Name: יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: למדו כיצד להחיל מוליכות NMDA על נוירונים דופאמינרגיים במוח העכברוש באמצעות טכניקת הצמד הדינמי. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בהפעלת קולטנים ובחינת פעילות חשמלית של תאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי MH084494 (CJL), ו MH079276 ו NS060658 (CAP).

1. פורסים הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות המוח באמצעות microtome רוטט. הכנו 240 מיקרומטר פרוסות המוח התיכון אופקי isoflurane-anethetized Sprague-Dawley חולדה (Charles River Laboratories) באמצעות microtome רוטט (Microm HM 650V) בהתאם מאוניברסיטת טקסס טיפול בבעלי חיים סן אנטוניו מוסדיים ועדת שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו את הפרוסות בתא דגירה עד שאתה מוכן להקליט. אנו משתמשים מיכל הדגירה מחומם ל 32 מעלות צלזיוס, מלאות בנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; מ"מ): 126 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 דקסטרוז, 25 NaHCO 3, 1.3 חומצה אסקורבית, 2.4 pyruvate נתרן 0.05 גלוטתיון. </li></ol> 2. אלקטרו הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפרוסה לקידוח הקלטה תאיים שבו הנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) בשעה 35 ° C מתבצע perfused. אנו משתמשים aCSF זהה 1.2 פרט לכך 2mm MgCl 2 היה בשימוש, גלוטתיון הושמט. עבור פרוסות מוכן אופקית, אנחנו בדרך כלל לחצות את הפרוסה לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את נוירון היעד. אנו substantia nigra דמיינו אדם נוירונים דופאמינרגיים עם מערכת לעומת שיפוע הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודה באמצעות אלקטרודה חולץ אלקטרוניים. אנו למשוך אלקטרודות עם התנגדות טיפ של 4-10 MΩ באמצעות micropipette P97 חולץ (החברה סאטר Instrument). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו אלקטרודה עם פתרון הפנימי הרצוי. אנו משתמשים תמיסה המכילה (מ"מ): 138-K-gluconate, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0.4 Na-GTP. הפתרון הפנימי הותאם ה-pH של 7.3 1M באמצעות KOH ו osmolarity של 270-275 mOsms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חותם gigaohm אל הנוירון הרצוי. שבר את החותם עם יניקה. זה מהווה הקלטה התא כולו. מגבר 700B Multiclamp היה בשימוש בתצורת שלנו. המגבר אמור להיות ממוקם במצב הנוכחי תפס את 'אני = 0 ". </li></ol> 3. מוליכות Application עם הצמד הדינמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RTXI (www.rtxi.org) הוצא להורג במחשב מהדק דינמי. המודל נכתב מותאם אישית המכיל הקולטן NMDA היה טעון לזיכרון. הנוכחי להיות מוזרק לתוך התא בזמן אמת מחושב על ידי המשוואה הבאה: אני NMDA =-g-NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3.57) * e (-V מ * 0.062))] * (V m - E-NMDA) שבו גר NMDA הוא המוליכות הרצויה (NS; כברירת מחדל, NS 0), [Mg] הוא ריכוז מגנזיום (מוגדר 1.5 מ"מ בדוגמא שלנו למטה), E-NMDA הוא פוטנציאל היפוך של הקולטן NMDA (מוגדר mV 0), ו-V m הוא פוטנציאל הממברנה של התא נמדד מן המגבר (ב millivolts). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלט מהמחשב מהדק דינמי היה קשור קלט הפיקוד של המגבר דרך ממיר-to-Analog דיגיטליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגבר הושם במצב מהדק הנוכחי "IC". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן המוליכות הרצויה הקולטן NMDA לתוך RTXI (למשל 40nS). אתה צריך לראות את פרץ phasic של פוטנציאל פעולה. לחלופין, מוליכות יכול להינתן RTXI באמצעות פלט אנלוגי (איור 1 א ', ג'(t) "). גורם דרוג המתאים יש להשתמש בתוך RTXI להמיר את האות וולט כדי סימנס. </li></ol> 4. נציג תוצאות התקנה מוצלחת עבור יישום של מוליכות באמצעות מהדק דינמי מוצג באיור 1 א. באמצעות התקנה זו, עשינו הקלטה תא סומטי כל נוירון דופאמין ב nigra substantia Pars compacta. תאים דופאמינרגיים בדרך כלל אש באופן ספונטני במחירים נמוכים עם דגם דמוי קוצב לב. פרץ של פוטנציאל הפעולה יכול להיות מעוררים על ידי יישום phasic של מוליכות קולטן NMDA עם מהדק דינמי (איור 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: יישום מוליכות קולטן NMDA באמצעות טכניקה מהדק דינמי. ההתקנה A. חומרה הממחישות את הקשר בין המתקן את ההקלטה תאיים והמחשב מהדק דינמי. ב 'פרץ של פוטנציאל פעולה הוא עורר על ידי יישום של מוליכות הקולטן NMDA 40nS בהקלטה תא שלם מתוך nigra substantia Pars compacta דופאמין נוירון.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה מהדק דינמי הפגינו כאן משפר עם הטכניקה המסורתית של הזרקת זרם ישר על ידי מתן הנסיין לחקות את ההשפעות החשמלית של הפעלת הקולטן. בסרטון הזה, אנו הראו כי ניתן להוסיף את ההשפעות של הפעלת הקולטן NMDA לפעילות ספונטנית של נוירון דופאמין, כלומר פרץ של פוטנציאל הפעולה הם מעוררים. בשל הגמישות של יישום חומרה / תוכנה, מגוון רחב של הרחבות ניתן להשתמש. השלט של הזרם המוזרק ניתן להעביר משלילי לחיובי, המייצג תרחיש שבו את ההשפעות של הקולטן מופעל יוסר נוירון. נוירונים דגם, המיוצגת בדמות סדרה של משוואות דיפרנציאליות, ניתן לפתור מספרית ולאפשר הנסיין לחקור רשתות קטנות.

