Name: במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד שתל בתוך הרחם בעכברים לחקר תאי גזע וטיפול גני. שיטה זו מאפשרת השתלת תאים או וירוסים לעוברים ומדידת השתלבות תאית באמצעות PCR וציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מקורות המימון שלנו: המכון בקליפורניה הרגנרציה לרפואה קלינית הדרכה עמית גרנט (), הקרן הלאומית למדע (MW), פרס איירין Perstein (TCM), הקולג&#39; האמריקאי של המנתחים (TCM), האגודה האמריקאית לרפואת ילדים כירורגי ( TCM), ואת מצעד הפרוטות (TCM).

1. הכנת pipettes Injection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את חולץ פיפטה כזה הפרדת פיפטה זכוכית מתרחשת תוך 15 שניות (ראו הוראות היצרן לגבי כיול). פיפטה יהיה להתחדד שבו הוא מפריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה פיפטה כך את המרחק מתחילת להתחדד לסוף פיפטה הוא 1.04cm כדי 1.05cm. אורכו של פיפטה עומדת ביחס הפוך בקוטר של פתח פיפטה. שים לב כי קבלת פיפטה יותר גם התוצאות טיפ חלש כי הוא רגיש יותר שבירה במהלך ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הבא בקבלת פיפטה היא ליצור שיפוע חלקה על ידי חידוד טיפ על גלגל השחזה יהלום. בזמן חיתוך פיפטה לגודל המתאים, פיפטה הפסקות תכופות עם שפוע טבעי בקצהו אשר חייב להיות בשימוש בעת הצבת פיפטה על ההגה. במהלך תהליך זה, חשוב בעדינות שאר פיפטה על ההגה חידוד ומדי פעם להעריך מחדש כדי לוודא פיפטה עדיין לגעת בהגה (כמו שפוע הופך חלק יותר, זה יהיה לאבד קשר עם ההגה השחזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שפוע חלקה, קצה פיפטה חייב להיות מחודד (איור 1). הגבהה של פיפטה כך זה כבר לא נוגע גלגל השחזה, לסובב אותו עם כיוון השעון על 10-50 מעלות, במקום לחזור פיפטה על ההגה השחזה מסתובבת עבור ~ 10 שניות. למשוך את פיפטה מן ההגה חידוד ועכשיו לבחון את קצה. שלב זה בדרך כלל יש צורך לחזור עם כמה התאמות קטנות כדי ליצור קצה חד. אם פיפטה ממוקם בקצה שלה במשך זמן רב מדי, הוא סיכוי גבוה יותר לפתח משטח אחיד (איור 1). לאחר השלמת צד אחד, אתה יכול להמשיך לחדד את הקצה השני על ידי חזרה על השלבים שלעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטוש בלתי מחיק למתוח קו ההיקפי כל 4mm המוצא שבו להתחדד של פיפטה מתחיל. לצבע אלה מתאימות 5uL של נפח. </li></ol> 2. ברחם להשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת החומר להזרקה (תאים לדוגמא, וירוס, וכו ') אתה יכול להגדיר עבור הזריקה. אנו משתמשים microinjector מחוברים אוויר דחוס עם ההגדרות הבאות: (הגדרות לחץ: קלט 60-80 psi, למלא 40 psi, להזריק 8-12 psi, 0 psi איזון, החזק 0 psi; זמן הזרקת 100 אלפיות השנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את פיפטה הזרקה, לנקות אותו פעמיים עם EtOH 70% ואחריו פעמיים עם סטרילי 1X PBS. כאשר קצה פיפטה הוא שביר מאוד, אנחנו לא ממליצים מעוקר pipettes ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקות יכול להיעשות באמצעות 2.5x-3.5X loupes הגדלה או מיקרוסקופ לנתח. הכנת שטח נוהל שלך בשמיכה מחממת, תאורה, מכשירי ניתוח הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בהריון (אנו מנצלים isoflurane וחמצן שיישלח באמצעות יחידת זרימה רציפה הרדמה). הנח את העכבר על כרית חימום במצב להדביק פרקדן וכל איבר עם קלטת כדי לאבטח את העכבר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ פרווה. ואז, כפפות כירורגיות סטריליות, מכין את הבטן עם 10% povidone-יוד ואחריו אלכוהול, להזריק כגון כאבים כמו עצירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך 1cm בבטן התחתונה (ההיבט נחות ביותר של החתך צריך להיות כ 1cm מעולה introitus). לחתוך את העור ואת fascia. היזהר שלא לפצוע את אברי הבטן (המעיים ושלפוחית ​​השתן) אשר מיד מתחת לשכבה דקה של fascia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת צמר גפן, בעדינות למתוח את fascia ולספק את הרחם הרה להולדת דרך החתך. ספירת המספר הכולל של העוברים על ידי הראשון לזהות את השחלות ימין ועל שמאל כדי לוודא שאתה לדמיין את הרחם כולו. מניחים את הרחם בחזרה בחלל הבטן לפני שתמשיך כך עוברים נשארים חמים בעת להתכונן זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את העוצמה המתאימה של חומר במספר העוברים אתה מתכוון להזריק. בזמן מילוי את המחט עם מדגם שלך, חשוב לשמור על קצה פיפטה טבלו להימנע aspirating מדגם לתוך צינורות microinjector. מאז הם בדרך כלל תאים בנפח קטן, אנחנו בדרך כלל למקם אותם microfuge קטן (לשעבר: 0.5mL) צינור או ישירות על פיסת Parafilm להיות מסוגל למלא את המחט בלי לשבור את קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק כל העובר ולזהות את החלק של העובר בכוונתך להזריק (כבד למשל, חלל הצפק, רגל, וכו '). עם האגודל לאצבע המורה, אתה חייב לייצב את העובר בתוך חלל מי השפיר, כך שהוא אינו מסתובב בעת ביצוע ההזרקה. חשוב להחזיק את העובר מספיק חזק כדי לייצב אותו בעדינות עדיין מספיק כדי למנוע פגיעה בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף את פיפטה דרך הרחם, amnion, עור העובר, אל איבר המטרה. אם פיפטה היא חדה, היא צריכה לעבור בקלות דרך רקמות אלו. אם קצה פיפטה הוא משעמם, אתה wi האהלה הודעה הרחם והקרומים השפיר יהיה. להזריק את נפח הרצויה לתוך העובר כל אחד. זה הכרחי כי התנועות שלך להיות יציב בתקופת ההחדרה, הזרקה, ונסיגה של פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בנפח הרצוי מוזרק, למשוך את פיפטה בזהירות. אם נעשה כראוי, החומר לא אמור לדלוף החוצה מחלל הרחם מי שפיר או. אם חור גדול נוצר amnion, אשר ניתן לזהות על ידי דליפה של מי שפיר, אז הישרדות היא בסכנה. לבסוף, ללימודים שכוללות קצירת לאחר הלידה, עוברים כל חייב לקבל זריקות מושלם מבחינה טכנית, שכן אין שום דרך להבחין בעוברים הזריק uninjected לאחר הלידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה מבצע זריקות לתוך הכבד העוברי, אתה עלול מדי פעם לראות דם קצה פיפטה לאחר מסוגר, זה מאשר שאתה במצב הנכון לא אמור להשפיע על ההישרדות. אם ביצוע התוך צפקי זריקות, במטרה מעט מתחת בכבד העובר. זריקות לשריר, ייתכן עמדת העובר כדי לזהות את הירך עצם הירך לבין להזריק את השריר הכואב. לבסוף, זריקות תוך חדרי, קל לראות את התפרים העטרה לכוון את פיפטה ליעד המתאים. זריקות אלו, טפטפות בקוטר מעט גדול יותר נדרשים כדי לחדור את הגולגולת בלי לשבור את פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בזהירות המקום הרחם חזרה לתוך חלל הבטן. ודא הוא אינו מעוות על עצמו או סביב אספקת הדם שלה. ספק 1mL של סטרילית 1X PBS ב חלל הצפק של האם להחליף את כל הנוזלים שאבדו במהלך ההליך. סגירת החתך עם תפר 2 שכבות קלועה 5-0 נספגים (לשעבר: Vicryl). קודם לסגור את fascia מבלי לפצוע את המעי או שלפוחית ​​השתן