הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות
10 בינואר 2011
יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי Xenopus ביציות על ידי הזרקת RNA שליח. הפתרון תאיים במהלך הקלטות מהדק תיקון נשלטת על ידי מערכת טפטוף.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להקליט את הפעלת ערוץ BK במתח מבוקר, תוך שליטה בתמיסה התוך-תאית. זה מושג על ידי ביטוי תעלות BK ב-Xenopus Cytes על ידי הזרקת mRNA של ערוץ BK. השלב השני בהליך הוא הכנת מערכת הזלוף.
השלב השלישי של ההליך הוא יצירת חותם ג'יגה בין קרום הביצית לפיפטה התיקון. השלב האחרון בהליך הוא כריתת תיקון הממברנה. בסופו של דבר, תוצאות המתקבלות על ידי שימוש בטכנולוגיית מהדק תיקון יחד עם מערכת שפע מראות כי תעלות BK מופעלות על ידי שינויים במתח ובריכוז הסידן.
היי, אני ג'ין צ'ו יאנג ממעבדת ד"ר ג'יימי זוס באוניברסיטת וושינגטון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כולל שאלות הנוגעות למנגנון המולקולרי להפעלת תעלות יונים. אז בואו נתחיל.
השלב הראשון בהליך מתחיל כמה ימים לפני הידוק המדבקה ומשתמש ב-mRNA של ערוץ BK שתומלל במבחנה. לאחר קצירת ציטי Xenopus Lavu שלב 5 עד 6, הזרקו 0.05 עד 50 ננוגרם של mRNA של ערוץ BK לתוך ציט. באמצעות הזרקת ננו שני מזרק ננוליטר אוטומטי.
חזור על ההזרקה על תריסר ביציות עבור כל mRNA לאחר ההזרקה. שטפו את הביציות פעמיים באמצעות תמיסת ND 96. לאחר מכן הניחו את הביציות בצלחת תרבית ודגרו אותן בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך יומיים או יותר כדי לאפשר זמן לביציות לבטא את ערוץ ה-BK.
לאחר יומיים עד חמישה ימים של דגירה, הביציות אמורות לבטא תעלות BK ולכן הן כבר להידוק טלאי. לפני הטיפול בביציות, הגדר את כל מה שתצטרך להידוק תיקון, החל ממערכת הזילוף. המערכת המוצגת כאן היא קישור השסתום האוטומטי.
16 חנקן בלחץ של מערכת השפע דוחף תמיסות שפע ממאגרי התמיסה דרך צינורות השפע ולתוך עיפרון השפע והקצה. הזרימה של כל זרם של תמיסת שפע נשלטת על ידי שסתום מאגר אחד ושסתום אלקטרוני אחד. בפרוטוקול זה, אחד המאגרים אינו בלחץ ומתפקד כקולט פסולת, כמו גם כמנגנון שחרור לחץ.
ניתן להכין תמיסות זלוף בריכוזים שונים של סידן או מגנזיום לפני הניסויים. הוסף את תמיסות הזלוף למאגרים וסמן כל אחד מהם כדי לציין את ריכוז הסידן או המגנזיום. כדי להגדיר תחילה את מערכת השפע, חבר את הצינורות לעיפרון השפע.
לאחר מכן הפעל את בקר השסתומים האלקטרוני ופתח את השסתומים האלקטרוניים כדי להבטיח שהצינורות ועיפרון השפע נקיים מסתימה ובועות אוויר. דחוף מים נטולי יונים דרך כל צינור באמצעות מזרק מלא במים נטולי יונים. בשלב זה, חבר את הצינורות למאגרי התמיסה ופתח את שסתום בלון הגז למריחה בלחץ על חנקן.
פתח שסתום מאגר אחד כדי למלא את הצינור באחד מתמיסות המאגר. במידת הצורך, לחץ על שסתום המאגר כדי להסיר בועות בתמיסה. סגור את שסתום המאגר לאחר מילוי הצינור בתמיסה, מלא את קצה הזלוף במים והברג אותו על עיפרון הזלוף.
היזהר לא ללכוד בועות. בעת חיבור הקצה, תקן את עיפרון הזלוף לשלב האמבטיה באמצעות חימר דוגמנות, וודא שקצה השפע נמצא בחלל האמבטיה. מערכת השפע הוקמה כעת.