<table><tbody><tr><td>K-gluconate anhydrous</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(B-amin&amp;#8211;thyl ether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacetic acid</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>ריאגנט</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>ריאגנט</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Anhydrous</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ריאגנט</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>ריאגנט</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Olympus BX51WI (עם עדשה 40x)</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ממירים A/D</td><td>ציוד</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B עם רכיב CV-7B headstage</td><td>ציוד</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות P-97 Flaming/Brown</td><td>ציוד</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי מזרק Microfil</td><td>ציוד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>ציוד</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסך</td><td>ציוד</td><td>Triview</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של מוליכות קולטן nmda במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

מדעני מוח ללמוד את תפקוד המוח על ידי חוקרת כיצד הנוירונים במוח מתקשרים. חוקרים רבים להסתכל על שינויים בפעילות החשמלית של אחד או יותר נוירונים בתגובה קלט בניסוי מבוקר. הפעילות החשמלית של הנוירונים יכול להיות מוקלט פרוסות המוח מבודד באמצעות מהדק טכניקות תיקון עם micropipettes זכוכית. באופן מסורתי, הנסיינים יכולים לחקות קלט עצביים בהזרקה ישירה של זרם דרך גירוי פיפטה, חשמל של תאים אחרים או קשרים axonal שנותרו פרוסה, או מניפולציה תרופתי על ידי קולטנים הממוקמים בקרום התא של הנוירונים המוקלט. הזרקה ישירה הנוכחי יש את היתרונות של העברת צורת הגל הנוכחי מראש עם דיוק גבוה הזמני באתר של ההקלטה (בדרך כלל סומה). עם זאת, זה לא משנה את ההתנגדות של הקרום עצביים כמו תעלות יונים לא נפתחים פיזית. הזרקת נוכחי בדרך כלל מעסיקה פולסים מלבני ולכן אינו מודל קינטיקה של תעלות יונים. לבסוף, הזרקת הנוכחי לא יכול לחקות את השינויים הכימיים בתא המתרחשת עם פתיחת תעלות יונים. רצפטורים יכול להיות מופעל באופן פיזי על ידי גירוי חשמלי או תרופתי. הנסיין יש דיוק טוב הזמני של הפעלת קולטן עם גירוי חשמלי של הפרוסה. הדיוק המרחבי עם זאת, אין הוא מוגבל של הפעלת קולטן ואת האופי המדויק של מה מופעל על הגירוי אינו ידוע. בעיה זו האחרונה ניתן להקל באופן חלקי על ידי סוכני תרופתי ספציפי. למרבה הצער, במהלך תקופה של הפעלת סוכנים תרופתי הוא איטי בדרך כלל ואת הדיוק המרחבי של תשומות על התא שנרשם אינו ידוע. הטכניקה מהדק דינמי מאפשר הנסיין לשנות הנוכחי עבר ישירות אל תוך התא על סמך משוב בזמן אמת של פוטנציאל הממברנה של התא (רובינסון Kawai 1993, שארפ et al, 1993a, b;. לבדיקה, לראות פרינץ et al. 2004). זה מאפשר הנסיין לחקות את השינויים החשמליים המתרחשים באתר ההקלטה בתגובה הפעלת הקולטן. בזמן אמת שינויים הנוכחית להחיל נקבעים על ידי משוואה מתמטית מיושם בחומרה. השתמשנו לאחרונה את הטכניקה מהדק דינמי לחקור את הדור של פרצי הפוטנציאלים לפעולה על ידי הפעלת phasic של קולטני NMDA בנוירונים דופאמינרגיים של nigra substantia Pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליכים הדרושים כדי להחיל מוליכות הקולטן NMDA לתוך נוירון דופאמין.

