אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את האיכות התפקודית של תאי T חיוביים ל-CD8 בתגובה לאנטיגן מסוים, על ידי בדיקת יכולתם להרוג תאי מטרה in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי עירור של תאי T אפקטורים חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן באמצעות חיסון של עכברי מקבל. כשלב שני, תאי מטרה ראשוניים מקבלים ספציפיות או מטופלים בדרך אחרת, מה שמשלים את יצירת מערכת היעד האפקטורית הספציפית.

בשלב הבא, התאים המטרה מועברים לעכברי המקבל באמצעות העברה אדופטיבית רטרו-אורביטלית. כדי לבחון את ההריגה על ידי התאים האפקטורים in vivo, התקבלו תוצאות המראות האם האפקטורים הרגו חלק מהמטרות, בהתבסס על אנליזה של FACS לתאים שצבעו ב-CF SE. היי, שמי מרינה וורד.

אני סטודנט לתואר מתקדם במעבדה של Gary Splitter באוניברסיטת ויסקונסין מדסון. שיטה זו תספק תובנות לגבי הריגת CTL וניתן להחילה אותה גם על שגשוג והישרדות של תאים. את הליך ההעברה האדופטיבית (adoptive transfer) ידגים ד"ר Jerome harms, מדען מהמעבדה שלי. התחילו באופן אסטרטגי על ידי הגדרת מערכת מטרה אפקטורית ספציפית.

לדוגמה, בבדיקת CTL קלאסית in vivo, השתמשו בחיסון פפטיד מטוהר כדי לעורר תאי T ספציפיים חיוביים ל-CD8, והשתמשו באותו פפטיד כדי לדחוס (pulse) את תאי המטרה הסינגנאיים, ובכך צרו מערכת מטרה בעלת אפקט ספציפי. חטאו את משטח העבודה של מ বিজ্ঞানית (biosafety hood) כדי להבטיח את סטריליות ההזרקות. הכינו את חיסון הפפטיד על ידי הנחתו תחילה בתוך מבחנה של 2 mL.

50 µg של פפטיד מנוקה לתוך 100 µL של 10% DMSO ב-PBS לכל עכבר. לאחר מכן, הוסיפו כמות שווה של free unju לא שלם וקר מאוד, עם כדוריות של 1 mm לערבוב. אטמו את מכסה המבחנה עם פראפילם ושמרו את האימונוגן על קרח עד להזרקה.

השתמשו במערכת Bead Beater המכוונת למספר סיבובים לדקה (RPM) מקסימלי כדי לערבב את האמולסיה למשך שלוש דקות, והחזירו מיד את האמולסיה לקרח לאחר הערבוב. האמולסיה שנוצרה צריכה להיות בעלת סמיכות דומה למיונז. השאירו את האמולסיה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה או עד שבוע, וערבבו שוב אם ניכרת הפרדה במועד החיסון.

זהו את העכברים עבור חלק זה של הניסוי. השתמש במזרק של 1 ml ובמחט בכיול 20 gauge כדי לשאוב את האמולסיה. הקפד שלא לשאוב חרו지를 כדי להכין את תאי המטרה.

עכברים סינגנאיים נאיביים משמשים למטרות אלו; יש להקלי אותם בהתאם לתקנים המאושרים על ידי A-A-A-L-A-C. רססו את האזור הרלוונטי בגוף העכבר ב-70% ethanol כדי למזער את הסיכון לזיהום מהעכבר, מהפרווה או ממזהמים חיצוניים אחרים. באמצעות מספרי ניתוח, בצעו חתך קטן בעור בצדו השמאלי של העכבר.

משכו את מקערת העור כדי לחשוף את שק הפריטונאום ואת האיברים הפנימיים. חתכו דרך הפריטונאום תוך הקפדה לא לפגוע באף אחד מהאיברים שמתחתיו. אתרו את הטחול, שנמצא קרוב לפני השטח וצבעו אדום כהה.

שלפו בזהירות את הטחול והניחו אותו מיד בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter המכילה 10 milliliter של מצע RPMI שהוכן מראש, על קרח. המשיכו עם שאר העכברים. העבירו את הטחול ואת המצע להומוגנייזר רקמות מזכוכית.

טחנו את הטחול עד שכל הרקמה תאבד את צבעה. העבירו את התוצרים ההומוגניים דרך מסנן תאים של 70 micron לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. שטפו את ההומוגנייזר פעם אחת במצע טרי ושילבו עם הומוגנאט הטחול על ידי מזיגה דרך המסנן; צנטריפוגו את הדגימות בטמפרטורה של ארבעה °C ובמהירות של 1,300 rotations per minute.

