Name: מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למד שיטות מוטגנזיס EMS ו-TMP/UV ב-Pristionchus pacificus לזיהוי גנים מעורבים בתהליכים ביולוגיים. שיטות אלו מסייעות לחוקרים לחקור תפקוד גנים בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו כבר ממומן על ידי NSF מענק IOB # 0615996.

חלק 1: הכנת צמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות פטרי נמטודות ניסויית כגון C. elegans ו פ פקיפיקוס הם בדרך כלל בתרבית במעבדה על 6 צלחות פטרי ס"מ המכיל צמיחה נמטודות בינוני (NGM) 1. תולעים נשמרים 20 ° C, אבל יכול להיות מודגרות בטווח של טמפרטורות (בין 4 ° C - 25 ° C), בהתאם למין נמטודות ותכנון ניסויים. כדי להכין צלחות עם NGM, טכניקות סטרילי תקן צריך לשמש כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי. להלן פרוטוקול להכין צלחות NGM: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 15 אגר גרם, 2.4 גרם NaCl, 2 גרם Tryptone, ו 2.72 גרם KH 2 PO 4 בבקבוק 2 ליטר חרוטי, לעשות נפח של עד 1 ליטר עם החיטוי מים, ומצננים עד 60 ° צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 מ"ל כל אחד 1 M CaCl 2, כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל אתנול), ו 1 מ 4 MgSO. כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי, סטרפטומיצין 1 מ"ל (100 מ"ג / מ"ל) ו nystatin 1ml (10 מ"ג / מ"ל) ניתן להוסיף ליטר כל אחד בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכונת Unispense ושמירה בתנאים סטריליים, לשפוך את התקשורת לתוך צלחות הרצוי. צלחות צריך להיות מלא עד בערך 2 / 3 rd מלא. צלחת בקוטר 60 מ"מ סטנדרטי דורש כ 10 מ"ל של התקשורת. אין להזיז את הצלחות עד אגר הוא gelified לחלוטין, אחרת לא יהיה משטח אחיד של אגר, ולכן קשה להתמקד תולעים על stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיובשים, צלחות ניתן seeded מיד או מאוחסנים 4 ° C עד זריעת עם חיידקים. </li></ol> חלק 2: הכנת OP50 חיידקים זריעת NGM צלחות פטרי פ פקיפיקוס בתרבית במעבדה על ידי האכלה על המתח E.coli OP50. OP50 יש צמיחה מוגבלת על צלחות NGM, ובכך יוצרים הדשא דק המאפשר ראיה של תולעים 1. כדי לגדול תרבות של OP50, להשתמש LB-מרק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 גרם bactotryptone, 2.5 לחלץ גרם שמרים 2.5 גרם NaCl על בקבוק 500 מ"ל כובע בורג, לפצות את נפח 500 מ"ל מים מזוקקים החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את המרק עם מושבת יחיד של OP50 מהצלחת התרבות בתנאים סטריליים ולתת לו לגדול בין לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB-OP50 הוא מוכן להיות בשימוש, ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר חודשים אם עקרות נשמר. בכל פעם צלחות צריך להיות מנוקה מגרעינים, לשפוך כמות קטנה של מרק לתוך מבחנה סטרילית קטן זה יעזור למנוע זיהום של התרבות המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צלחות זרע, לוותר 100-120 μl של OP50 על גבי צלחת בקוטר 60 מ"מ פטרי NGM ו מערבולת להפיץ אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אלה צלחות seeded לילה בטמפרטורת החדר למשך הדשא לצמוח. הצלחות אלו זורעים כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 3 שבועות. אחסון אותם בעמדה הפוכה עוזר למנוע ייבוש מהיר. </li></ol> חלק 3: ביצוע לבחור בחלק זה אנו מתארים כיצד להכין לבחור עבור תולעים. לבחור משמש להעברת תולעים ממיקום אחד למשנהו. להרים עשוי 30% 90 מד חוט פלטינה אירידיום 10%, אם כי חוקרים אחדים עשויים להעדיף יצירות מתכת שונה במקצת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כ 3-4 ס"מ של חוט, מקום של 0.5 ס"מ זה בתוך קצה פיפטה פסטר (אשר קצה נשברה לאורך קטן יותר) ולאחר מכן לאטום אותו לתוך הכוס מעל