הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקליט את הפעלת תעלות BK תחת מתח מבוקר, תוך בקרה על התמיסה התו-תאית. הדבר מושג תחילה על ידי ביטוי של תעלות BK בתאי Xenopus Cytes באמצעות הזרקת mRNA של תעלות BK. השלב השני של הפרוצדורה הוא הכנת מערכת הפרפוזיה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא יצירת giga seal בין ממברנת הביצית לבין פיפטת ה-patch. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא חיתוך פיסת הממברנה. בסופו של דבר, תוצאות שהושגו באמצעות טכנולוגיית patch clamp בשילוב עם מערכת perfusion מראות כי תעלות BK מופעלות על ידי שינויים במתח ובריכוז הסידן.

שלום, אני Jin Cho Young מהמעבדה של ד"ר Jamie Zus באוניברסיטת וושינגטון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כולל שאלות הנוגעות למנגנון המולקולרי של הפעלת תעלות יונים. אז בואו נתחיל.

השלב הראשון בהליך מתחיל מספר ימים לפני ביצוע ה-patch clamping ומשתמש ב-mRNA של תעלות BK שתומלץ in vitro. לאחר קצירת Xenopus Lavu Cytes בשלב חמישה עד שישה, מזריקים 0.05 עד 50 ננוגרם של mRNA של תעלות BK לתוך cyte. ההזרקה מתבצעת באמצעות nano inject two auto nanoliter injector.

חזור על ההזרקה בתריסר ציותים עבור כל mRNA לאחר ההזרקה. שטוף את הציותים פעמיים באמצעות תמיסת ND 96. לאחר מכן, העבר את הציותים לצלחת תרבית והדגר אותם בטמפרטורה של 18 °C למשך יומיים או יותר, כדי לאפשר לציותים לבטא את תעל BK.

לאחר יומיים עד חמישה ימי דגירה, האוציטות אמורות לבטא תעלות BK ולכן הן מוכנות לביצוע patch clamping. לפני הטיפול באוציטות, הכינו את כל שאר הציוד הדרוש ל-patch clamping, החל ממערכת הפרפוזיה. המערכת המוצגת כאן היא ה-automate valve link.

חנקן בלחץ ממערכת ה-profusion דוחף תמיסות profusion מתוך מאגרי התמיסות, דרך צינורות ה-profusion, אל תוך עט ה-profusion והחוד שלו. הזרימה של כל זרם של תמיסת profusion נשלטת על ידי שסתום מאגר אחד ושסתום אלקטרוני אחד. בפרוטוקול זה, אחד המאגרים אינו נמצא תחת לחץ ומתפקד כאספן פסולת, וכן כמנגנון לשחרור לחץ.

ניתן להכין תמיסות פרפוזיה בריכוזים שונים של סידן או מגנזיום לפני הניסויים. יש להוסיף את תמיסות הפרפוזיה למאגרים ולסמן כל אחד מהם כדי לציין את ריכוז הסידן או המגנזיום. כדי להקים את מערכת הפרפוזיה, חברו תחילה את הצינורות לעט פרפוזיה.

לאחר מכן, הפעל את בקר השסתומים האלקטרוני ופתח את השסתומים האלקטרוניים כדי לוודא שהצינורות ועיפרון הדיפוזיה נקיים מסתימות ובועות אוויר. דחף מים דה-יוניים דרך כל צינור באמצעות מזרק מלא במים דה-יוניים. בשלב זה, חבר את הצינורות למאגרי התמיסה ופתח את שסתום גליל הגז כדי להפעיל לחץ של חנקן.

פתחו שסתום מיכל אחד כדי למלא את הצינור באחד מתמיסות המיכל. במידת הצורך, לחצו על שסתום המיכל כדי להוציא בועות מהתמיסה. סגרו את שסתום המיכל לאחר שהצינור התמלא בתמיסה, מלאו את קצה הפרפוזיה במים והבריגו אותו על עיפרון הפרפוזיה.

