אגר-Block מיקרוקוסמוס של פירוק רקמות הצמח מבוקרת על ידי פטריות אירובית
3 בפברואר 2011
וידאו זה מדגים גישה בסביבה מבוקרת ללמוד השפלה של רקמות הצמח lignocellulosic ידי פטריות אירובית. היכולת לשלוט במקורות מזין לחות היא יתרון המפתח של אגר, לחסום מיקרוקוסמוס, אך הגישה לרוב מניב הצלחה מעורבת. אנו כתובת החסרונות קריטי תשואה לשחזור, השתנות נמוך התוצאות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחסן פטריית עץ אירובית במיקרוקוסמוס צלחת פטרי שבו לחות העץ והמצעים האקסוגניים נשלטים בקפדנות. זה מושג על ידי הכנת מיקרוקוסמוס תחילה עם נפחים מדויקים של אדיה ידועה. לאחר מכן העץ להתפרק, וכל מצע מוצק אקסוגני מורכבים על גבי רשת פלסטיק על פני השטח החקלאי מבלי לאפשר מגע בין המצעים.
לאחר מכן המיקרוקוסמוס מחוסן ומודגר עם פטריית הבדיקה. לאחר הדגירה, קוביות עץ נקצרות כדי לקבוע אובדן מסה ולהכין רקמות לניתוחים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את מידת הפירוק הביולוגי של העץ ואת תפקידם של מקורות יסודות אקסוגניים באמצעות מדידות אובדן מסה, תצפיות על מורפולוגיה של תפטירים וניתוחים ממוקדים של יסודות כמו ספקטרוסקופיה פלזמה בצימוד אינדוקטיבי.
היי, שמי ברוק ג'ייקובסון מהמעבדה של ד"ר ג'ונתן שילינג במחלקה להנדסת ביו-מוצרים וביו-מערכות באוניברסיטת מינסוטה. היום אנו הולכים להראות לכם נוהל לשימוש בצלחות פטרי כמיקרו-סביבות לפירוק רקמת הצמח על ידי פטריות אירוביות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את המנגנונים של פירוק ליגנוצלולוז פטרייתי.
ליגנוצלולוז היא רקמת הצמח המורכבת מליגנין, תאית ותאית הימי. הרקמה שאנו חוקרים לרוב היא טעויות עץ עם ההיבטים הפחות טכניים של עיצוב בלוק מקדחה הן הגורמים השכיחים ביותר לכישלון ומקורות השונות העיקריים בין מחקרים שהופכים את פרסום הווידיאו של מערך בלוק המקדחה שלנו לשימושי. אנו יודעים מניסיון שהליך זה מניב תוצאות באיכות גבוהה ושונות נמוכה.
אז בואו נתחיל. עבור ניסויים אלה, השתמשו בצלחות פטרי עמוקות בסנטימטר אחד מצלחות פטרי טיפוסיות כדי להגדיל את מרווח הראש מעל גוש העץ. במיקרוקוסמוס.
התחל בהכנת מיקרוקוסמוס על ידי הכנת אדיה בכמות מספקת של 20 מיליליטר לצלחת פטרי ללא סידן וברזל. הקלד אגר ב-15 גרם אגר לבקבוק נפחי של 500 מיליליטר המכיל כ-400 מיליליטר מים נטולי יונים מתוקנים בתוספים. השתמש בתמיסות מלאי שהוכנו בעבר כדי להוסיף מיקרו-נוטריינטים לתערובת.
לאחר הוספת חומרים מזינים, מלאו את הבקבוק הנפחי לקו 500 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את המדיה לבקבוק של 1000 מיליליטר. החיטוי ב-121 מעלות צלזיוס ו-16 PSI למשך 20 דקות.
הקפד לא לחרוג מנפח של 500 מיליליטר לבקבוק כדי למנוע התמצקות חקלאית לפני מתן לוחות הבדיקה. לאחר החיטוי, אפשר למדיה להתקרר למגע כדי למזער עיבוי. מזעור הלחות הוא קריטי בניסויים אלה כתכולת לחות או mc.
