעילות החריץ וההיסטוגרמה שלהם.

פירוש ההיסטוגרמה מאפשר קביעה in vivo של חלבון, גודל מורכב ותצורה. היי, שמי מייקל סטונמן מקבוצת המחקר Riku באוניברסיטת ויסקונסין מילווקי. שמי סינג.

אני ממעבדת ריקוס בוויסקונסין, מילווקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפרופילי הפליטה המלאים ממאות מכל מתחמי הרצועות בתוך תא מתקבלים בסריקה אחת מלאה של התא. בדרך כלל, רוב שיטות המיקרוסקופיה הקרינה דורשות סריקה של התא המעניין מספר פעמים על מנת לצבור מספיק מידע ספקטרלי על מנת לקבוע את יעילות השריג באזורי עניין שונים בתוך התא.

עם זאת, תגובות ביוכימיות של דיפוזיה עשויות לשנות את ההרכב המולקולרי של אזורי עניין אלה ובכך להגביל את המידע המתקבל בסריקת התמונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר אינטראקציה של חלבון, חלבון בתאים חיים, כגון מה גודל הנזק של אוליגומרים? באיזה שלב במחזור החיים של החלבון מגדלים האוליגומרים, ומה תפקידו של האוליגומר של חלבון זה בתפקוד התאי?

שני מיקרוסקופ הצילום שנפתרו ספקטרלית, צוברים מידע ספקטרלי על קומפלקסי האולימה בתא התמונה על ידי סריקת המוקד של קרן העירור על פני הדגימה המעניינת במספר מיקומים. זוג מראות סריקה אורתוגונליות משמשות לתרגום המיקוד של קרן הלייזר על פני הדגימה לשני כיוונים שונים. תנועת מראות הסריקה נשלטת על ידי מחשב ומסונכרנת עם חילוץ נתוני עוצמת הקרינה ממצלמת ה-CCD מסריקות הקו ניתן לשחזר מפות מרחביות של עוצמת הקרינה המתאימות לאורך גל מסוים של אור.

על מנת לשחזר במדויק מפות מרחביות של עוצמת פלואורסצנטיות של קרני רנטגן ולחשב את אורך הגל בפועל המתאים לכל אחת מהמפות הללו, יש לכייל את פרוטוקול סריקת הקווים באמצעות תמיסת פלואורסצאין. כדי להתחיל בהליך הכיול, שלח לספקטרום העירור באורך גל של 800 ננומטר, שהוא פי שניים מאורך גל העירור המרבי של תג התורם GFP שניים שניים לשליחה לספקטרום העירור, תרגם את המנסרה הממוקמת בתוך חלל הלייזר כדי לשנות את פיזור מהירות הקבוצה באמצעות תוכנת המחשב שאליה המצלמה מתממשקת. שלח פקודה לשבב ה-CCD כדי להוריד את הטמפרטורה של שבב ה-CCD לטמפרטורה הנמוכה ביותר שניתן להשיג.

על מנת להפחית את הרעש הכהה. פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת פלואורסצאין על מכסה שקופית מיקרוסקופ עם החלקת כיסוי כך ששכבה דקה של הדגימה מתפזרת באופן אחיד באזור שבין החלקת הכיסוי לשקופית המיקרוסקופ, הנח טיפה קטנה של שמן טבילה על פני החלקת הכיסוי. כעת הדק את המיקרוסקופ, החלק לשלב התרגום XY, Z ותרגם את השקופית וה-stage בכיוון הציר האופטי על ידי התאמה ידנית של המפעיל הליניארי, תרגם את השקופית עד שאובייקט המיקרוסקופ בא במגע עם טיפת שמן הטבילה, העבר את המצלמה למצב וידאו של רכישת נתונים כך שהאור המודה הפוגע במערך ה-CCD יוצג על מסך המחשב בזמן אמת.

כבה את כל אורות הסביבה בחדר על מנת להפחית את רעשי הרקע שזוהו במערך ה-CCD. כוונן לאט את המיקרומטר השולט על שלב התרגום בכיוון הציר האופטי כדי להביא את הדגימה לנקודת המוקד של קרן הלייזר. כאשר דגימת הפלואורסצאין נמצאת בפוקוס, הפליטה תופיע כקו חד במערך ה-CCD.