הבסיסית, ולאחר מכן סגור את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, שלאחר הליך תרופות יכול להיות מנוהל על שיכוך כאבים. חזור כל נקבה מוזרק לכלוב יחיד משלו במקום את הכלוב על שמיכה מחממת. צג את העכבר עד שהוא זקוף. שים מצע בכלוב והמקום העכבר באזור שקט של המתקן העכבר איפה שזה לא צריך להיות מופרע (כלומר ללא ניקוי הכלוב) עד מספר ימים לאחר הלידה. צמצום כל הלחץ נוספים החיה יקטין את הסיכויים של צירים מוקדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהשלמת את הזריקות, נקי פיפטה שלך פעמיים עם סטרילי 1X PBS ו EtOH פעם אחת עם 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקבות מוזרק יש לשים לב יומי כדי להבטיח שהם מחלים ההליך ללא קושי. החתך צריך להיות פיקוח על סימני נפיחות ודלקת, הפרדה הפצע, אחרים של זיהום. משככי כאבים לאחר הניתוח יכול להינתן לפי הצורך. </li></ol> 3. נציג תוצאות: ההישרדות של עוברים מוזרק לאספקה ​​לטווח הוא הגורם המגביל העיקרי להצלחה עם טכניקה זו. בהתאם הזריקו את החומר ואת המתח של העכבר בשימוש, שיעורי ההישרדות יכול להשתנות. באופן כללי, זריקות של תאים hematopoietic לתוך wild-type עכברים ב E14 צריך להביא לפחות 50% חיים שנולדו הגורים. שיעור גבוה יותר של הישרדות אפשריים בהתאם גם את ההיבטים הטכניים של הזריקה, כמו גם את המאפיינים של עכברים להיות מוזרק. מזעור הטראומה הממברנות הרחם מי שפיר הוא ההיבט הטכני החשוב ביותר של פרוטוקול זה. שארפ, טפטפות בקוטר קטן תגרום טראומה מינימלית הרחם במהלך ההזרקה. אנחנו לא ממליצים על שימוש במחטים זריקה רגילה כמו ברמה של טרום מפוברק מחטים גדול מדי יגרום חור גדול הרחם. זכוכית בעבודת יד pipettes הזרקת הם רק מחטים בקוטר קטן יכול להיות מנוצל עבור זריקות ב ברחם. טכניקה ניתוחית זהירה וקפדנית, כולל טיפול עדין של הרחם הרדמה קצר היא קריטית גם עבור תוצאות אופטימליות. המאפיינים הספציפיים של העכברים הנמען כגון רקע גנטי, גיל ההריון, והגודל החול יכול להשפיע גם על הישרדות. זנים מסוימים של עכברים רגישים יותר צירים מוקדמים אובדן הריון בהתאם הרקע הגנטי שלהם. טראנסגנטי 15 חיות עם מומים או שרירים ניווניות יכול להיות בעל יכולת לקויה לספק עוברים נרתיקית לאחר שעברו פיום בטן קו האמצע. 8 אלה נשים בהריון עשויים לדרוש מסירה על ידי ניתוח קיסרי סעיף. מצאנו גם כי גיל ההריון בזמן הזריקה יכולה להשפיע על הכדאיות. עוברים כי הם מתחת לגיל 12 יום עובריים יש שיעור נמוך יותר של הישרדות מאשר עוברים יותר. לבסוף, מצאנו כי בגדלים אשפה גדול (&gt; 10 עוברים) נוטים להיות בעלי שיעור גבוה יותר של מות העובר לאחר ההזרקה. שימו לב לשני ההיבטים הטכניים של הטכניקה הזו ואת המאפיינים הספציפיים של העכברים להיות מוזרק יכולים למקסם ההישרדות של עוברים מוזרק. ve_content "&gt; כאשר שיטות אלה מבוצעות כראוי, אפשר לצפות כי כל העוברים נחשפים לחומר המוזרק. בדומה להגדרה לאחר הלידה, לעומת זאת, ההפצה המוצלחת של תאים או נגיפים ברחם לא תמיד התוצאה engraftment תורם התא או גן ביטוי, בהתאמה. engraftment בתאי גזע, למשל, תלויה במספר גורמים כגון המינון ואת המקור של התאים המושתלים. כמו כן, ההצלחה של התמרה ויראלית היא, בין השאר, נקבע לפי סוג של וקטור ויראלי בשימוש. צריך להבין את הגורמים הרבים הישרדות השפעה הגור, engraftment הסלולר, ו transduction ויראלי כדי להשיג הצלחה עם פרוטוקול זה. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. דיאגרמה המתארת ​​נכונה חידוד של pipettes הזרקה (שלב 1.4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