מבער בונזן. אורכו של חוט בולטות מן הכוס הוא כ 3-3.5 ס"מ, אך יכול להשתנות על פי העדפותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את קצה של חוט, כי הוא בולט באמצעות פטיש או צבת. ואז לכופף כלפי מעלה חלק שטוח כדי ליצור סקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Smoothen את הקצוות החדים של לקחת את הנייר עם חול כדי למנוע פגיעה תולעת או אגר. </li></ol> חלק 4: תולעים קטיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף תולעים, לעקר את חוט פלטינה על להבה וגרור את קצה שטוח של להרים יחד הדשא חיידקים מעיל קצה עם חיידקים דביק עבה, נזהרת שלא לנקב או לפגוע משטח אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope, מאוד קל לצחצח את קצה דביק נגד תולעים תולעת / להיות נטל עד התולעת מקלות על החיידקים על לבחור את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התולעת הוא על קצה לבחור את, להעביר אותו מיד צלחת החדש על ידי נגיעה או הזזה קצה לבחור את הדשא נגד חיידקי של צלחת החדש, התולעת צריך לזחול משם. יש להקפיד לא לפגוע משטח של אגר בצלחת אחר התולעים לזחול לתוך החורים ולכן קשה לשלוף אותם. אם התולעת נשאר לבחור את זמן רב מדי, זה עלול ליבש. </li></ol> חלק 5: EMS mutagenesis Sulfonate אתיל מתאן (EMS) מעוררת קשת רחבה של מוטציות ב הגנום 2. מוטאנטים ניתן לזהות פגמים כמו הנחת ביצה, פגם שרירים, קביעת מין, היווצרות dauer, התנהגות, היווצרות אשך. פרוטוקול עבור EMS mutagenesis דומה לזה שתואר על C. elegans 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ"ל (או יותר) של 1N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 4-5, 6 ס"מ קוטר צלחות פטרי מלא תולעים, המכיל כמה מאות תולעים בבית השלישי הזחל נעורים (J3) במה לשטוף את התולעים את שימוש 2-3 מ"ל של M9 סטרילי לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התולעים סטרילית, חד פעמי שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות. צנטריפוגה XG ב 1500 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל והשימוש 2 מ"ל של M9 מחדש להשעות את התולעים. הוסף 20 μl EMS אל צינור המכיל 2ml של M9 ולנער לפזרו. לאחר מכן להוסיף את הפתרון הזה EMS כדי 2ml ההשעיה תולעת מערבולת בעדינות. הריכוז הסופי של EMS יהיה 47 מ"מ. זהירות: EMS היא mutagen מאוד חזק יש לטפל במנדף קטר. כל החומרים (כפפות, טפטפות, טיפים) כי בא במגע עם mutagen זה יש להתייחס 1N NaOH ל פעיל EMS. לבשו כפפות כפול במהלך ההליך כולו EMS mutagenesis. השליכו פסולת מסוכנת על פי הנחיות המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור צנטריפוגות ולכסות את הכובע עם parafilm; למקם אותו אופקית למכסה המנוע קטר ולתת את התולעים דגירה עבור 3.5 שעות. הצינור ניתן גם דגש על כיסא נדנדה במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את הצינור לכסות את המכסה עם parafilm; מקום במצב אנכי דגירה ועד כיור התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וזורקים אותו לתוך כוס / בקבוק המכיל 1N NaOH. זה יהיה להשבית EMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ"ל M9 של תולעים, להפוך את הצינור 25-30 פעמים כדי לשטוף את התולעים, צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית. לשאוב supernatant וזורקים לתוך כוס NaOH 1N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, מחדש להשעות את התולעת גלולה בסכום מינימלי (~ 500 μl) של M9 ו פיפטה אותם לצלחות NGM המכיל הדשא של OP50 חיידקים. בשלב הזה אתה כבר לא צריך לעבוד במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו לנוזל להתייבש במשך כמה דקות ולאחר מכן לבחור ולהעביר בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי בהתאם להנחיות מסוכנים המוסד שלך פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן את עצמי תולעים mutagenized להפרות. שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציות רצסיביות של עניין. </li></ol> חלק 6: Psoralen mutagenesis בחלק זה אנו מתארים את הליך mutagenesis באמצעות TMP בשיתוף עם אולטרה סגול באורך גל ארוך (UV). Tmp / UV שיטת mutagenesis נעשה שימוש נרחב כדי לגרום מוטציות מחיקה בתוך הגנום 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תולעים 4-5, 6 ס"מ קוטר צלחות פטרי לתוך שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות כמתואר בהליך הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל M9, להפוך 20 פעמים כדי לשטוף את תולעים צנטריפוגות XG ב 1500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וחזור הכביסה עבור סכום כולל של 3 פעמים. לשאוב את הנוזל מחדש להשעות את התולעים בערך 10 פעמים את היקפן של M9 המכילות 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​של TMP. פיפטה 20 μl של TMP (3 מ"ג / מ"ל) לתוך 2 מ"ל של M9. כמו EMS, TMP הוא קרצינוגן חזק ויש לטפל נקיטת אמצעי בטיחות נאותה. כדי למנוע סיכון פוטנציאלי של העין UV באור הנכון לובש אמור לשמש. Disposables חייב להיות מושלך בשקיות Biohazard הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינור בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה במהירות נמוכה (40 UPM). הגדר את צינור אנכי מכוסה במשך 10 דקות כדי לתת את כל כיור תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התולעים מהחלק התחתון של הצינור עם פיפטה פסטר ולהעביר אותם לצלחת NGM unseeded. בטל supernatant עמידה בהנחיות מסוכנים המוסד שלך כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת בחושך עד TMP עודף נספג לתוך הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מד עוצמת קרינת UV, להגדיר את המרחק בין מקור UV גל ארוך ואת צלחת כזו שעוצמת על הצלחת הוא 500 μW / 2 4 ס"מ. הסר את מכסה האלומיניום המכסה לכסות ולחשוף את צלחת המכילה את התולעים TMP שטופלו על קרינת UV גל ארוך של 50 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים ומניחים את התולעים בחושך במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף והעברת בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי מסוכנים בעקבות הנחיות המוסד שלך כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציה של עניין. </li></ol> חלק 7: תוצאות נציג חלק פ ' פקיפיקוס פנוטיפים מוטנטים הנובע mutagenesis (או על ידי EMS או TMP / UV) מוצגות באיור 1. מוטציה לכל אחד יש פנוטיפ אופייני בקלות להבדיל בינו ובין החיה סוג בר. מ התולעיםשטופלו עם mutagen, 30 J3/J4 הזחלים מן הדור של ההורים (P0) הונחו צלחות נפרדות מותר להטיל ביצים, שהם דור F1. מתוך צלחות שהראו צאצאים F1 בריא, סך של 1000 F1s הועברו על צלחות הפרט צאצאים F2 הוקרן עבור פנוטיפים. בעלי חיים עם 5,6 הרעוע, 6 תיאום שנאי 7 פנוטיפים נמצאו. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Pristionchus סוג פקיפיקוס בר וחיות מוטציה. א ב wt wt אנדרוגינוס זכר ג dpy מוטציה ד UNC מוטציה E. tra מוטציה. למעלה שני פאנלים מראה סוג הרמפרודיט בר (משמאל) זכר (מימין) חיות להשוות עם מוטנטים שונים לוחות הנותרים.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Mutagenesis היא טכניקה מועסקים נרחב עבור מחקרים גנטיים שונים של אורגניזמים מודל ניסיוני. ניסויים mutagenesis משמשים לעתים קרובות כדי לזהות את הפונקציה של הגן 2. הנהלים mutagenesis המתואר כאן ניתן להשתמש לא רק על פ פקיפיקוס, אלא גם עבור ג אלגנס ושאר מיני נמטודות בנושא. כאן אנו מתארים את שתי השיטות, EMS ו-tmp / UV mutagenesis. EMS הוא חומר כימי שגורם מוטציות נקודה או מחיקות קטנות לאורך ...