בשלב זה, הוסף מים דה-יונים לאמבטיה. ודא שקצה השפע שקוע במים. בדוק שכל תמיסת זלוף יוצאת מקצה הזלוף בצורה נכונה.
סגור את השסתום האלקטרוני המחובר לצינור של אספן הפסולת ופתח את השסתום לאחד מתמיסות השפע. מתחת למיקרוסקופ, התבונן בסילון נוזל השפע היוצא מקצה הזלוף. סגור את השסתום לתמיסת השפע הזו ופתח את השסתום לאספן הפסולת.
סילון השפע אמור כמעט להיעלם. חזור על אותה בדיקה עבור כל אחת מתמיסות הזילוף. לאחר שווידאתם שכל תמיסות הזלוף זורמות כהלכה, החליפו את המים נטולי היונים באמבטיה בתמיסת האמבטיה הרצויה.
עכשיו הגיע הזמן להקים את מכשיר ההקלטה. עליך לצפות מחדש את אלקטרודת ההקלטה הכסופה בכסף כלוריד לפני כל סשן הידוק תיקון. ראשית, הסר את חוט האלקטרודה ממחזיק הפיפטה וטבל את מחצית הקצה של חוט האלקטרודה בבקבוקון המכיל אקונומיקה טרייה למשך 15 דקות לפחות.
זה מפקיד שכבה של כלוריד כסף על החוט. שוטפים את חוט האלקטרודה במים נטולי יונים ומייבשים. לאחר מכן התקן את האלקטרודה הכסופה כלוריד בחזרה במחזיק הפיפטה.
כעת הפעל את המחשב שלך. חבר את מפתח החומרה ליציאת המדפסת של המחשב. מפתח החומרה חייב להיות מחובר כדי שתוכל להשתמש בתוכנת רכישת הנתונים, שהיא דופק HEA.
הפעל את המגבר והפעל את תוכנת רכישת הנתונים. דופק HEA. טען את קובץ הפרוטוקול והתאם את הגדרות התצורה כגון סולם הגירוי.
המטרה של התאמת הגדרות התצורה היא להבטיח שפוטנציאל הבדיקה שווה בדיוק לפוטנציאל הפקודה. עכשיו אנחנו מוכנים להכין את הביציות. הוציאו את הביציות מהחממה.
טבלו את הביצית בתמיסת הפשטה למשך חמש עד 10 דקות. תמיסת ההפשטה מנתקת את קרום הוויל מקרום הפלזמה, מה שמאפשר להפשיט את קרום הוויטל. לאחר חמש עד 10 דקות, הסירו בעדינות את קרום הוויטל מהביצית.
שימוש בשני מלקחיים. אתר דיווי OC הוא שביר ביותר ולכן יש להזיז אותו כמה שפחות. הקפידו למנוע חשיפת ביצית דווי לאוויר או לבועות, השתמשו בפיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה מספקת כדי להעביר את הביצית לאמבטיה.
התעלות על קרום הביציות חשופות כעת ומוכנות לפיפטה התיקון. משוך פיפטת תיקון על ידי הכנסת צינור נימי זכוכית לתוך מושך המיקרו פיפטה. התבונן בפיפטות תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את צורת הקצה וקוטר הפתח.
קוטר הפתיחה צריך להיות שניים עד ארבעה מיקרומטר כדי להפחית את הזרם הקיבולי במהלך ההקלטה, וכדי להבטיח קצה חלק, יש לצפות את הקצה בשעווה ולאחר מכן לירות. ללטש אותו במיקרוסקופ. מלא את קצה הפיפטה על ידי הנחת קצה הפיפטה בתוך תמיסת הפיפטה ומשיכת הבוכנה.
זה מרטיב את קצה הפיפטה. לאחר מכן, מלאו את הפיפטה שליש מלא בתמיסת פיפטה בעזרת מזרק. לאחר מכן הניחו את הפיפטה במחזיק הפיפטה עם האלקטרודה הכסופה, כלוריד הכסף בפנים.
ודא שאלקטרודת החוט נמצאת במגע עם תמיסת הפיפטה. השלב הבא הוא להוציא מדבקה מבפנים החוצה מהביצית המוכנה. ראשית, מצא את הקצה הברור של הביצית מתחת למיקרוסקופ.