מעל 80% יגרמו לאנוקסיה ברקמות. הגבל את הריקבון על ידי פטריות אירוביות והגדל את השונות פעם אחת. קריר. השתמש בעזר פיפטה נייד ובפיפטות פוליסטירן סטריליות של 10 מיליליטר כדי לאספטי.
העבירו את האגר לערימה גבוהה של צלחות בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן חתכו בנדיבות רשתות רשת פלסטיק כך שיתאימו לתחתית הצלחת. לאחר חיתוך ושטיפה יסודית של רשתות במים וסבון, הכינו רשתות רשת לייבוש וחיטוי להדגמה זו.
אורן צהוב דרומי או SYP משמש מכיוון שהוא מייצג מקור חשוב לעץ. בדיור למגורים בארה"ב, השתמש בעץ לא מטופל וחתוך בלוקים חופשיים של 19 על 19 מילימטר מחתך אורך יחיד לאורך התבואה. חותכים את האורך הזה לקוביות של 19 מילימטר.
חלקו את הקוביות בגודל 19 מילימטר לשניים לאורך התבואה בעזרת אזמל ופטיש במקום מסור. זה הופך קצה בלוק מחוספס אחד לכיוון כלפי מטה על רשת הפלסטיק במיקרוקוסמוס הבלוק החקלאי וקצה עליון חלק לתווית. סמן את הקצה החלק של הבלוקים בעיפרון, חתוך מספיק בלוקים כדי לספק את הטיפולים, כמו גם את הבקרות הלא מחוסנות שישמשו הן כמנטרי זיהום והן כדגימות נתונים בסיסיות המותנות במקביל לחומר מיובש בתנור, הניחו דגימות בתבניות מי גבינה מאלומיניום ולתנור הסעה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
מעבירים את הדגימות מהתנור לייבוש כדי לקרר אותן פעם אחת. קריר. שקלו מראש את הדגימות כדי לקבוע את המשקל היבש הראשוני של התנור. לבסוף, הכינו את הדגימות כולל רשתות פלסטיק ועץ לחיטוי על ידי עטיפה הדוקה בנייר כסף כדי למזער את ההרטבה.
זה לא דורש שכל דגימה תהיה עטופה בנפרד, אלא שהחשיפה לאדים תהיה נמוכה ועקבית. חיטוי הדגימות המסומנות ב-121 מעלות צלזיוס ו-16 PSI למשך שעה. בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, הרכיבו AEs ריקים, לוחית מקור לחומרים אקסוגניים של מצע צמחי רשת חיסון, רצועות פרפורמים של שארפ, מלקחיים וכלי העברה.
השלב הבא של החיסון הוא להוסיף את הפריטים לחקלאות, להכיל צלחות פטרי כדי למזער את הסיכון לזיהום. כלים להעברת להבה ומלקחיים עם 95% אתנול בזמן השימוש בהם. ראשית, הוסף את רשת הפלסטיק לצלחת הפטרי.
ואז הוסף כאן את מצע העץ. שני גושי עץ מתווספים לאורך הרשת כך שניתן לשייך נתונים מהקציר המוקדם והמאוחר. בלוקים אלה מתווספים זה לצד זה עם תבואה ופונים לנקודת מקור החיסון הפטרייתי.
לאחר מכן, הוסף את החומרים האקסוגניים. הנה. תפקידו של הגבס נבדק על ריקבון על ידי פטרייה חוטית. לכן, הפטרייה צריכה להיתקל בדיסקי הגבס הללו לפני שהיא מגיעה לעץ.
דיסק גבס אחד מתווסף בין כל בלוק ונקודת חיסון על גבי הרשת. הקפידו להימנע ממגע בין הדיסקים בעץ תוך שמירה על קרבה זו לזו. עבור החיסון הפטרייתי, השתמש בבור שעם מספר ארבע בקוטר שבעה מילימטר כדי ליצור פקקים מתרביות של שבועיים שגדלו ב-20 מיליליטר אגר.