הורד את הקריאה של עוצמות הפיקסלים ממערך CCD למחשב. מדוד את עוצמת הפיקסלים כפונקציה של מיקום במערך CCD על ידי פתיחת המטריצה שהורדת של ערכי העוצמה בתמונה J וציור קו דרך אזור הפלואורסצנט. השתמש בפקודה יום תמונה.

נתח פרופיל עלילה כדי ליצור עלילה הממחישה את ספקטרום הפליטה של דגימת הפלואורסצאין. התאם את הפרמטר המצטבר של המראה, השולט בתנועת הלייזר. התמקד בכיוון Y, כך שמיקומי y סמוכים בתוך הדגימה מביאים לתנועה של שיא הספקטרום הפלואורסצנטי בפיקסל אחד בדיוק לאורך הממד הספקטרלי במערך ה-CCD.

כדי לפקח על כך, הורד את עוצמת ספקטרום הפלואורסצאין עבור שני מיקומי Y שונים בדגימה. לאחר מכן פתח את תמונות העוצמה עם תמונה J ומצא את מיקום שיא הפיקסלים עבור כל אחד מהספקטרומים הפלואורסצנטיים. באמצעות סמן התמונה J, השארת התריס של ה-CCD פתוח סרוק את מיקוד הלייזר על פני הדגימה בכיוון X.

האור הנפלט מכל ווקסל לאורך קו הסריקה אמור ליפול על מערך ה-CCD בסוף כל סריקת שורה, לאחסן את הנתונים ממערך ה-CCD שהתקבל עבור סריקת קו זו ולאחר מכן לנקות את הפיקסלים של מערך ה-CCD. הזז את מיקום הלייזר. התמקדו בכיוון Y לפי הכמות שנקבעה קודם לכן.

לאחר מכן סרוק את קרן הלייזר בכיוון X על פני הדגימה. שוב, השארת התריס של ה-CCD פתוח לאחסן את הנתונים. חזור על הליך סריקת קו זה עד שאזור פיזי הגדול בכ-50% מהממדים של תא ביולוגי בודד מואר באור לייזר.

יש להשתמש בקשר בין מספר השורה של תמונת סריקת קו מסוימת ואורך הגל כדי לשחזר את התמונות כדי לקבל מפות פנים בעוצמות פלואורסצנטיות מרובות של אשתו לשעבר באורכי גל שונים. כדי להשיג את תמונת ההגשה הפלואורסצנטית של האישה לשעבר עבור אורך גל מסוים, מצא את מספר השורה בתמונה שהתקבלה מסריקת הקו הראשון המתאים לאורך גל זה. ואז השורה הסמוכה של תמונת סריקת הקו הבאה תואמת את השורה הבאה של תמונת הפליטה הפלואורסצנטית.

עבור אורך הגל המסוים הזה, ערמו את כל שורות התמונה התואמות לאורך גל זה כדי לקבל את המפות המרחביות של עוצמת הפלואורסצנט XY של הדגימה באורך גל זה. חזור על הליך זה עבור כל אורכי הגל האחרים הניתנים להשגה כדי לאסוף נתונים על הדגימות שלך. ראשית, הסר מהחממה את הצלחות עם מושבות שמרים שעברו טרנספורמציה.

צריכים להיות לפחות שלושה סוגים של תאים שעברו טרנספורמציה. תאים המבטאים את החלבונים המעניינים מתויגים בשני סוגי הבדיקות הפלואורסצנטיות. תאים המבטאים רק חלבונים המתויגים בבדיקות הפלואורסצנטיות של התורם ותאים המבטאים רק חלבונים המתויגים בבדיקות הפלואורסצנטיות המקבלות.

הוסף 100 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי אשלגן כלורי לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, בעזרת קצה מיקרו פיפטה, מגרדים שלוש עד חמש מושבות שמרים מצלחת התאים המבטאים חלבונים המתויגים הן עם התורם והן למעט בדיקה פלואורסצנטית וחיסון האשלגן הכלורי 100 מילי-מולרי. בעזרת תאים אלה, הסר 10 מיקרוליטר מתרחיף התא והוציא אותו במיקרוסקופ חדש. שקופית.