הקפידו לא לכלוא בועות אוויר. בעת חיבור הקצה, קבעו את עיפרון הפרפוזיה לבמה של האמבט באמצעות חימר פיסולי, וודאו שקצה הפרפוזיה נמצא בתוך חלל האמבט. מערכת הפרפוזיה מוכנה כעת.

בשלב זה, הוסיפו מים דאיוניים לאמבט. ודאו שקצה הפרפוזיה טבול במים. בדקו שכל תמיסת פרפוזיה יוצאת מקצה הפרפוזיה באופן תקין.

סגרו את השסתום האלקטרוני המחובר לצינורית של אספן הפסולת ופתחו את השסתום של אחד מתסלולי הפרופוזיה. תחת המיקרוסקופ, צפו בסילון נוזל הפרופוזיה היוצא מקצה הפרופוזיה. סגרו את השסתום של אותו תסלול פרופוזיה ופתחו את השסתום של אספן הפסולת.

סילון הפרופוזיה צריך כמעט להיעלם. חזור על אותה בדיקה עבור כל אחד מתסלולי הפרפוזיה. לאחר שווידאת שכל תסלולי הפרפוזיה זורמים כראוי, החלף את המים דה-יוניים באמבטיה בתסלול האמבטיה הרצוי.

כעת הגיע הזמן להכין את מערך ההקלטה. יש לצפות מחדש את אלקטרודת ההקלטה מכסף בכלוריד הכסף לפני כל סשן של patch clamping. ראשית, הוצא את תיל האלקטרודה מתושבת הפיפטה וטבול את מחציתו התחתונה של תיל האלקטרודה בבקבוקון המכיל תמיסת הלבנה טרייה למשך 15 דקות לפחות.

פעולה זו שוקעת שכבת כסף כלוריד על התיל. שטפו את תיל האלקטרודה במים דה-יוניים וייבשו בעדינות בנייר סופג. לאחר מכן, התקינו את אלקטרודת הכסף/כסף כלוריד בחזרה במחזיק הפפיטה.

כעת הדליקו את המחשב. חברו את מפתח החומרה ליציאת המדפסת של המחשב. מפתח החומרה חייב להיות מחובר כדי שתוכלו להשתמש בתוכנה לרכישת נתונים, שהיא HEA pulse.

הפעל את המגבר והפעל את תוכנת רכישת הנתונים. HEA pulse. טען את קובץ הפרוטוקול וכייל את הגדרות התצורה, כגון קנה מידה של הגירוי.

המטרה של התאמת הגדרות התצורה היא להבטיח שפוטנציאל הבדיקה שווה בדיוק לפוטנציאל הפקודה. כעת אנו מוכנים להכין את האוציטים. הוצא את האוציטים מהאינקובטור.

טבלו את התבצית (oocyte) בתמיסת פילוף (stripping solution) למשך חמש עד 10 דקות. תמיסת הפילוף מפרידה את קרום הוויטלין (vitel membrane) מקרום התא, דבר המאפשר את הסרתו של קרום הוויטלין. לאחר חמש עד 10 דקות, הסירו בעדינות את קרום הוויטלין מהתבצית.

השתמשו בשני פינצטות. אתר ה-divi OC רגיש ביותר ולכן יש להזיזו במינימום הנדרש. תוך הקפדה למנוע חשיפה של ה-Devi oocyte לאוויר או לבועות, השתמשו בפיפט זכוכית מלא בתמיסה מספקת כדי להעביר את ה-oocyte לאמבט.

התעלות על ממבט הביצית חשופות כעת ומוכנות עבור פיפט ה-patch. הכין פיפט patch על ידי הכנסת צינור קפילרי מזכוכית למכשיר משיכת המיקרו-פיפטים. בחן את הפיפטים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את צורת הקצה ואת קוטר הפתח.

קוטר הפתיחה צריך להיות בין 2 ל-4 µm כדי להפחית את הזרם הקיבולי במהלך ההקלטה, וכדי להבטיח קצה חלק, יש לצפות את הקצה בשעווה ולאחר מכן לחמם בלהבה. יש ללטש אותו תחת מיקרוסקופ. מלאו את קצה הפיפטה על ידי הנחת קצה הפיפטה בתוך תמיסת הפיפטה ומשיכה של הבוכנה.