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

מדעני מוח חוקרים את תפקודי המוח באמצעות בדיקה של האופן שבו נוירונים במוח מתקשרים. חוקרים רבים בוחנים שינויים ב...

מדעני מוח חוקרים את תפקוד המוח באמצעות בדיקה של האופן שבו נוירונים במוח מתקשרים. כאן, שינויים בפעילות החשמלית של נוירון בודד מעוררים על ידי החלת מוליכות הנשלטת ניסיונית באמצעות טכניקת ה-dynamic clamp. ראשית, נחתכים פרוסות דקות של המוח והן נשמרות בתא אינקובציה מלא בנוזל מוחי גרמי מלאכותי.לאחר מכן מעבירים פרוסה למערכת הקלטה מסוג patch clamp. נבחר נוירון ולאחר מכן מבצעים patch באמצעות אלקטרודת הקלטה תוך שימוש במחשב dynamic clamp המחובר למגבר ההקלטה. מיושם בתוך התא מוליכות של קולטן NMDA.ההקלטות שהתקבלו מראות פרץ של פוטנציאלי פעולה, דבר המצביע על כך שהפעלת רספטורי NMDA היא מנגנון תאי אחד שדרכו נוירונים דופמינרגיים יכולים לייצר פרצים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות נוכחיות, כגון הזרקת זרם ישר או טיפול פרמקולוגי, הוא היכולת לקבוע במדויק את השפעותיה של הפעלת רספטור שהוגדר ניסויית על הפעילות החשמלית של נוירון חי. לאחר הוצאה מהירה של המוח מחולדה מסוג Bragg dolly שהורדמה, נחתכו פרוסות מוח אופקיות בעובי 240 micrometer באמצעות מיקרוטום רוטט.בעת חיתוך הפרוסות, השתמשו בפיפט העברה כדי להניח אותן בתא דגירה בטמפרטורה של 32 degree Celsius הממולא בנוזל צרבולי חוטר מלאכותי, עד למועד ביצוע ניסויי ההקלטה. מערך ההקלטה התוך-תאי מורכב ממיקרוסקופ עם עדשות המוגדרות להדמיית ניגודיות גרדיאנט, מסך, מערכת פרפוזיה, מגבר multi clamp 700 B, ממיר אנלוגי לדיגיטלי, מיקרו-מניפולטור וראש בקרה. מחשב Mac Pro מריץ את תוכנת רכישת הנתונים, Axo Graph X ותוכנת multi clamp commander. בסמוך למערך ההקלטה התוך-תאי ולמחשב ה-Mac Pro נמצא מחשב Sun Microsystems המריץ Linux בזמן אמת, יחד עם הממיר האנלוגי-דיגיטלי שלו, אשר ישמש לטכניקת ה-dynamic clamp.מתקן ההקלטה התו-תאי צריך לבצע פרפוזיה של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס. אם הפרוסה להקלטה הוכנה באופן אופקי, השתמש בפ pipette העברה כדי להניח אותה בצלחת פטרי עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי, ובאמצעות כלי חיתוך חתוך את הפרוסה לשניים לאורך קו האמצע. לאחר מכן, לצורך ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, השתמש ב-pipette כדי להעביר את הפרוסה למתקן ההקלטה התו-תאי.באמצעות עדשה אובייקטיבית של 40x, ניתן להבחין בתא העצב המטרה; נראה כאן נוירון דופמינרגי בודד מה-substantia nigra. שימו לב לסומה בעלת צורה אליפטית עם שני דנדריטים מתוחים. באמצעות מכשיר משיכה אלקטרוני של פיפטות מיקרו P 97, משכו אלקטרודות עם התנגדות קצה של 4 עד 10 mega ohms.בשלב הבא, מלאו אלקטרודה בתמיסה פנימית באמצעות מחט של מזרק microfill. הכניסו את האלקטרודה המלאה אל תוך חצי התא, המחובר לשלב הראש (head stage) של המגבר, בעזרת מזרק המחובר לחצי התא באמצעות צינור קצר. הפעילו לחץ חיובי קטן על אלקטרודת ההקלטה.תחת הדרכה חזותית, הנמיקו את האלקטרודה על הנוירון המטרה. שקע ייראה על פני השטח של התא. הפילו כמות קטנה של לחץ שלילי כדי ליצור giga seal על הנוירון הרצוי.בצעו יניקה באמצעות הפה כדי לפרוץ את האטם. פעולה זו מהווה רישום של תא שלם (whole cell recording). לאחר פריצת האטם, השתמשו בממשק התוכנה multi clamp commander כדי להעביר את המגבר למצב current clamp, שבו לא ניתן להזריק זרם.כדי להחיל מוליכות NMDA בתא זה, התחילו בהפעלת תוכנת RTXI במחשב ה-dynamic clamp. לאחר מכן, טענו לזיכרון מודל שנכתב במיוחד המכיל קולטן NMDA. ברגע שהמודל ייטען לזיכרון RTX, אני אחשב את הזרם שיוזרק לתא בזמן אמת באמצעות המשוואה המוצגת כאן, כאשר G-N-M-D-A היא המוליכות הרצויה ב-nanos, Semens שנקבעה לאפס nanos.בברירת המחדל של Semens, MG הוא ריכוז המגנזיום. E-N-M-D-A הוא פוטנציאל ההיפוך של רספטור ה-NMDA, שנקבע לאפס מיליוולט, ו-VM הוא פוטנציאל הממברנה של התא כפי שנמדד מהמגבר במיליוולט. כעת, באמצעות כבל BNC סטנדרטי, חבר את המוצא ממחשב ה-dynamic clamp לכניסת הפקודה (command input) של המגבר באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי.הגדירו את המגבר למצב current clamp סטנדרטי (ic) באמצעות ממשק התוכנה multi clamp commander. מערכת ה-RTXI הוגדרה כך שתקבל את המוליכות הרצויה GFT מאות מתח מתוכנת רכישת הנתונים Axo Graph X. כאן אנו מבצעים פרוטוקול AXO Graph X פשוט שבו מופעל על התא שלב מוליכות של 40 nano Siemens למשך שנייה אחת.פרץ של פוטנציאלי פעולה מעורר בתגובה למדרגת מוליכות באמצעות המערך המתואר בסרטון זה; בוצעה הקלטה מסומתית של תא שלם מנוירון דופמינרגי ב-substantial nire pars compacta. תאים דופמינרגיים יורים בדרך כלל באופן ספונטני בשיעורים נמוכים ובדפוס דמוי קוצב לב. ניתן לעורר פרץ של פוטנציאלי פעולה על ידי יישום פאזי של מוליכות קולטן NMDA באמצעות dynamic clamp.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להחיל מוליכות NMDA בתוך נוירון דופמינרגי חי בתוך פרוסה מבודדת של המוח. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקה זו עבור כל סוג תא שניתן להקליט באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות. באופן דומה, ניתן להרחיב את השימוש ב-dynamic clamp כדי לחקות את ההשפעות החשמליות של מגוון רחב של סוגי רצפטורים.אנו מקווים שסרטון זה היה שימושי בהדגמת מהי טכניקת ה-dynamic clamp וכיצד אנו משתמשים בה במעבדה שלנו. תודה שצפיתם.