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לשמור על נמטודות במעבדה וכיצד mutagenize אותם באמצעות שתי שיטות חלופיות: sulfonate מתאן אתיל (EMS) ו - 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen בשילוב עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). נמטודות הן מערכות ביולוגיות עוצמה עבור מחקרים בגנטיקה בגלל תוכנית פשוטה הגוף שלהם ואת מערכת הרבייה, המורכבת עצמית זבול הרמפרודיטים וזכרים כי ניתן להפיק מאות צאצאים לכל בעלי החיים. נמטודות נשמרות צלחות אגר המכיל דשא של חיידקים ניתן להעביר בקלות מהצלחת אחד למשנהו באמצעות להרים. EMS הוא סוכן אלקילציה נפוץ לגרום מוטציות נקודתיות ומחיקות קטן, בעוד tmp / UV גורמת בעיקר מחיקות. בהתאם מינים של נמטודות בשימוש, ריכוזים של EMS ו TMP יהיה חייב להיות מותאם. כדי לבודד מוטציות רצסיביות של פקיפיקוס נמטודות Pristionchus, בעלי חיים של דור F2 הוקרנו חזותית עבור פנוטיפים. כדי להמחיש את השיטות הללו, אנו mutagenized תולעים וחיפשתי מתואמים (UNC), גוצה (Dpy) ו שנאי (טרה) מוטנטים.

הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים (למשל,<em&gt; Pristionchus פקיפיקוס</em&gt;) במעבדה ולהראות שתי שיטות mutagenesis שונים, EMS ו-tmp / UV.

פרוטוקול זה מתאר נהלים לתחזוקת נמטודות במעבדה וכיצד לבצע להן מוטגנזה באמצעות שתי שיטות חלופיות: אתיל מתאן...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע שני פרוטוקולי מוטגנזה שונים הנהוגים ליצירת מוטנטים בנמטודות, כגון ceno, hepatitis elegance, ו-prisca. Pacificus. מוטגנזה היא כלי רב עוצמה לחשיפת תפקודי גנים. דבר זה מושג על ידי הכנת תרביות עם מספרים גדולים של תולעים בשלב הלרבלי האחרון לפני הבגרות, שבאמצעותן תבוצע המוטגנזה.השלב הבא הוא ביצוע מוטגנזה לתולעים באמצעות שני הליכים חלופיים: טיפול ב-ethyl methane sulfonate, או סור ומוטגנזה בשילוב עם קרינת ultraviolet. השלב השלישי של ההליך הוא העברה של תולעים שנראות בריאות לצלחות agri, שזרעו לאחרונה חיידקים המשמשים כמקור מזון. השלב הסופי של ההליך הוא סריקה לאיתור פנוטיפים מוטנטיים רלוונטיים בדור הראשון, השני או השלישי.שלום, אני ג'ור מהמעבדה של ד"ר אנדרה פרז, סילבה, במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת טקסס בארלינגטון. נהלי ה-T-M-P-U-V והמוטגנזה באמצעות EMS עוזרים לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הגנטי, כגון אילו גנים מעורבים בתהליכים ביולוגיים בעלי תפקיד חשוב במהלך ההתפתחות. שלום, שמי מניש פאר; למרות ששיטות המוטגנזה המוצגות הן עבור *Pristionycha pacificus*, ניתן להשתמש בהן באופן נפוץ מאוד עבור מודלים ניסיוניים אחרים, כגון נמטודת *Caenorhabditis elegans*, ואפילו עבור חוליתיים כמו דגי זברה.אם כן, בואו נתחיל. הפיק (pick) שלנו להעברת תולעים ממקום למקום עשוי מחוט בכילוי 30, המורכב מ-90% platinum ו-10% iridium. בעוד שחוקרים מסוימים עשויים להעדיף הרכבי מתכות שונים מעט לייצור הפיק, משתמשים גם בפיפטת מרעה (pasture pipette) כדי להחזיק את הפיק.