פרמקולוגיה ההתנהגות של התניה קלאסית תגובת הרחבה חוטם ב דבורי דבש ( אפיס מליפרה)

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הלמידה ויצירת הזיכרון. בדבורי דבש, השלב הראשון הוא איסוף דבורים מעופפות באופן חופשי מהכו שלהן. לאחר מכן, הדבורים מקובעות לצינורות פלסטיק.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע התנייה קלאסית. ניתן להזריק תרופות בנקודות זמן מסוימות סביב ההתנייה כדי לבחון את השפעתן על הלמידה ועל יצירת הזיכרון. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא בדיקת שימור הזיכרון.

בסופו של דבר, שינויים בהתנהגות לאחר טיפול תרופתי עשויים לחשוף את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הלמידה ויצירת הזיכרון בדבורי דבש. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלמידה והזיכרון על ידי חשיפת המנגנונים המולקולריים של יצירת הזיכרון.

באופן כללי, חוקרים שאינם בקיאים בשיטה זו ייתקלו בקשיים, כיוון שתזמון הצגת הגירויים במהלך ההתנייה ושליפת הזיכרון חייב להיות מדויק. כמו כן, משטר ההאכלה הוא קריטי. הפרוצדורה תודגם על ידי cutting gearing ו-Johannes faberg לסטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. ביום שלפני הניסוי, אספו דבורים בין השעות 14:00 ל-16:00 באמצעות פירמידת פרספקס חדירה לאור UV.

עם החזרה למעבדה, הניחו את הפירמידה על בסיסה וכסו את הדפנות במגבת, כך שרק הקודקוד יישאר חשוף. פתחו את הקודקוד והחזיקו מבחנה מזכוכית מעל הפתח, ואפשרו לדבורה אחת להיכנס למבחנה לפני הסגירה מחדש. המשיכו בפרוצדורה זו עד שכל הדבורים יועברו למבחנה מזכוכית בסתיו ובחורף.

כאשר הדבורים אינן עפות בחוץ, הכוור דבורים נשמר בתוך חממה בתוך רשת, ודבורים בודדות נתפסות ישירות מהרשת. השתמשו במבחנה אחת לכל דבורה; השתקו את הדבורה על ידי קירור המבחנה על קרח למשך שתיים וחצי עד שלוש וחצי דקות. עקבו אחר הדבורה בקפידה והוציאו אותה מהקרח ברגע שהיא מפסיקה לזוז.

קבעו את הדבורה הממוביליזציה בתוך מבחנה פלסטית קטנה באמצעות סרט דביק. ודאו שהדבורה מסוגלת להניע את ה-osis באופן חופשי, אך לא את הראש, החזה או הרגליים. חשוב גם להימנע מלחיצה על העורף.

לאחר שהדבורה מוכנה, הכניסו את המבחנה לחור ממוספר במעמד, לצורך טיפול וזיהוי יעילים יותר.

הנקבים תמיד מוחזרים לאותו קידוח. לאחר הטיפול, האכילו את הדבורים בין השעות 16:00 ל-18:00 במיקום הנפרד מאתר הה conditioning. עוררו את תגובת פריסת החוטם (Proboscis extension response או PER) על ידי נגיעה בדבורים ובממשסי המישוש.

באמצעות תמיסת סוכרוז, אפשרו לדבורה לצרוך טיפה אחת של כ-4 µL מתמיסת ה-SRAs. יש לוודא שלא נמרחו על מחושי הדבורה, על הפרובוס (proboscis) או על השפופרת הפלסטית. האכילו כל דבורה עד שלא תרצה להמשיך.

הפגינו רפלקס התארגנות (PER) מהיר ואמין כאשר אחת המחושים נוגעת בתמיסה. בערבים הבאים של הניסוי, האכילו כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של תמיסת סוכרוז. מלאו קערת פלסטיק בגובה של כ-0.5 עד סנטימטר אחד במי ברז.

הנח את מתקן הדבורים הרתומות בקערה, כאשר צלחות לייסא (lysa plates) משמשות כפלטפורמה. כסה את הקערה בקרטון ואחסן בטמפרטורת החדר למשך לילה. הדבורים יעברו התנייה ריחית בסביבות השעה 10:00 בבוקר, ביום שאחרי האיסוף.

30 דקות לפני תחילת הניסוי. מקמו את מתקן דבורת הרתמה בקרבת אתר ההתנייה, אך הרחק מפתח צינור הפליטה שבו יאומנו הדבורים. לאחר מכן, הכינו את גירוי ההתנייה בעבודה תחת מנדף.

השתמשו בטיפ עם מסנן כדי להעביר 4 µL של שמן ציפורן על נייר סינון עגול. הניחו את נייר הסינון המבושם בתוך מזרק של 20 mL והכניסו את הבוכנה. הגדירו את נגן השמע שיספק אות אקוסטי לבודק.

פעולה זו מבטיחה תזמון מדויק של הגירוי, תחילת הגירוי, סיום הגירוי, משך הזמן והמיקום. היערכו להקלטת התנהגות הדבורה לאורך כל תהליך ההתניית. ציון חיובי יינתן אם הדבורה תמתח את ה-SSIS שלה בין תחילת גירוי ההתנייה לבין הצגתו של הגירוי הבלתי מותנה.

