הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

שמי דיאנה דאוד, ואני פרופסור במחלקה לביולוגיה התפתחותית ותאית ואנטומיה ונוירוביולוגיה באוניברסיטת קליפורניה באירווין. והיום אני הולך להדגים את ההכנה של תרביות עצביות ראשוניות מעוברי דרוזופילה. ומה שזה כרוך הוא למעשה הוצאת כל התאים משלב אמצע הגסטרו, עובר דרוזופילה, והכנסתם לתרבית תאים.

ולשם כך אנו משתמשים בתרבויות אלה הוא להבין באמת מהם הגנים והגורמים הסביבתיים החשובים לוויסות ריגוש חשמלי והעברה סינפטית בין נוירונים של דרוזופילה. כדי להתחיל בהליך זה, עלינו לאסוף עוברי דרוזופילה. לשם כך אנו לוקחים צלחות איסוף ביצים, מורחים עליהן מעט רסק שמרים.

זהו מצע נוח לזבובים הבוגרים להטיל את ביציהם. שמנו את הצלחות האלה על בקבוקים שמכילים אוכלוסייה של זבובים בוגרים, בדרך כלל מאה עד 200 זבובים. ואז נתנו לזבובים, זבובים בוגרים להטיל את ביציהם במשך כשעתיים-שלוש.

לאחר מכן אנו מסירים את צלחות איסוף הביציות, ואלה העוברים שבהם אנו משתמשים להליך התרבית. השלב הבא בהליך הוא דק ציפוי העוברים, וזה אומר שאנחנו למעשה מסירים את הקוריון. אנו עושים זאת על ידי שטיפת העוברים לתוך משפך Buechner שעליו יש לנו פיסת נייר סינון כך שהיא תופסת את העוברים.

אנו מאפשרים להם לשבת במשפך בוכנר בתמיסת אקונומיקה של 50%. תמיסת אקונומיקה זו של 50% לא רק ממיסה את הקוריון, אלא היא גם משמשת כחלק מהליך העיקור שלנו. אנחנו עושים את ההליך הזה למעשה לא במכסה המנוע, זה מחוץ למכסה המנוע, אז העוברים, ברגע שהם מרוקנים כלור, אנחנו שוטפים אותם לתוך צלחת פטרי.

הם למעשה, כאשר הקוריאן נעלם, קרום הוויל די דביק והוא יידבק יפה לצלחת פטרי. לאחר מכן אתה יכול לשפוך עליהם מים מזוקקים ולהסיר את המים המזוקקים פעמיים או שלוש ולמעשה פשוט לזרוק את המים והעוברים יידבקו לצלחת הפטרי. אל תשתמש בצלחת פלסטיק של תרבית רקמות.

הם לא דבקים בזה. אנו מתחילים את החלק הסטרילי של ההליך על ידי לקיחת צלחות פטרי של עוברים והכנסתם למכסה זרימה למינרית. אלה פתקי כיסוי של בלקו.

הם לא מצופים, אבל הם עברו חיטוי והם לא נשטפו. אנחנו מגלים שהם לא עובדים כל כך טוב. כשהם נשטפים, אנחנו מוציאים בדרך כלל ארבעה פתקי כיסוי ומכניסים אותם לצלחת פטרי אחת.

אז נייצר ארבע תרביות עובר בכל צלחת פטרי. אוקיי, אז צלחת הפטרי הזו בעצם מוכנה עבורנו להתחיל לגדל, ואני בדרך כלל מכין 12 תרבויות, 12 עד 16 תרבויות בכל פעם. בסדר? המדיה התרבותית שבה אנו משתמשים היא מדיום מוגדר פשוט יחסית.

זה בסיס A-D-M-E-M, ואנחנו מכינים את המדיום הנוזלי הזה פעם בשבועיים כך שהוא נשאר טוב במשך שבועיים במקרר. זה עבר עיקור. הוא עבר דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרון, ואז הוספנו חמישה תוספים למדיה.

הם מוכנים אחת לחודשיים ואז מוקפאים בכמויות שמתווספות ל -10 מיל מהמדיום הנוזלי. אז אנחנו פשוט מסירים את התוכן. אחרון, אז זה פשוט, אנחנו פשוט הופכים בעדינות את המדיה הזו כדי לערבב אותה ואנחנו מוכנים לצאת לדרך. בסדר.

