יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי
21 בדצמבר 2010
בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.
מדעני מוח חוקרים את תפקוד המוח באמצעות בדיקה של האופן שבו נוירונים במוח מתקשרים. כאן, שינויים בפעילות החשמלית של נוירון בודד מעוררים על ידי החלת מוליכות הנשלטת ניסיונית באמצעות טכניקת ה-dynamic clamp. ראשית, נחתכים פרוסות דקות של המוח והן נשמרות בתא אינקובציה מלא בנוזל מוחי גרמי מלאכותי.
לאחר מכן מעבירים פרוסה למערכת הקלטה מסוג patch clamp. נבחר נוירון ולאחר מכן מבצעים patch באמצעות אלקטרודת הקלטה תוך שימוש במחשב dynamic clamp המחובר למגבר ההקלטה. מיושם בתוך התא מוליכות של קולטן NMDA.
ההקלטות שהתקבלו מראות פרץ של פוטנציאלי פעולה, דבר המצביע על כך שהפעלת רספטורי NMDA היא מנגנון תאי אחד שדרכו נוירונים דופמינרגיים יכולים לייצר פרצים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות נוכחיות, כגון הזרקת זרם ישר או טיפול פרמקולוגי, הוא היכולת לקבוע במדויק את השפעותיה של הפעלת רספטור שהוגדר ניסויית על הפעילות החשמלית של נוירון חי. לאחר הוצאה מהירה של המוח מחולדה מסוג Bragg dolly שהורדמה, נחתכו פרוסות מוח אופקיות בעובי 240 micrometer באמצעות מיקרוטום רוטט.
בעת חיתוך הפרוסות, השתמשו בפיפט העברה כדי להניח אותן בתא דגירה בטמפרטורה של 32 degree Celsius הממולא בנוזל צרבולי חוטר מלאכותי, עד למועד ביצוע ניסויי ההקלטה. מערך ההקלטה התוך-תאי מורכב ממיקרוסקופ עם עדשות המוגדרות להדמיית ניגודיות גרדיאנט, מסך, מערכת פרפוזיה, מגבר multi clamp 700 B, ממיר אנלוגי לדיגיטלי, מיקרו-מניפולטור וראש בקרה. מחשב Mac Pro מריץ את תוכנת רכישת הנתונים, Axo Graph X ותוכנת multi clamp commander. בסמוך למערך ההקלטה התוך-תאי ולמחשב ה-Mac Pro נמצא מחשב Sun Microsystems המריץ Linux בזמן אמת, יחד עם הממיר האנלוגי-דיגיטלי שלו, אשר ישמש לטכניקת ה-dynamic clamp.
מתקן ההקלטה התו-תאי צריך לבצע פרפוזיה של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס. אם הפרוסה להקלטה הוכנה באופן אופקי, השתמש בפ pipette העברה כדי להניח אותה בצלחת פטרי עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי, ובאמצעות כלי חיתוך חתוך את הפרוסה לשניים לאורך קו האמצע. לאחר מכן, לצורך ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, השתמש ב-pipette כדי להעביר את הפרוסה למתקן ההקלטה התו-תאי.
באמצעות עדשה אובייקטיבית של 40x, ניתן להבחין בתא העצב המטרה; נראה כאן נוירון דופמינרגי בודד מה-substantia nigra. שימו לב לסומה בעלת צורה אליפטית עם שני דנדריטים מתוחים. באמצעות מכשיר משיכה אלקטרוני של פיפטות מיקרו P 97, משכו אלקטרודות עם התנגדות קצה של 4 עד 10 mega ohms.
בשלב הבא, מלאו אלקטרודה בתמיסה פנימית באמצעות מחט של מזרק microfill. הכניסו את האלקטרודה המלאה אל תוך חצי התא, המחובר לשלב הראש (head stage) של המגבר, בעזרת מזרק המחובר לחצי התא באמצעות צינור קצר. הפעילו לחץ חיובי קטן על אלקטרודת ההקלטה.