<li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li>
<li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li>
<li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li>
<li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li>
<li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li>
<li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מעל 50 שנים, בילינגהם, ברנט, ו מךוואר בשימוש ברחם השתלה בעכברים כדי לגרום סובלנות החיסונית חלבונים זרים. 16 מאז, כמה וריאציות של טכניקה זו שימשו כדי לענות על שאלות באימונולוגיה וביולוגיה בתאי גזע. פרוטוקול מפורט כאן היא אחת מהשיטות הנגיש ביותר עבור IUT. הכבד העוברי מציעה יעד דמיינו בקלות ומספקת גישה מחזור מערכתי באמצעות הפורטל וורידים הכבד. עם זאת, מספר שינויים תוארו על מנת לייעל את התזמון ואת...

<table><tbody><tr><td>פיפטות</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת פיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר להשחזת פיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

A Mouse Model of in Utero Transplantation

השתלת בתאי גזע ווירוסים ברחם יש פוטנציאל עצום בטיפול בהפרעות מולדים בעובר אנושי. לדוגמה, השתלה ברחם (IUT) של בתאי גזע hematopoietic שימש בהצלחה לטיפול בחולים עם כשל חיסוני חמור 1,2. משולב בתנאים אחרים, לעומת זאת, IUT כבר ניסו ללא הצלחה. 3 בהתחשב אלה תוצאות מעורבות, בזמינות מודל לא אנושיים יעיל ללמוד את sequelae הביולוגי של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי הוא קריטי כדי לקדם את התחום. אנו ואחרים השתמשו במודל עכבר של IUT ללמוד הגורמים המשפיעים engraftment מוצלח של ברחם התאים המושתלים גזע hematopoietic הן wild-type 4-7 עכברים ואנשים עם מחלות גנטיות. 8,9 סביבת העובר גם מציע יתרונות ניכרים עבור ההצלחה של בריפוי גנטי ברחם. לדוגמה, משלוח של 10 adenoviral, adeno הקשורים נגיפית 10, retroviral 11, 12,13 ו וקטורים lentiviral לתוך העובר הביא התמרה של איברים מרובים רחוקים הזריקה במבט לטווח ארוך גן. ברחם ריפוי גנטי ולכן עשוי להיחשב כאסטרטגיה טיפול אפשרי להפרעות גן יחיד, כגון ניוון שרירים או סיסטיק פיברוזיס. יתרון נוסף של IUT פוטנציאל הוא היכולת לגרום סובלנות החיסון אנטיגן ספציפי. כפי שראינו אצל עכברים עם המופיליה, את ההקדמה של פקטור IX מוקדם בתוצאות פיתוח סובלנות חלבון זה. 14 בנוסף השימוש בו בחקירת טיפולים פוטנציאל אנושי, המודל של העכבר IUT יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. לדוגמה, ניתן להעביר מולקולות קטנות שונות כדי לעורר או לעכב ביטוי גנים ספציפיים בשלבים הריונית מוגדרת ולטפל מסלולים התפתחותיים. ההשפעה של שינויים אלה ניתן להעריך את timepoints שונים לאחר ההשתלה הראשונית. יתר על כן, אפשר להשתיל pluripotent או שושלת ובתאים ספציפיים לסביבה העובר ללמוד בתאי גזע בידול בסביבה לארח לא מוקרן ו בשלוות נפש. במודל עכבר של IUT סיפקה כבר תובנות רבות בתחומי אימונולוגיה, ביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. בפרוטוקול וידאו מבוסס זה, אנו מתארים גישה צעד אחר צעד לביצוע IUT בעוברים העכבר מתאר את הצעדים ביקורתית בעיות פוטנציאליות של טכניקה זו.