הכל מסודר. יש לי את צלחת התרבות שלי מוכנה, זו או צלחת הפטרי שלי שיש בה ארבע תלושי כיסוי מוכנים לשימוש. ועכשיו אני הולך לקחת את המנה שלי עם עוברים ואני הולך, הם יושבים עכשיו במים המזוקקים.

אני הולך להסיר את המים המזוקקים רק על ידי ניעורם. ככה אני עושה את זה ישר לפח האשפה. ועכשיו אני הולך לשפוך בערך שתי טחנות של המדיה על העוברים האלה, ועכשיו הם מוכנים עבורי להחדיר את מחט הזכוכית לעוברים בודדים ולהוציא את התוכן.

אתה צריך שהתקשורת תהיה מבחוץ. ברור שאם היו שם מים, אז היה לך הלם אוסמוטי. עכשיו כדי להתכונן להכין את התרביות ממש לפני שאני מסיר את תכולת העובר, אני למעשה מניח את טיפת המיקרוליטר על פתקי הכיסוי.

אם אתה משאיר את זה יותר מדי זמן, אז ה-pH של המדיה משתנה. אוקיי, עכשיו אני הולך לשים טיפה של חמישה מיקרוליטר במרכז כל אחד מארבעת פתקי הכיסוי. למעשה חשוב שהטיפות הללו יישארו שלמות ככל האפשר.

אם המדיה מתפשטת על כל החלקת הכיסוי, אז התאים מצופים לחלק, שכבה דקה מאוד של נוזל קשה. אתה רוצה שהם יכניסו את התאים לטיפה עגולה ונחמדה של נוזל. כפי שאתם יכולים לראות שם, יש לנו ארבע טיפות עגולות ונחמדות של נוזלים מוכנות לשימוש.

ועכשיו אני אקח את אחת הפיפטות שמשכתי ואז אני פשוט מחבר אותה לצינור הפיפטה הזה. אתה יכול להשתמש בכל צינור שתרצה, אבל הדבר הטוב בצינור הזה, הוא למעשה מגיע עם צינור VWR מכויל 100 מיקרוליטר פיפטות. ובאלה יש לנו אטם גומי קטן.

אני יכול להכניס את מקטרת הפה, אני מתכוון לפיפטת הזכוכית לקצה הזה של הצינור. ואז כשאני שואב את תכולת העובר, אני לא מתכוון לעלות יותר מזה, האזור שבו הוא מתחיל להצטמצם. אז יש את האזור הענק הזה שמפריד ביני לבין המקום שבו נמצאים התאים באמצעות יניקת עכברים.

אז אין, אין בעיה עם זיהום. אם אתה שואב בטעות את התכולה לאזור זה, אז יהיו לך בעיות ענקיות של זיהום. במכסי הזרימה הלמינרית שלנו, יש לנו מיקרוסקופים מנתחים שהם על בסיס סקופי.

זה מאפשר לאור להיכנס מתחת לעובר, וזה מאפשר לנו לראות למעשה את התלם הצפאלי ואת המעי האמצעי, ואת הדמיון שתראו כשנסתכל על העוברים האמיתיים. וכך אנו למעשה בוחרים את השלב של העובר החשוב לתרבית כדי להסיר את תוכן העובר. אנו משתמשים בפיפטות זכוכית, מושכים בחולץ מיקרו אלקטרודות רגיל שאנו משתמשים בו כדי להכין את פיפטות הקלטת הטלאים שלנו.

לא ממש אכפת לנו מה ההגדרות. אנחנו מושכים פיפטות עדינות למדי כי אנחנו הולכים לשבור את הפיפטה בצלחת ליד העובר בגודל שאנחנו באמת רוצים. לאחר מכן אנו לוקחים את פיפטות הזכוכית הללו, מכניסים אותן דרך קרום הוויל של העובר, ומשתמשים בצינור יניקה מהפה המחובר לחלק האחורי של הפיפטה.

לאחר מכן אנו מחלצים את תכולת העובר כולו. לאחר מכן אנו מזיזים אותו, מוציאים את הפיפטה ועוברים לצלחת אחרת שיש בה תלוש כיסוי עם טיפת מדיה של חמישה מיקרוליטר. ואנחנו מוציאים את תכולת העובר לתוך אותה טיפה של חמישה מיקרוליטר.