חצייה של קו וירטואלי בין המנדיבולות הפתוחות. כדי להתחיל ניסוי רכישה, בחר את הדבורה המיועדת לאילון והצב אותה לפני פתח הפליטה למשך 10 שניות. זמן קצר לפני סיום פרק זמן זה של עשר שניות, הנח את המזרק המכיל את הריח במרחק של שלושה סנטימטרים מהדבורה וממששיה. הצג את הריח לאורך חמישה שניות על ידי דחיפה של 20 milliliters של אוויר דרך המזרק.

לאחר שלוש שניות, יש להחדיר את הגירוי הבלתי מותנה על ידי נגיעה בחלק הוונטרלי של השוטרים הדיסטליים של שתי המחושות בעזרת תמיסות סוכרוז, לחות ובקיסם שיניים. תוך הקפדה שלא להשכיב את התמיסה על הדבורים והמחושות, יש לאפשר לדבורה ללקק את הקיסם. גירוי מורכב זה נמשך ארבע שניות, ולאחר מכן הדבורים מוסרות מהסביבה של האימון ומוחזרות למדף.

13 שניות לאחר הצגת גירוי התנאי, נמשך סבב אימון אחד למשך 28 שניות. החזיר את הדבורה לאתר האימון לאחר מרווח של 10 דקות בין הסבבים. בצע את הסבב השני מתוך שלושה כפי שהודגם קודם לכן, והמתן 10 דקות נוספות לפני ביצוע ההצמדה הסופית.

לאחר השלמת האימון להיום, החזירו את המתקנים לקערה. זכרו להאכיל כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של 4 µL של תמיסת סוכרוז בין השעות 16:00 ל-18:00. כפי שהודגם קודם לכן, ניתן לבצע בדיקות שימור זיכרון בכל רווח זמן, מדקות ועד ימים, לאחר האימון. הכינו את הדבורים לבדיקת הזיכרון על ידי הצבת מתקן הדבורים בקרבת אתר ההתניה למשך 30 דקות.

התחילו את הבדיקה על ידי הצבת דבורה מול פתח הפליטה למשך 10 שניות. הציגו את גירוי התנאי למשך חמש שניות ורשמו את התרחשות ה-PER. לאחר סיום הבדיקות להיום, החזירו את המדפים אל הקערה.

זכרו להאכיל כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של 4 µL מתמיסת סוכרוז בין השעה 16:00 ל-18:00 כפי שהודגם קודם לכן; בסיום הניסוי כולו, ודאו שהדבורה עדיין מסוגלת להושיט את ה-proboscis על ידי נגיעה באנטנה עם תמיסת SRAs כדי להיכלל בניתוח; על הדבורים לשרוד את הניסוי כולו ולהחזיק ב-PER תקין. בחלק מהמחקרים, נעשה שימוש בהזרקות סיסטמיות כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות פרמקולוגיות על הזיכרון הריחני. ניתן לבצע הזרקות אלו בזמנים שונים, בהתאם למבנה הניסוי.

כדי להתחיל, צרו חור קטן בקוטיקולה של החלק האחורי של ה-S scootin בקרבת ה-S scootle fissure מעל שריר התעופה, באמצעות מחט היפודרמית חד-פעמית. לאחר מכן, מלאו צינור קפילארי מזכוכית ב-1 µL של התמיסה לבדיקה. הכניסו את הקפילארה לתוך החור בקוטיקולה והזריקו את התמיסה אל שריר התעופה.

נסיינים מיומנים מסוגלים להחדיר B אחד בכל 30 שניות, מה שמאפשר תזמון מדויק של ההזרקה וההתניה. שני ניסויים מוצגים כאן. הניסוי הראשון בוחן את ההשפעה של הזרקה סיסטמית של תמיסת סלין שניתנה לפני האימון על למידת זיכרון.

במחקר זה ישנן שלוש קבוצות: קבוצה A שאינה מקבלת טיפול, קבוצה המקבלת הזרקה סיסטמית של 1 µL של phosphate buffered saline, או קבוצת sham. טיפולים אלו ה diberikan 30 דקות לפני האימון המוצג כאן משמאל. אחוז בעלי החיים שהפגינו את התגובה המותנית במהלך הלמידה עלה לאורך שלושת סבבי האימון, ללא הבדלים בין הקבוצות.

גרפי העמודות מימין מראים כי לא הזרקת ה-PBS ולא הפגיעה המדומה (sham lesion) השפיעו על שימור הזיכרון. 24 שעות לאחר האימון בניסוי השני, ניתנו הזרקות 40 דקות לאחר האימון; הדבורים חולקו לקבוצה אחת שקיבלה תמיסת מלח ולקבוצה שנייה שקיבלה מיקרוליטר אחד של מעכב סינתזת חלבונים, anisomycin. גרפי העמודות מימין מראים ירידה ברורה בשימור הזיכרון בדבורים שקיבלו anisomycin. תוצאות אלו מדגישות את חשיבותה של סינתזת החלבונים ביצירת זיכרון ריח.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהו הבסיס הנוירופיזיולוגי של למידה ויצירת זיכרון לאחר התפתחותם? טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר הלמידה והזיכרון לחקור את המנגנונים המולקולריים והנוירופיזיולוגיים של יצירת זיכרון בדבורת הדבש.