תחת הדרכה חזותית, הנמיקו את האלקטרודה על הנוירון המטרה. שקע ייראה על פני השטח של התא. הפילו כמות קטנה של לחץ שלילי כדי ליצור giga seal על הנוירון הרצוי.
בצעו יניקה באמצעות הפה כדי לפרוץ את האטם. פעולה זו מהווה רישום של תא שלם (whole cell recording). לאחר פריצת האטם, השתמשו בממשק התוכנה multi clamp commander כדי להעביר את המגבר למצב current clamp, שבו לא ניתן להזריק זרם.
כדי להחיל מוליכות NMDA בתא זה, התחילו בהפעלת תוכנת RTXI במחשב ה-dynamic clamp. לאחר מכן, טענו לזיכרון מודל שנכתב במיוחד המכיל קולטן NMDA. ברגע שהמודל ייטען לזיכרון RTX, אני אחשב את הזרם שיוזרק לתא בזמן אמת באמצעות המשוואה המוצגת כאן, כאשר G-N-M-D-A היא המוליכות הרצויה ב-nanos, Semens שנקבעה לאפס nanos.
בברירת המחדל של Semens, MG הוא ריכוז המגנזיום. E-N-M-D-A הוא פוטנציאל ההיפוך של רספטור ה-NMDA, שנקבע לאפס מיליוולט, ו-VM הוא פוטנציאל הממברנה של התא כפי שנמדד מהמגבר במיליוולט. כעת, באמצעות כבל BNC סטנדרטי, חבר את המוצא ממחשב ה-dynamic clamp לכניסת הפקודה (command input) של המגבר באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי.
הגדירו את המגבר למצב current clamp סטנדרטי (ic) באמצעות ממשק התוכנה multi clamp commander. מערכת ה-RTXI הוגדרה כך שתקבל את המוליכות הרצויה GFT מאות מתח מתוכנת רכישת הנתונים Axo Graph X. כאן אנו מבצעים פרוטוקול AXO Graph X פשוט שבו מופעל על התא שלב מוליכות של 40 nano Siemens למשך שנייה אחת.
פרץ של פוטנציאלי פעולה מעורר בתגובה למדרגת מוליכות באמצעות המערך המתואר בסרטון זה; בוצעה הקלטה מסומתית של תא שלם מנוירון דופמינרגי ב-substantial nire pars compacta. תאים דופמינרגיים יורים בדרך כלל באופן ספונטני בשיעורים נמוכים ובדפוס דמוי קוצב לב. ניתן לעורר פרץ של פוטנציאלי פעולה על ידי יישום פאזי של מוליכות קולטן NMDA באמצעות dynamic clamp.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להחיל מוליכות NMDA בתוך נוירון דופמינרגי חי בתוך פרוסה מבודדת של המוח. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקה זו עבור כל סוג תא שניתן להקליט באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות. באופן דומה, ניתן להרחיב את השימוש ב-dynamic clamp כדי לחקות את ההשפעות החשמליות של מגוון רחב של סוגי רצפטורים.
אנו מקווים שסרטון זה היה שימושי בהדגמת מהי טכניקת ה-dynamic clamp וכיצד אנו משתמשים בה במעבדה שלנו. תודה שצפיתם.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את יישום המוליכות אל תוך נוירון דופמינרגי באמצעות טכניקת ה-dynamic clamp בחתכי מוח של חולדה. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על הפעלת רצפטורים ועל השפעותיה על הפעילות הנוירונלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- תקשורת עצבית
רקע
- נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד המוח.
- טכניקת ה-dynamic clamp משפרת את חקר הפעילות הנוירונלית.
- הבנת הפעלת קולטני NMDA חיונית למחקר במדעי העצב.
- טכניקה זו מאפשרת מניפולציה של מוליכות נוירונלית בזמן אמת.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקת ה-dynamic clamp בנוירונים דופמינרגים.
- לבחינת ההשפעות של מוליכות קולטן NMDA על פריקה נוירונלית.