פיזרנו למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפזר את התאים, ואז נתנו לכיסוי הזה להחליק לשבת בצלחת במשך כ-10 דקות לפני שהצפנו את הכלי בשתי טחנות של מדיה. צלחות התאים לאחר ציפוי מוכנסות לאינקובטור של 5% CO2. זה חשוב מאוד מכיוון שהמדיה שבה אנו משתמשים היא מדיה חוצצת ביקרבונט.

יש לנו כמה HEPs שם, אבל זה לא מספיק כדי לחצץ בסביבה האווירית. ולכן אתה צריך להשתמש בחממה של 5% CO2. עם זאת, זה חייב להיות בטמפרטורה נמוכה יחסית בסביבות 22 עד 23 מעלות זה אידיאלי.

אז אנחנו לוקחים חממת CO2 סטנדרטית שתשמש מתרביות יונקים ומחממים אותה ל-37 מעלות. מה שאנחנו עושים זה לכבות את התנור, הוא יושב במעבדה שלנו, ואנחנו יכולים לשים קרח בתחתית האינקובטור, וזה שומר על הטמפרטורה סביב 21 עד 25 מעלות. הטכניקה האחרת שאנו משתמשים בה היא שאנו לוקחים, שוב, את אחת מאינקובטורות החימום הסטנדרטיות הללו ומכניסים את החממה לחדר קירור.

אז אתה יכול למעשה לחמם את החממה בצורה יעילה למדי ל -23 מעלות אם טמפרטורת הסביבה היא טמפרטורת החדר הקרה. ולכן אלה שתי השיטות שבהן אנו משתמשים כדי לקבל חותם סטנדרטי, חותם יונקים לאינקובטור כדי לאפשר לעצמנו לשרוד. בסדר, זו תרבות שצופה לפני שעה באותה הגדלה שראינו מיד לאחר הציפוי שעה לאחר הציפוי.

כאן אנו רואים נוירונים שהתמיינו במשך כיומיים. בתרבות, הנוירובלסטים התפצלו פעם אחת או יותר ואז הולידו נוירונים, המרחיבים תהליכים היוצרים רשתות נוירוטיות חופפות נרחבות. כאן יש לנו שני גופי תאים שהם ראש בראש.

העליון מאריך תהליך בשעה 11, והתחתון מאריך תהליך בשעה חמש. אלה ההרחבות העיקריות שלהם. ואז אתם יכולים לראות שהם יוצרים ענפים עדינים יותר.

אלה נצמדים מאוד למצע הזכוכית, ויש תהליכים שאתה יכול לראות שמגיעים גם מתאים אחרים שחופפים אותם. ואלה אתרים של קשר סינפטי פוטנציאלי. היינו מדביקים אחד מהתאים הללו, ובאופן כללי, עם רמה זו של פיתוח תהליכים, יהיו להם זרמים סינפטיים פונקציונליים.

כעת התאים שלנו גדלים בתרבית 12 שעות לאחר הציפוי. יהיו להם תהליכים די יפים. הפיזיולוגיה הסטנדרטית שלנו, אנחנו מתחילים לעשות בערך אחד עד שניים לאחר התרבית.

ואתם יכולים לראות שהם למעשה ממשיכים לפתח תהליכים במשך ארבעת או חמישה הימים הבאים. והקלטנו מהתאים עד שבועיים בתרבית, אבל רוב ההקלטות שלנו הן בין יומיים לשישה ימים בתרבית עם התרביות האלה, אז זה עתה התכוננו מעוברי דרוזופילה באמצע שלב הגסטרו, יש לנו רשתות של נוירונים שמתקשרים בתרבית. אנו מסוגלים למעשה להסתכל על תכונות הירי של תאים אלה.

יש להם תכונות ירי מגוונות. הם יורים שוב ושוב, תאים מסוימים יורים שוב ושוב, תאים אחרים יורים בלידה, ותאים אלה הם בעיקר כולינרגיים או GABAergic. ואנחנו מסתכלים, אנחנו יכולים להסתכל על זרמים סינפטיים שמתווכים על ידי אלה, על ידי קולטני ניקוטין, Aach, H וקולטני GABA.