בעזרת המניפולטור, הזיזו את פיפטת התיקון קרוב לביצית, וודאו שהיא שקועה. בתמיסת האמבטיה, רשום את התנגדות הסדרה של הפיפטה. ההתנגדות הסדרתית האידיאלית של פיפטת התיקון היא בין 1 ל-1.5 מילי-אוהם כאשר היא מלאה בתמיסת פיפטה ושקועה בתמיסת אמבטיה.
כעת דחף לאט את הפיפטה כנגד הביצית עד שההתנגדות שלה תכפיל את עצמה בערך. השג חותם ג'יגה אוהם על ידי הפעלת יניקה עדינה דרך הפה דרך צינור יניקה המחובר למחזיק הפיפטה. לאחר אישור שנוצר חותם ג'יגה, ייצב את המדבקה על ידי החזקתו במינוס 30 מילי-וולט למשך מספר דקות.
כדי להשיג מדבקה מבפנים החוצה, יש להוציא את המדבקה על ידי דחיפה מהירה של הפיפטה לתוך אתר ה-OO ולאחר מכן משיכתה בעדינות החוצה. התיקון מבפנים החוצה מוכן כעת להידוק תיקון. הזיזו את הפיפטה המחזיקה את המדבקה מבפנים החוצה למרחק של כ-100 מיקרון מפתח קצה הזילוף.
סגור את השסתום האלקטרוני לאיסוף פסולת ופתח את שסתום המאגר לתמיסת השפע הרצויה. התחל להקליט זרמים על פני התיקון. שנה את פתרונות המתח והשפע כרצונך.
כשתסיים להקליט, נקה את העיפרון והקצה של צינורות השפע על ידי דחיפה דרך מים נטולי יונים כדי למנוע סתימות. רישומי מהדק התיקון שהתקבלו כאן מראים שתעלות BK מהסוג הפראי על טלאי קרום ביצית מגיבות הן למתח והן לסידן. איור זה מציג רישום טלאי עם אפס סידן נומינלי בתמיסת הזילוף.
הגלים המרובעים מעל עקבות הזרם מציינים את המתח המופעל על התיקון. ארבעה מתחים הופעלו בטווח שבין 50 מילי-וולט ל-200 מילי-וולט במרווחים של 50 מילי-וולט. הזרם המרבי, כשני ננו אמפר התקבל במתח המרבי של 200 מילי-וולט.
עלייה זו במשרעת הזרם עם עליית המתח הצביעה על כך שההסתברות הפתוחה של ערוצי BK גדלה עם המתח. איור זה מציג את התגובה של התיקון מבפנים החוצה למתחים שונים. כאשר היה סידן מיקרו-מולרי אחד בתמיסת הזילוף, הוחלו שלבי מתח.
כמו באיור ההמשך, התגובה לשלב המתח של 200 מילי-וולט, התגובה העליונה גדלה לכשלושה ננו אמפר כאשר היה סידן בשמונה הפרפו בהשוואה לשני ננו אמפר ללא סידן. זה מצביע על כך שההסתברות הפתוחה של ערוצי BK גדלה בנוכחות סידן. לסיכום, הליך הידוק תיקון זה הראה שתעלות ה-BK היו תלויות מתח וסידן.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקליט את הפעלת תעלת הברזל באמצעות טכניקת מהדק תיקון יחד עם מערכת תדלוק מקצועית. כעת. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את הנוהל להקלטת הפעלת ערוצי BK באמצעות טכניקות פאץ' קלמפ בביציות של Xenopus. השיטה כוללת ביטוי של ערוצי BK באמצעות הזרקת mRNA ושליטה בתמיסה התוך תאית באמצעות מערכת השקיה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה תאית
- נוירוסיינס
רקע
- ערוצי BK הם ערוצי אשלגן מפעלי סידן בעלי מוליכות גבוהה.
- הבנת הפעלתם חיונית לתובנות לגבי איתות עצבי.
- טכניקות פאץ' קלמפ מאפשרות מדידות מדויקות של זרמים יוניים.
- ביציות של Xenopus משמשות בדרך כלל לביטוי ערוצי יונים בגלל גודלן הגדול.