התחילו בשבירת הקצה המוארך של פיפטת פסטור לאורך הנדרש. חתכו חוט באורך של כ-3 עד 4 סנטימטרים והכניסו ממנו 0.5 סנטימטרים פנימה. בתוך קצה פיפטת הפסטור, הנחילו את החוט לתוך הזכוכית מעל מבער בנזן.אורך התיל הבולט מהזכוכית הוא כ-3 עד 3.5 סנטימטרים, אך הוא עשוי להשתנות בהתאם להעדפה אישית. יש לשטח את קצה התיל הבולט בעזרת פלייר. לאחר מכן, כופפים את החלק המשטח כלפי מעלה כדי ליצור צורה של כף.לבסוף, שייפו את הקצוות החדים של הפיקה (pick) בעזרת נייר זכוכית כדי למנוע פגיעה בתולעת או באגר. כדי לדגום תולעים, עקרו את תיל הפיקה בלהבה, ולאחר מכן גררו את הקצה השטוח לאורך שטח גידול חיידקי (bacterial lawn) בצלחת NGMP כדי לצפות את הקצה בחיידקים דביקים ועבים. היו זהירים שלא לנקב או לפגוע במשטח האגרו, תוך שימוש במיקרוסקופ סטריאו ובעדינות רבה.השחקו את הקצה הדביק נגד התולעת שברצונכם לדגום עד שהתולעת תידבק לבקטריות שעל המקל. ברגע שהתולעת נמצאת על קצה המקל, העבירו אותה מיד לצלחת החדשה על ידי נגיעה או החלקה של קצה המקל נגד השטיח הבקטריאלי בצלחת החדשה. יש להיזהר לא לפגוע במשטח ה-agro של הצלחת, שכן התולעים עלולות לזחול לתוך החורים ולהפוך לקשות לשליפה.התולעת אמורה לזחול מהפיק כאשר נוגעים בקצה הפיק או מחליקים אותו כנגד השטח הבקטריאלי. אין להשאיר את התולעת על הפיק זמן רב מדי כדי למנוע התייבשות. נדגים מוטגנזה באמצעות EMS על ארבעה עד חמישה פטריות פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילות תולעי *Prisca pacificus* בשלב הלרואלי השלישי (L3).שטפו את התולעים מכל צלחת באמצעות שני עד שלושה מיליליטרים של M9 סטרילי לכל צלחת. צריכים להיות מספר מאות תולעים. אספו את התולעים לתוך מבחנה צנטריפוגה סטרילית חד-פעמית בנפח 15 מיליליטר.סובבו במערבל צנטריפוגה ב-1500 Gs למשך חמש עד שבע דקות או עד שהתולעים יוצרות משקע. שאבו את הנוזל והשתמשו בשני מיליליטר של M nine כדי לתלות מחדש את התולעים, תוך כדי חבישה של כפפות כפולות ועבודה במכסה עשן; הוסיפו 20 microliters של EMS למבחנה המכילה שני מיליליטר של M nine ונערה להמסה. לאחר מכן, הוסיפו תמיסה זו לשני מיליליטר של ת сусפנזיית תולעים וסובבו בעדינות.הריכוז הסופי של EMS יהיה 47 millimolar. הניחו את מבחנת הצנטריפוגה עם ה-paraform על רוקר במהירות נמוכה בתוך מ㠃 הפסח והמתינו שהתולעים יעברו אינקובציה במשך שלוש שעות וחצי. בתום שלוש וחצי שעות של אינקובציה, הניחו את המבחנה במצב אנכי והמתינו עד שהתולעים ישקעו; לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ושפכו אותו לתוך כוס כימית המכילה sodium hydroxide רגיל כדי לנטרל את ה-EMS שנוזל העליון.בכל פעם לפני הוצאת הידיים ממסך העשן, הקפידו לשטוף אותן גם בתמיסת סודיום הידרוקסיד בריכוז 1N. כדי לנטרל את ה-EMS, הוסיפו חמישה מיליליטרים של M9 לתולעים. הפכו את המבחנה 25 עד 30 פעמים כדי לשטוף את התולעים וסבבו בצנטריפוגה ב-1500 Gs למשך חמש עד שבע דקות, או עד שהתולעים יגבשו למשקע; לאחר הסבב בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון ושפכו אותו לתוך כלי איסוף עם סודיום הידרוקסיד בריכוז 1N.