המודל של העכבר<em&gt; בתוך הרחם</em&gt; השתלת הוא כלי רב צדדי, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את יישומים קליניים פוטנציאל של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי בעובר. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה כללית ביצוע הטכניקה הזו

השתלה של תאי גזע ווירוסים ברחם (in utero) טומנת בחובה פוטנציאל עצום לטיפול בהפרעות מולדות בעובר האנושי. לדוגמה, ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשריג תאים או וירוסים לעוברי עכבר. ראשית, בצעו חתך בצד הבטני של העכבר. לאחר מכן, הוציאו את הרחם ואת העוברים אל מחוץ לגוף, ואז בצעו את ההזרקות תוך הרחם (in utero).לבסוף, החזירו בעדינות את הרחם אל חלל הפריטונאום וסגרו את הפסציה הבטנית ואת העור. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המדגימות השתרבות תאית או ביטוי גני באמצעות PCR, ציטומטריה של זרימה או אימונוהיסטוכימיה בהשתתלת תאי גזע ברחם ובטיפול גני. באמצעות האסטרטגיות החדשניות שלנו לטיפול בהפרעות מולדות לפני הלידה, נוכל לנצל את מערכת החיסון העוברית הבלתי בשלה כדי להשרות סבילות לתאים אלוגניים או ליצירת חלבונים.מודל העכבר להשתלה בתוך הרחם (in utero) מאפשר לנו לחקור את הגורמים הביולוגיים הייחודיים לעובר, אשר מובילים להשראה מוצלחת של סבילות להשתבת (engraftment intolerance induction). טכניקה זו תוצג כעת על ידי Amer Nial, מנתח ועמית פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. הכנת פיפטות ההזרקה מתחילה במתיחת פיפטות זכוכית באמצעות מושך פיפטות (pipette puller) שכויל כדי לאפשר את הפרדת הפיפטה.בתוך 15 שניות, מקמו את הפ pipette בתוך ה-pipette puller ואבטחו אותה במקומה באמצעות התפסים העליונים והתחתונים. לאחר מכן, לחצו על כפתור המשיכה. הפילמנט יתחמם וה-pipette תהיה נפרדת.בפיפטה יהיה חלק מוצר (taper) שבו היא נפרדת; גזרו את קצה הפיפטה כך שהמרחק מתחילת ההצרָה ועד לקצה הפיפטה יהיה 1.04 עד 1.05 סנטימטרים. זאת מכיוון שאורך הפיפטה נמצא ביחס הפוך לקליבר של פתח הפיפטה. יצירת פיפטה ארוכה יותר תביא לקצה חלש יותר שיהיה רגיש יותר לשבירה במהלך ההזרקה, ועלולה להשפיע על הישרדותו של העובר של העכבר המוזרק.כדי ליצור שיפוע (bevel) חלק, יש להשחיז את קצה הפ pipette על גלגל השחזה מיהלום. הפעילו את הגלגל ולאחר מכן הורידו בעדינות את הפ pipette על גלגל ההשחזה המסתובב. כאשר הפ pipette נחתכת לראשונה, היא תישבר לרוב עם שיפוע טבעי.במידה והקצה דורש זאת, יש לבחון תקופתית את הפ pipette דרך המיקרוסקופ המחובר כדי לוודא שהpipette עדיין נוגעת בגלגל. זאת מכיוון שככל שהשיפוע הופך לחלק, היא תאבד מגע עם גלגל השחז). ברגע שהשיפוע חלק, יש להשחיז את קצה הpipette.