מטרת המחקר
- להקליט את הפעלת ערוצי BK בתנאי מתח מבוקרים.
- לחקור את ההשפעות של מתח וריכוז סידן על פעילות ערוצי BK.
- לנצל מערכת השקיה לשמירה על תנאים תוך תאיים מבוקרים.
שיטות בשימוש
- הזרקת mRNA של ערוץ BK לביציות של Xenopus.
- הכנת מערכת השקיה לתמיסה התוך תאית.
- יצירת חותם גיגה בין קרום הביצית לבין צינורית הפאץ'.
- כריתת קטע הממברנה להקלטת זרמים יוניים.
תוצאות עיקריות
- ערוצי BK מופעלים על ידי שינויים במתח.
- ריכוז הסידן משפיע גם הוא על הפעלת ערוצי BK.
- טכנולוגיית פאץ' קלמפ מקליטת ביעילות זרמים יוניים מערוצי BK.
- מערכת ההשקיה מאפשרת שליטה מדויקת בתנאי הניסוי.
מסקנות
- המחקר מדגים בהצלחה את הפעלת ערוצי BK באמצעות טכניקות פאץ' קלמפ.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי תפקיד המתח והסידן בהפעלת הערוצים.
- מתודולוגיה זו יכולה לשמש למחקרים נוספים על התנהגות ערוצי יונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise interrogation of ion channel function under controlled voltage and intracellular conditions, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By isolating BK channel responses to pharmacological or genetic perturbations, it provides quantitative data for mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. The Xenopus oocyte expression system offers a scalable platform for early-stage assay development and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of BK channel targets by measuring voltage- and calcium-dependent activation under controlled intracellular perfusion.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through isolated membrane patches, reducing cellular complexity and improving signal-to-noise for target de-risking.
- Predictive Value: Generates dose-response relationships to ligands or mutants, informing structure-function relationships and lead selection criteria.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces stable, reproducible ion channel expression in oocytes, enabling standardized electrophysiological assays for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers precise current measurements (e.g., nanoamp-scale) that correlate with channel open probability, supporting hit validation and SAR studies.
- Platform Reuse: Adaptable to other ion channels and receptors via mRNA substitution, increasing throughput across target families.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: BK channels are implicated in smooth muscle tone, neurotransmitter release, and neuronal excitability—key areas for CNS, cardiovascular, and urology indications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct channel modulation versus off-target effects, improving target confidence.
- Translational Continuity: Data from oocyte systems inform preclinical model selection and biomarker strategy for voltage- or calcium-sensing modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification stages, providing functional confirmation after target identification and before medium-throughput screening campaigns.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by correlating channel activity with voltage/intracellular ligand conditions, supporting pathway validation.
- Screening: Enables secondary confirmation of primary hits via direct measurement of ion flux, improving hit-to-lead progression.
- Analytics: Generates quantitative current-voltage and dose-response relationships that inform potency, efficacy, and selectivity assessments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking channel function to physiological readouts relevant to indication biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability for ion channel targets across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into ion channel gating, reducing ambiguity in target validation and improving predictive confidence.
- Operational Value: Standardizes perfusion and patch clamp procedures, enhancing reproducibility across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering direct functional data on target engagement, reducing late-stage attrition due to target misvalidation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated biophysical properties and ligand sensitivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology (mRNA synthesis/injection), electrophysiology, and perfusion system setup.
- Depends on specialized instrumentation including patch clamp amplifiers, microinjectors, perfusion valves, and data acquisition software (e.g., HEA pulse).
- Necessitates standardization of oocyte preparation, incubation timing, and solution formulation across users and sites.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., mammalian cells) may require optimization of expression and sealing efficiency.
- Practical limitations include oocyte variability, seal stability, and perfusion solution exchange kinetics, which must be controlled for data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Introduction
1:10
Injecting mRNA into Oocytes
4:26
Preparing the Ag/AgCl Wire and the Data Acquisition Equipment
1:51
Preparing the Perfusion System
5:33
Stripping the Vitelline Membrane from the Oocyte
6:14
Preparing the Patch Pipettes
7:06
Obtaining an Inside-Out Patch
8:08
Patch Clamping
8:41
Recording of Wild-Type BK Channels on and Oocyte Membrane Patch
9:57
Conclusion