חזור על שלב שטיפה זה של הוספת M nine, צנטריפוגה והסרה של העלייה לפחות שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, השהה מחדש את משקע התולעים בכמות מינימלית של M nine, והעבר באמצעות פיפטה את תרחיף התולעים לצלחות NGM המכילות מדשאת של חיידקי OP 50. לאחר המתנה של מספר דקות לייבוש הנוזל, בחר והעבר זחלי J four שנראים בריאים לצלחות זריעה טריות.אפשרו לתולעי המוטגנים להפריה עצמית, וכעבור שמונה עד 10 ימים, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי לסרוק את הפנוטיפים של דור F2 לאיתור מוטנטים רלוונטיים מרובים. הליך זה למוטגנזה יודגם על תולעי ppac pacificus מארבעה עד חמישה צלחות פטרי בקוטר שישה סנטימטרים, שנאספו אל תוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר. הוסיפו 10 מיליליטר של M9 למשקע התולעים.הפוך את המבחנה 20 פעמים כדי לשטוף את התולעים וסבב בצנטריפוגה ב-1500 Gs למשך חמש דקות. השלך את העלייה לאחר הסבב. חזור על שטיפת התולעים ב-M nine סך הכל שלוש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, שאב את הנוזל והשהה מחדש את התולעים בנפח של כ-10 פעמים נפחן של M nine.לאחר מכן, הוסיפו 4,5,8-trimethyl SOREIN או TMP מתוך תמיסת מלאי בריכוז של 3 mg/mL כדי להגיע לריכוז סופי של 30 µg/mL. דגרו את המבנה עם ה-TMP בחושך, בטמפרטורה של החדר, על נעער (rocker) במהירות נמוכה למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את המבנה בצורה אנכית למשך 10 דקות כדי לאפשר לכל התולעים לשקוע; בסרטון זה המבנה מוצג ללא כיסוי, אך אין לחשוף את תמיסת ה-TMP לאור.מכיוון שכימיקל זה רגיש לאור, השתמש בפפטה כדי להוציא את התולעים מתחתית המבחנה ולהעביר אותן לצלחת NGM שאינה מושקעת. שמור את הצלחת בחשכה עד שיתספג ה-TMP העודף בצלחת. לאחר שה-TMP נספג בצלחת, ניתן להקרין את התולעים באור על-סגול.אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוצדורת הנוירוגנזה ב-TMP UV הוא שמירה על המרחק הנכון בין מקור ה-UV בעל הגל הארוך לבין הפלטה. לכן, עלינו לכוון את המרחק מספר פעמים כדי להשיג את עוצמת אור ה-UV הנכונה הנופלת על הפלטה. יש לתעד את העוצמה באמצעות מד העוצמה, ועליה להיות 500 micro watt per centimeter square.יש להשתמש בהגנה מתאימה על העיניים במהלך שלב זה בשל הסיכון הפוטנציאלי מאור UV. באמצעות מד עוצמת UV, קבעו את המרחק ממקור ה-UV בעל הגל הארוך שייתן עוצמה של 500 micro watts per centimeter squared.בשלב הבא, הסירו את נייר האלומיניום ואת המכסה והניחו את הפיתח המכיל את התולעים שטופלו ב-TMP במרחק מהמנורה כך שהעוצמה על הפיתח תהיה 500 micro watts per centimeter squared. חשפו את הפיתח לקרינת UV באורך גל ארוך למשך 50 שניות, כסו אותו והשאירו את התולעים בחשכה למשך חמש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש שעות, בחרו והעבירו לרוות J4 שנראות בריאות לפיתחים חדשים עם מצע מזון.