זה עוזר לשלוט בנפח החיסון. עבור בקרות לא מחוסנות, עדיף להוסיף פקק מצלחת סטרילית. אל תאפשר מגע בין החיסון למצעים האקסוגניים או לעץ, אלא הנח אותם קרוב זה לזה.
השתמש בפקק חיסון אחד לכל בלוק. אוטמים את הכלים בפרם שנחתך בעזרת סכין גילוח, מחזיקים צלחות אופקיות ועוטפים את הפרם בתנועה רציפה חלקה. לבסוף, סמן את מכסי הכלים באמצעות טוש עמיד לאלכוהול המסמן מספרי בלוק ישירות על המצעים המתאימים.
צייר גם עיגולים מעל דיסקי הגבס. העבירו את הצלחות בזהירות לחממה ביולוגית כדי למנוע התנגשות בתכולה וכדי למזער עיבוי עקב תנודות טמפרטורה. התנאים המשמשים כאן הם ב-20 מעלות צלזיוס ובחושך מבצעים קציר סדרות זמן באופן אספטי למעט הקציר האחרון.
בנקודת הקציר של השבוע החמישי, הסר את כל מגרש הטיפול. רססו כל תחתית וחלק עליון באתנול 70% והשתמשו במלקחיים להבעיר כדי להסיר חומר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. צלם תמונות לפני השמדת לוחות החקלאות, תוך התמקדות בכל צורה F או מלון.
לאחר מכן הסר בלוקים לטיפול. מגלגלים את כל הפה, אך היזהרו לא לאבד שום חומר רקוב תנור. יבש בלוקים במחבתות אלומיניום וקבע אובדן מסה באמצעות המשקולות הטריות והיבשות של הפקדים כדי לנטר פתילות יתר.
נתוני אובדן מסה עוזרים לאמוד את התקדמות הדעיכה והם נתונים חשובים. אם יש לחשב את ריכוזי היסודות על בסיס משקל גרם, יש לנרמל את נתוני האחוזים. לסטטיסטיקה, סמן ועקוב אחר כל בלוקים חומים כהים, שברור שהם ספוגי מים.
לבסוף, השמידו את התרביות בשקיות הניתנות לחיטוי, וחסכו רשת תמיכה מפלסטיק וכל רכיב אחר שניתן למחזר לשימוש בניסויים עתידיים. באמצעות מערך המיקרוקוסמוס של בלוק חקלאי, קוביות עץ אורן מונחות על רשת פלסטיק כדי להעלות בלוקים מעל מגע חקלאי. עגולים צמחו במגע ישיר עם משטחי הגבס ולתוך גושי העץ.
תפטיר זה מייצג קשר חשוב בין עץ למקורות יסודות תזונתיים אקסוגניים. בשליטה במקורות החומרים האקסוגניים הללו באגר או בחומרים מוצקים הוא יתרון מרכזי של תכנון בלוק חקלאי לעומת עיצוב בלוק אדמה, ירידה ממוצעת במשקל כמדד למידת ריקבון העץ על ידי סר קריין לאחר חמישה ו-15 שבועות. דגירה עם אורן במיקרוקוסמוס בלוק אגרו מוצגת כאן.
טיפולים לא היו קיימים. חמישה מילי-מולרי סידן כלורי שנוספו לאגר גדול מ-99% גבס טהור או 1% גבס מתוקן ברזל עבור כל חטיפי קציר תחת אותה אות אינם שונים באופן משמעותי. עם פסי השגיאה המייצגים את סטיית התקן, נצפתה ירידה של יותר מ-60% במשקל בגושי האורן החומים שנרקבו, מה שעונה על יעד התקן של האגודה האמריקאית לבדיקות וחומרים של יותר מ-50% ריקבון.
מקדם השונות הממוצע בדעיכה היה 0.055 בשבוע 16. בנוסף לשונות נמוכה, נצפתה אפקט טיפול. ריקבון פטרייתי עוכב על ידי תוספות סידן, בין אם לאגר כסידן כלורי או כגבס טהור.