- לספק מדריך מעשי לחוקרים בתחום האלקטרופיזיולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פרוסות מוח של חולדה לצורך הקלטה.
- שימוש במערכת הקלטה מסוג patch clamp להגעה לנוירונים.
- החלת מוליכות NMDA באמצעות תוכנת dynamic clamp.
- ניטור בזמן אמת של פוטנציאלי פעולה נוירונליים.
תוצאות עיקריות
- החלת מוליכות NMDA עוררה פרצי פוטנציאלי פעולה.
- הוכח כי טכניקת ה-dynamic clamp יעילה.
- סופקו תובנות לגבי תפקידם של רצפטורי NMDA בנוירונים דופמינרגיים.
- הודגם כי ניתן להחיל שיטה זו על סוגי תאים שונים.
מסקנות
- טכניקת ה-dynamic clamp היא כלי רב עוצמה לחקר פעילות נוירונלית.
- היא מאפשרת בקרה מדויקת על הפעלת רצפטורים בנוירונים חיים.
- שיטה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי תקשורת נוירונלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכנולוגיית ה-Dynamic clamp מאפשרת סימולציה מדויקת ובזמן אמת של מוליכות המתווכת על ידי רצפטורים בנוירונים חיים, ובכך היא תומכת ישירות בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרה (target validation) בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למדעי העצבים. על ידי מתן אפשרות לחקירה מבוקרת של תפקוד רצפטורי NMDA בנוירונים דופמינרגיים, גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודת המפנה של תיקוף המטרה. יכולת ההסתגלות של השיטה לסוגי תתי-נוירונים שונים ממצבת אותה כהסמכה רב-פעמית עבור פורטפוליו של נוירו-פארמקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של השערות ספציפיות לקולטן במערכות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי בידוד תרומותם של קולטני NMDA לדפוסי פריקה נוירונליים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין השפעות המתווכות על ידי קולטנים לבין גרייה לא ספציפית.
- משפר את הביטחון החזוי להעמדת תרכובות נוירואקטיביות המכוונות למסלולים דופמינרגיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מודלים נוירונליים שעברו תיקוף עבור תהליכי סינון תרכובות בהמשך הדרך.
- מאפשר מדידה כמותית וניתנת לשחזור של פרצי פוטנציאל פעולה בתגובה למדרגות מוליכות מוגדרות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי אספקת בקרה זמנית ומרחבית מדויקת של הפעלת הקולטן.
- מאפשר התאמה ניתנת להרחבה לסוגי רספטורים ולאוכלוסיות נוירונים אחרות לצורך שימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין פעילות עצבית במערכת vitro לבין מנגנונים רלוונטיים למחלה המעורבים בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספק רצף מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות נוירו-פארמקולוגיות.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מותאם-סיכון על ידי הבהרת התרומות הספציפיות של רספטורים לפנוטיפים נוירונליים.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת בחינה של מטרות נוירונליות המונחית על ידי היפותזה, תוך תמיכה בסריקות המשך ובמחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בזמן אמת והבהרת מסלולים עבור פעילות נוירונלית המתווכת רצפטורים.
- סריקה: מספקת פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של פרצי פוטנציאל פעולה ומערכות יחסי מוליכות-תגובה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים של מחלות במערכת העצבים המרכזית (CNS) כאשר הם תואמים למערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה לחקר רצפטורים וסוגי תאים מגוונים בפורטפוליים של מדעי העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות נוירונליות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של go/no-go ובניהול יעיל של הון בפורטפוליו מו"פ של תרופות נוירולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של נכסים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך התאמה לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה של patch clamp ובתפעול תוכנות dynamic clamp.
- דורש מיכשור ייעודי, כולל חומרה לרכישת נתונים בזמן אמת ולהזרקת מוליכות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי נוירונים שונים ולמודלים של רצפטורים באמצעות התאמה מתאימה של התוכנה.
- מוגבל בשל הצורך בהכנות חיות של חיתוכי מוח ובמיומנות טכנית ברישומי whole-cell.