לבסוף, סננו את דור F1, F2 או F3 כדי לאתר פנוטיפים רצויים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. מוצגים כאן כמה מפנוטיפי המוטנטים של ppac pacificus שזוהו בדור F2 לאחר מוטגנזה באמצעות EMS או T-M-P-U-V. שני הפאנלים העליונים בתמונות אלו הם דוגמאות להרמאפרודיט מסוג בר (wild type) וזכר מסוג בר (wild type).לכל מוטציה יש פנוטיפ אופייני שניתן להבחין בו בקלות מהחיה מסוג הבר (wild type). פאנל C הוא דוגמה למוטציית dumpy. פאנל D מראה מוטציית uncoordinated ופאנל E הוא של מוטציית transformer. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע מוטגנזה באמצעות EMS תוך ארבע שעות וחצי, ומוטגנזה באמצעות TMP uuv ניתן לבצע תוך חמש שעות וחצי אם היא מבוצעת כהלכה.פרק זמן זה כולל גם את זמן הדגירה. זכרו כי EMS ו-TMP הם חומרים מסוכנים ביותר, ובזמן העבודה איתם יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה, שימוש בכפפית כפולה, עבודה תחת מapay ושימוש במשקפי מגן. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

סרטון זה מתאר טכניקה לסינון מהיר של נמטודה בודדת לאיתור סמן גנטי על ידי בדיקת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו בודקים עריכת גנום מבוססת קריספר.

PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

Worm-align/Worm_CP היא זרימת עבודה פשוטה FIJI /CellProfiler שניתן להשתמש בה כדי ליישר וליישר דגימות אלגנס Caenorhabditis ולהבקיע תותלעת שלמה מבוססת תמונה assays ללא צורך בשלבי אימון קודמים. יישמו תולעת ליישר / Worm_CP לכימות של ביטוי הנגרמת הלם חום בבעלי חיים חיים או טיפות השומנים בדגימות קבועות.

ליישר תולעת Worm_CP, שני צינורות קוד פתוח ליישור וכימות של נתוני תמונה פלואורסצנטיים המתקבלים מ- Caenorhabditis elegans

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט מביאים את המגוון המיקרוביאלי שנמצא בטבע למעבדה כדי להקל על מחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans. מובאים כאן פרוטוקולים להקמת ניסויי מיקרוקוסמוס, כאשר הניסויים מדגימים את היכולת לווסת את המגוון המיקרוביאלי הסביבתי כדי לחקור את הקשרים בין המגוון המיקרוביאלי הסביבתי לבין הרכב המיקרוביום של מעי התולעים.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול נמטודות בודדות מבודדות על מדיה מוצקה בהתקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים. גישה זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך חייהם עבור מגוון פנוטיפים הקשורים להזדקנות ולבריאות, כולל פעילות, גודל וצורת גוף, גיאומטריה של תנועה והישרדות.

תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

למד שיטות מוטגנזיס EMS ו-TMP/UV ב-Pristionchus pacificus לזיהוי גנים מעורבים בתהליכים ביולוגיים. שיטות אלו מסייעות לחוקרים לחקור תפקוד גנים בחיים.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

גלה סרטונים נוספים