מעניין ששיעורי הדעיכה מתאוששים עם הוספת ברזל לגבס. הצעת ברזל ולא סידן היא קריטית בהתבוננות בחמשת השכפולים בשבוע 15 של דעיכה. על ידי אותו ריקבון חום, פטריית בדיקה, למינים עגולים, צבע התפטיר חושף מיין.
הבדלים בקור החיצוני בין הטיפולים, בלוקים הוסרו והתייבשו. חשיפת המחסור במיין בטיפול ללא סידן. הצהבה בטיפולי סידן טהור ומראה החלודה בטיפול מתוקן בברזל.
הבקרה מייצגת בלוקים לא מחוסנים להשוואה. מעניין שהשפעות המיין הולכות לאיבוד באמצעות מדיום ברזל גבוה. באופן קולקטיבי, זה מצביע על כך שהפטרייה הזו משתמשת בברזל, לא בסידן.
בחומרים אלה, זה עתה הראינו לך כיצד להשתמש במערך בלוק מקדחה כדי לבדוק בהצלחה את הפירוק הביולוגי של רקמות הצמח על ידי פטריות חוטיות אירוביות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למנוע מהמצעים לבוא במגע זה עם זה, במיוחד רקמת הצמח והמקדחה למזער את תכולת הלחות מהמקדחה והטסיות, ולבדוק שוב כדי לוודא שתכולת כל צלחת לא זזה לפני הדגירה. תוך התחשבות במשתנים אלה, אתה יכול לשלוט בסביבת הריקבון הרבה יותר טוב ממה שאתה יכול בעת שימוש במערך גוש אדמה.
אתה יכול להפיק נתונים עם כוח סטטיסטי הדרוש כדי לענות על שאלות המחקר שלך. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים גישה של סביבה מבוקרת לחקר הפירוק של רקמות צמחים ליגנוצלולוזיות על ידי פטריות אירוביות. השיטה כוללת בקרה הדוקה של לחות העץ ושל סובסטרטים חיצוניים כדי להניב תוצאות הניתנות לשחזור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אקולוגיה מיקרוביאלית
- ביולוגיה של פטריות
- תהליכי ביודהגראדציה
רקע
- מיקרוקוסמוסים של בלוקי אגר מאפשרים מחקרים מבוקרים של פירוק עץ.
- הבנת תפקידם של פטריות אירוביות בפירוק ליגנוצלולוזי היא קריטית עבור יישומים אקולוגיים ותעשייתיים.
- במחקרים קודמים צוינו קשיים בהשגת תוצאות עקביות.
- מחקר זה מתייחס לאתגרים אלו כדי לשפר את השחזוריות.
מטרת המחקר
- להחדיר פטרייה אירובית מפרקת עץ לתוך מיקרוקוסמוס מבוקר.
- למדוד את מידת הביודגרדציה של העץ.
- לנתח את השפעתם של סובסטראטים חיצוניים על הפירוק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מיקרוקוסמוסים עם נפחים ספציפיים של מצע גידול.
- הרכבת העץ והמצעים על רשת פלסטיק.
- הדבקה ודגירה עם הפטרייה הנבדקת.
- קציר של קוביות עץ לצורך ניתוח אובדן מסה וניתוח רקמות.
תוצאות עיקריות
- מדידות של איבוד מסה מעידות על היקף הביודגרדציה של העץ.
- תצפיות על מורפולוגיית המיצליום מספקות תובנות לגבי הפעילות הפטרייתית.
- ניתוחים אלמנטריים חושפים את השפעתם של מקורות חיצוניים על הפירוק.
- התוצאות מדגימות את יעילותה של גישת המיקרוקוסמוס המבוקרת.
מסקנות
- הסביבה המבוקרת משפרת את השחזוריות במחקרי ביודהגראדציה.