הרימו את הפיפטה כך שלא תהיה במגע עם גלגל ההשחזה. סובבו אותה עם כיוון השעון בזווית של 10 עד 50 מעלות והניחו אותה חזרה על גלגל ההשחזה המסתובב למשך כ-10 שניות. הימנעו מהנחת הפיפטה על קצהה למשך זמן ממושך מדי, כדי למנוע היווצרות של פני שטח לא אחידים.הוציאו את הפ pipette מגלגל השחיזה ובחנו את הקצה. שלב זה דורש בדרך כלל חזרה עם מספר התאמות קטנות כדי ליצור קצה חד. לאחר השלמת צד אחד, שחזו את הקצה הנגדי באותו אופן כפי שהודגם כעת.דיאגרמה זו מציגה את ההשחזה הנכונה של פיפטות ההזרקה, מבט מלמטה על שיפוע מחט שהושחזה כראוי, ומבט מהצד של פיפטה בעלת קצה לא אחיד, כפי שמוצג כאן. לבסוף, השתמשו בטוש קבוע כדי לסמן קו היקפי. בכל 4 mm החל מהנקודה שבה מתחיל ההיצרות של הפיפטה, סימונים אלו תואמים לנפח של 5 µL.לאחר הכנת ההזרקה, הפ pipette והחומר להזרקה, ניתן להתחיל בהכנות להזרקות. ראשית, נקו את ה-pipette להזרקה פעמיים עם XPBS, טבלו את ה-pipette ב-PBS ולחצו על כפתור המילוי עד שיישאבו מספיק נוזל כדי למלא את ה-pipette. לאחר מכן, בדקו את ה-PBS.בשלב הבא, הכינו את אזור הפרוצדורה עם שמיכת חימום, תאורה ומכשירי הניתוח הדרושים. ההזרקות יבוצעו באמצעות לולאות הגדלה כירורגיות של 2.5x. בהדגמה זו, למרות שניתן להשתמש גם במיקרוסקופ דיסקציה, הניחו את העכבר המורדם על משטח חימום בתנוחת גב (supine) וקבעו כל גפה באמצעות סרט דביק כדי להבטיח את יציבות בעל החיים במקומו.לאחר גזירת הפרווה, הכין את הבטן באמצעות 10% povidone iodine, ולאחריו אלכוהול; וודא באמצעות לחיצה על בהונות שהבעל חיים מורדם לחלוטין. לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר אחד בבטן התחתונה. החלק התחתון ביותר של החתך צריך להיות כסנטימטר אחד מעל ה-u, לאחר מכן חתוך את העור ואת הפסציה.הזהרו לא לפגוע במעיים ובשלפוחית השתן, הנמצאים מיד תחת שכבת הפציה הדקה. בעזרת מקלוני צמר, מתחו בעדינות את הפציה והוציאו את הרחם דרך החתך. זהו את השחלה הימנית והשמאלית כדי לוודא שאתם רואים את הרחם כולו, ולאחר מכן ספרו את המספר הכולל של העוברים.החזירו את הרחם לחלל הבטן לפני שתמשיכו, כדי שהעוברים יישארו חמים בזמן שאתם נערכים להזרקות. מכיוון שהחומרים להזרקה הם בדרך כלל בנפח קטן, אנו נוהגים להניח אותם במבחנה קטנה של מיקרו-צנטריפוגה כדי שניתן יהיה למלא את המחט מבלי לשבור את קצה הפיפטה. מכיוון שההזרקות הן החלק המאתגר ביותר בהליך זה, טכניקה טובה הגורמת למינימום טראומה לרחם היא קריטית להצלחת שיטה זו.יש להחזיק את העוברים בחוזקה, אך בעדינות מספיקה כדי למנוע נזק. כמו כן, חיוני שהתנועות יהיו יציבות במהלך הכנסת המחט והוצאת הפפטה. שאבו את הנפח המתאים של החומר עבור מספר העוברים שבכוונתכם להזריק.