מכסים את הטיפה בהחלקת כיסוי ומניחים טיפת שמן על פני החלקת הכיסוי. לאחר מכן, סגור ידנית את התריס בנתיב קרן הלייזר כדי לחסום את אור הלייזר מלהגיע למטרת המיקרוסקופ. הדק את שקופית המיקרוסקופ לשלב התרגום XY, Z ותרגם את שלב ההחלקה בכיוון הציר האופטי עד שאובייקט המיקרוסקופ בא במגע עם טיפת שמן הטבילה.

כעת הפעל את תאורת השדה הרחב ועבור למצלמה. מצב וידאו של איסוף נתונים. תמונת השדה הרחב של הדגימה תטושטש קשות בגלל נוכחות סורג השידור בנתיב הפליטה.

לכן, הנח מסנן מעבר פס עם רוחב מלא קטן בחצי מקסימום בנתיב האופטי שלפני סורג השידור. תרגם לאט את שלב התרגום בכיוון הציר האופטי תוך צפייה בתמונת התאים על מסך המצלמה עד להכנסת התאים למיקוד. תרגם את השלב לכיוון X או Y על מנת להביא תא בודד למיקום מיקוד קרן הלייזר.

כבה את מקור תאורת השדה הרחב והסר את מסנן נתיב הפס מנתיב הפליטה. בטל את חסימת קרן הלייזר לזמן קצר תוך צפייה בו זמנית באות המתקבל במערך ה-CCD. אם מתגלה אות פלואורסצנטי במערך ה-CCD בזמן שקרן הלייזר פוגעת בתא, בצע סריקת איסוף נתונים פלואורסצנטית מלאה של תא זה.

חיוני להשתמש באותם פרמטרי סריקה, במיוחד מספר הקווים ומדוע התוספת כפי שנקבעה בהליך הכיול שהודגם קודם לכן. חזור על תהליך רכישת נתוני מיקום התא והפלואורסצנטי עבור מספר רב של תאים המבטאים חלבון המחובר הן לתגי התורם והן לתגי המקבל. לאחר צבירת מספיק תמונות פלואורסצנטיות של תאים המבטאים חלבונים המתויגים בשני הקולטנים, חזור על כל התהליך עבור שני התאים המבטאים רק חלבונים המתויגים בבדיקות הפלואורסצנטיות של התורם ותאים המבטאים רק חלבונים המתויגים בבדיקות הפלואורסצנטיות המקבלות.

לבסוף, שחזר את כל הסריקות כדי לקבל פתרון ספקטרלי. מפות מרחביות של עוצמת פלואורסצנט XY עבור כל קבוצת נתונים באמצעות ההליך המתואר קודם לכן בשלושת האיורים הללו הן המפות המרחביות המתקבלות המחושבות משתי מדידות מיקרוסקופ פוטונים שנפתרו ספקטרלית שבוצעו על תא שמרים המבטא את הקולטן הסטרילי לגורם אלפא. מפות דו-ממדיות של אותות תורם ומקבל התקבלו מניתוח פרופילי הפליטה הספקטרליים שהתקבלו מכל מיקום בתא.

לעוצמות הקרינה מוקצים צבעים כוזבים על פי הערכים שלהם, והסולם מוצג כשיבוץ. לאחר מכן חושבה מפה דו-ממדית של יעילות השריגים לכאורה באמצעות תמונות KDA ו-KAD באמצעות הערכים שחולצו ממפת יעילות השריגים לכאורה של התא שזה עתה הראה שהוכנה תרשים היסטוגרמה. ערכי ה-EAPP הנמדדים של התא מיוצגים על ידי עיגולים.

הקו המלא האדום מייצג את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים הנמדדים באמצעות סכום פונקציות הסידן הבודדות המיוצגות על ידי קווים ירוקים מלאים. ניתוח ההיסטוגרמה, המתוארת בטקסט הפרוטוקול מאשר כי הקולטן הסטרילי של שני גורמי אלפא כל קומפלקס הרצועות לובש צורה של טטרמר בצורת RBA in vivo. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ביצוע ניסוי זה, חשוב לשמור על עוצמת מקור עירור נמוכה. חשוב להימנע מעירור מרובה של התורם על ידי פעימה אחת.