- הבנת תפקידם של חומרי הזנה ולחות היא קריטית למחקרים עתידיים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים שונים העוסקים בפירוק עץ על ידי פטריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
מיקרוקוזמוסים מבוקרים של בלוקי אגר מאפשרים בחינה מדויקת של פירוק רקמות צמחים המונע על ידי פטריות, ובכך תומכים בהסרה מכנית של סיכונים בשלבים מוקדמים של גילוי תהליכים ביולוגיים. גישה זו נותנת מענה לסבירות הגבוהה של שונות ולמגבלות הבקרה על רכיבי תזונה הגמונות בשיטות של בלוקי קרקע, ובכך מגבירה את רמת הוודאות החזוית עבור מו"פ בביופארמה המכוון לפירוק ליגנוצלולוז. השחזוריות של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה ממצבים אותה ככלי יסודי לקידום תהליכי פיתוח במחקר בתחומי האנרגיה הביולוגית והביורמדיאציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של מנגנונים פטרייתיים בפירוק ליגנוסלולוז תחת תנאי תזונה מוגדרים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של זני פטריות או אנזימים לצורך פיתוח ביו-תהליכים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד השפעות של משתנים חיצוניים על קצבי ריקבון.
- מספק נתונים כמותיים על אובדן מסה ומרכיבים אלמנטריים לצורך בחירת מטרות מונחית-היפותזה.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מיקרוקוסמוים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך סריקה השוואית של פעילות פטרייתית.
- מפיק מדדי ריקבון כמותיים המתאימים לאופטימיזציה של בדיקות ולביצוע Benchmarking.
- מאפשר הערכה שיטתית של השפעות של חומרי הזנה או תוספים על ביצועי הפטריות.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה ובניתנות להשוואה בין מחקרים באמצעות תנאים מבוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם יעדים תרגומיים בתחומי הביו-אנרגיה והביו-סננציה באמצעות מידול תהליכי פירוק רלוונטיים לתעשייה.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של זני פטריות או ביוקטליזים.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבטחת הדירות בשלב מוקדם ובהירות מכניסטית.
שילוב תהליכי עבודה (Workflow) וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת המיקרוקוסמוס של בלוק-אגר זו משלבת בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא תומכת בפיתוח בדיקות המשך ובמחקר תרגומי בביוטכנולוגיה פטרייתית.
- ביולוגיית גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על השפעות תזונתיות ומנגנוני ריקבון פטרייתיים באמצעות בידוד משתנים מבוקר.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הדירות של איבוד מסה ומרכיבים אלמנטריים לצורך פיתוח בדיקות (assays) חסונות.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של טיפולים באמצעות מדידת איבוד מסה, מורפולוגיה של המיצליום ואנליזה אלמנטרית.
- מחקר תרגומי: ממדלת תרחישי פירוק בעלי רלוונטיות תעשייתית לצורך הערכה פרה-קלינית של מועמדים פטרייתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה למחקרי סריקה ומנגנונים חוזרים במגוון פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזואי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי פירוק פטרייתי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור, הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה של זרימות עבודה ניסיוניות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות בנוגע להמשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מזעור השונות הניסיונית.
- השפעה על הפורט폴יו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום מועמדים לתהליכים ביולוגיים פטרייתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של פטריות, בטכניקה אספטית ובהרכבת מיקרוקוסמוס.
- דורש גישה לדגירה מבוקרת, למאזניים אנליטיים ולמכשור לניתוח אלמנטרי.
- דורש סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים להקמת המיקרוקוסמוס ולנרמול נתונים.
- ניתן להתאמה לרקמות צמחים ולזני פטריות שונים באמצעות שינויים בפרוטוקול לפי הצורך.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לבקרת לחות ופוטנציאל לשונות במגע עם התשתית.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Introduction
1:49
Microcosm Preparation
4:16
Preparation of 'Block' Substrates
5:49
Inoculating and Labeling
11:47
Conclusion
8:02
Incubating and Harvesting
9:33
Representative Results for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi using Agar-block Microcosms