פעולה זו מרטיבה את קצה הפיפטה. לאחר מכן, מלא את הפיפטה עד לשליש מנפחה בתמיסת פיפטה באמצעות מזרק. לאחר מכן, הנח את הפיפטה במחזיק הפיפטות כאשר אלקטרודת הכסף/כסוף כלוריד נמצאת בתוכה.

וודאו כי אלקטרודת התיל נמצאת במגע עם תמיסת הפ pipette. השלב הבא הוא חיתוך של inside out patch מהאווקיציט שהוכן. ראשית, אתרו את הקצה השקוף של האוקיציט תחת המיקרוסקופ.

באמצעות המניפולטור, העבירו את פיפטת הפאץ' קרוב לאוציט, וודאו שהיא טבולה. בתוך תמיסת האמבט, רשמו את התנגדות הטור של הפיפטה. התנגדות הטור האידיאלית של פיפטת הפאץ' היא בין 1 ל-1.5 milli ohms כאשר היא מלאה בתמיסת פיפטה וטבולה בתמיסת אמבט.

כעת דחפו באיטיות את הפ pipette כנגד ה-oocyte עד שההתנגדות שלו תוכפל בקירוב. השגו אטם giga ohm על ידי הפעלת יניקה עדינה עם הפה דרך צינור יניקה המחובר למחזיק ה-pipette. לאחר אישור היווצרות ה-giga seal, ייצבו את ה-patch על ידי החזקתו במינוס 30 millivolts למשך מספר דקות.

כדי להשיג patch הפוך (inside out), גזרו את ה-patch על ידי דחיפה מהירה של הפפיטה עמוק יותר אל תוך אתר ה-OO ולאחר מכן משיכה עדינה שלה החוצה. ה-patch ההפוך מוכן כעת ל-patch clamping. העבירו את הפפיטה המחזיקה את ה-patch ההפוך למרחק של כ-100 microns מפתח טיפ הפרפוזיה.

סגור את השסתום האלקטרוני לאיסוף הפסולת ופתח את שסתום המאגר עבור תמיסת הפרופוזיה (profusion) הרצויה. התחל בהקלטת זרמים לאורך הפאץ' (patch). שנה את המתח ואת תמיסות הפרופוזיה לפי הצורך.

בסיום ההקלטה, נקו את צינורות הפרפוזיה והקצה על ידי דחיפת מים דה-יוניזים כדי למנוע סתימות. הקלטות ה-patch clamp שהתקבלו כאן מראות כי תעלות BK מסוג בר (wild type) על טלאי ממברנה של אווציט מגיבות הן למתח והן לסידן. איור זה מציג הקלטת patch עם ריכוז סידן נומינלי של אפס בתמיסת הפרפוזיה.

גלי הרבוע שמעל עקומות הזרם מציינים את המתח שהופעל על ה-patch. הופעלו ארבעה מתחים בטווח שבין 50 millivolts ל-200 millivolts במרווחים של 50 millivolts. הזרם המקסימלי, כ-two nano amps, התקבל במתח המקסימלי של 200 millivolts.

עלייה זו באמפליטודת הזרם עם העלייה במתח הצביעה על כך שההסתברות לפתיחה של ערוצי BK עלתה עם המתח. איור זה מציג את התגובה של ה-inside out patch למתחים שונים. כאשר התמיסה בפרפוזיה הכילה 1 µM סידן, הופעלו מדרגות מתח.

כפי שמוצג באיור הקודם, בתגובה למדרגת מתח של 200 millivolt, התגובה העליונה עלתה לכ-3 nano amps כאשר נוכח סידן ב-Perfu eight, בהשוואה ל-2 nano amps ללא סידן. דבר זה מעיד על כך שההסתברות לפתיחה של תעלות BK עלתה בנוכחות סידן. לסיכום, הליך patch clamping זה הראה כי תעלות BK תלויות במתח ובסידן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן תיעוד הפעלת תעלת הברזל באמצעות טכניקת patch clamp בשילוב עם מערכת הזנה מקצועית. כעת, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.