במשך שבע דקות, העבירו את הנוזל העליון ושלחו אותו לסילוק. השביו את משקע התאים ב-10 milliliters של תמיסות ריאגנטים והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שבע דקות. השלימו לנפח של 50 milliliters עם מצע טרי, ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה.

חזרו על שטיפה זו. ספרו את התאים והעבירו מניה (aliquot) של 10 מיליון תאים לכל באער, בתוך פלטת תרביות רקמה בעלת 96 באערים עם תחתית עגולה.

דגרו בטמפרטורה של 4°C למשך שעה וחצי. העבירו לאינקובטור של 37°C ל-30 הדקות האחרונות. הכינו ריאגנט CFSE טרי בהתאם להוראות היצרן ומהלו אותו לריכוז עבודה של בין 0.5 ל-25 µM.

הכינו שני תמיסות CFSE הנבדלות זו מזו פי עשרה בריכוזן. השוו את תמיסות ה-CFSE בריכוז הנמוך והגבוה לטמפרטורה של 37 °C לפני הסימון. הוציאו את פלטת 96 הבארים של תאי המטרה מהאינקובטור ושקעו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

בטמפרטורת החדר, נערו את הפלטה כדי להסיר את ה-SUP natant. השעיקו את התאים ב-200 microliters של תמיסת CFSE בריכוז נמוך או גבוה, והדגירו למשך 15 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius. השקיעו את התאים על ידי סנטריפוגציה בטמפרטורת החדר, נערו את הפלטה כדי להסיר את ה-SUP natant, השעיקו את התאים ב-200 microliters של מצע טרי והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. השקיעו שוב את התאים על ידי סנטריפוגציה, השליכו את ה-supinate והשעיקו את המשקעים ב-50 microliters של PBS. הsetForeground חלק מהתאים המסומנים כבישגרי ביקורת לא-העברה (non-transfer controls) לצורך ניתוח הנתונים, וכן להרצה בציטומטר הזרימה עבור ההעברה האדופטיבית.

הוסיפו באר אחת של תאים המסומנים ב-CFSE בריכוז נמוך לבאר אחת של תאים המסומנים ב-CFSE בריכוז גבוה עבור כל עכבר. כך, ההזרקה המתקבלת תורכב מ-50% מטרות ספציפיות ו-50% תאים לא רלוונטיים ב-0.1 milliliter. כדי להקל על ההעברה האדופטיבית (adoptive transfer), הרדימו את העכברים שחוסנו בפפטיד והזריקו 0.1 milliliter של תאי מטרה מסומנים למקבל בדרך רטרו-אורביטלית.

לאחר שש שעות, בצעו הרדמה של העכברים המקבלים לצורך קצירת תאים, בודדו את הטחול של העכבר וטהרו את אוכלוסיית התאים לפי אותו פרוטוקול ששימש קודם לכן. בעת הכנת תאי טחול המטרה, זרעו תאים בריכוז של 1 מיליון לתא בתוך פלטת תרבית רקמות של 96 בארות בעלת תחתית עגולה, קבעו את התאים שהושבו ואלו שלא הועברו באמצעות פאראפורמאלדהיד, הריצו את הדגימות בציטומטר זרימה ונתחו את הנתונים. הצגה טיפית של תוצאות הרג ספציפי של תאים מוצגת בשתי דרכים.

פיסגה מופחתת הספציפית לאפיטופ בהיסטוגרמה של ה-fax והערך שחושב הם ליזיס ספציפי לתאים. כאן המספרים מציינים את אחוז התאים בעלי הפנוטיפ CFSE הגבוה או הנמוך בתאי ביקורת מסומני CFSE שלא הועברו, אשר השתקמו מעכבר מקבל שחוסן ב-PBS, ומתאים מסומני CFSE שהשתקמו משני עכברים מקבלים שחוסנו בפפטידים ספציפיים שונים. שימו לב לפיסגות המופחתות הספציפיות לאפיטופ המעידות על הריגה ספציפית של תאים.

לחלופין, ניתן להציג את התוצאות באופן גרפי כדי להצביע על ליזיס ספציפי לתאים עבור כל קבוצת עכברים: PBS, פפטיד A ופפטיד B. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לפתח בדיקת הרג CTL in vivo משלכם באמצעות עכברים.