application-nmda-receptor-conductance-rat-midbrain-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

סרטון זה מדגים את בחינת עוררות תאי העצב התחושתיים בגרעיני השורש הגבי באמצעות טכניקת מהדק טלאי כדי למדוד את בסיס הריאוס ואת פוטנציאל הממברנה, תוך ניתוח תגובות הנוירונים לזריקות זרם מצטבר.

הקלטות מהדק טלאי של תא שלם על גרעיני שורש גבי חולדה שלמים

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

נוירונים חושיים מאותתים מידע חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. זיהוי נוירונים אפרנטיים ספציפיים יעזור בהבנת הפיזיולוגיה שלהם. אנו מתארים שיטה של תיוג לאחור לזיהוי נוירונים אפרנטיים, וחוקרים את תעלות היונים עם שער המתח בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה של מהדק טלאי.

זיהוי אוכלוסיות נוירונים חושיים ספציפיים לחקר תעלות יונים מבוטאות

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

כתב יד זה מתאר כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים להקלטות מהדק טלאי. תכשיר זה שומר על המיקרו-סביבה עבור נוירונים ותאי גליה לווייניים, ובכך נמנע מהשינויים הפנוטיפיים והתפקודיים הנראים באמצעות נוירוני DRG מנותקים.

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

למדו כיצד להחיל מוליכות NMDA על נוירונים דופאמינרגיים במוח העכברוש באמצעות טכניקת הצמד הדינמי. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בהפעלת קולטנים ובחינת פעילות חשמלית של תאים חיים.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

גלה סרטונים נוספים