חשוב להרחיק את קצות השפיריטות מהדגימות כדי למנוע שאיבה של הדגימה לתוך צינורית המיקרו-מזרק. החזקו בעדינות עובר וזהו את החלק בעובר שבו אתם מתכננים להזריק. בהדגמה זו, נזריק לכל עובר בחלק גוף שונה, כאשר הראשון הוא כבד העובר.בעזרת האגודל והאצבע המורה, ייצב את העובר בתוך חלל השיליה כך שלא יסתובב בזמן ביצוע ההזרקה. כדי להזריק לכבד, הכנס בזהירות את הפיפטה דרך הרחם, השיליה ועור העובר, ואל תוך כבד העובר. פיפטה חדה אמורה לעבור בקלות דרך רקמות אלו.הזריקו את הנפח הרצוי אל העובר והוציאו את הפפטה בעדינות. בעת הזרקות תוך-peritoneal, חובה שהתנועות יהיו יציבות במהלך הכנסת הפפטה, ההזרקה וההוצאה. הפפטה מוחדרת גם דרך הרחם, השליה (amnion) ועור העובר, אך מכוונת מעט מתחת לכבד העובר.הזריקו את הנפח הרצוי להזרקות תוך-שריריות. מנו את העובר כדי לזהות את הירך ואת הפמור, והזריקו לשריר הישבן. עבור הזרקות תוך-חדריות, ניתן לראות בקלות את התפרים הקורונליים כדי לכוון את הפיפטה למטרה המתאימה להזרקות אלו.נדרשות פיפטות בעלות קוטר גדול יותר מעט כדי לחדור את הגולגולת מבלי לשבור את הפיפטה. במחקרים הכוללים איסוף לאחר הלידה, כל העוברים חייבים לקבל הזרקות מושלמות מבחינה טכנית, מכיוון שאין דרך להבחין בין עוברים שהוזרקו לכאלה שלא הוזרקו לאחר הלידה. אם ההזרקות בוצעו כראוי, חומר לא אמור לדלוף מהחלל השלייתי או מהרחם.לאחר הזרקת העוברים, החזירו בזהירות את הרחם אל חלל הבטן, תוך וידוא שאינו פיתול על עצמו או סביב אספקת הדם שלו. מזריקו 1 mL של XPBS אל חלל הפריטונאום של האם כדי להחליף כל נוזל שאבד במהלך הפרוצדורה. סגרו את החתך בשתי שכבות באמצעות תפר ספיג braided 5-0.ראשית, סגור את הפסציה מבלי לפגוע במעיים או בשלפוחית השתן שמתחתיה, ולאחר מכן סגור את העור. לבסוף, החזר את הנקבה המוזרקת לכלוב האישי שלה. הנח את הכלוב על שמיכה מחממת והכנס חומר מצע לכלוב.המקם את העכבר באזור שקט במכון לעכברים, שבו לא יופרע עד מספר ימים לאחר האספקה. מזעור של כל לחץ נוסף על בעל החיים יפחית את הסיכויים ללידה מוקדמת. תוצאים מייצגים של השתבצויות תאים תורמים לאחר השתלה תאית בתוך הרחם מוצגים כאן. עוברים ביום עוברי 14K קיבלו השתלה של תאי גזע המטופואטיים חיוביים ל-GFP.לאחר מכן בוצע דגימת דם פריפריאלי בגור קימרי כדי לזהות ביטוי GFP של תאי תורם באמצעות ציטומטריה של זרימה, אשר אישרה את נוכחותם של תאי התורם. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן ההכנה של פיפטורי הזרקה וביצוע הזרקות תוך-רחמיות. ברגע ששיטות יסוד אלו נשלטו.ניתן לשנות שיטה זו כדי להזריק עוברים בגילאים גסטציוניים שונים לצורך חקר ביולוגיה בסיסית של התפתחות ותאי גזע.

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

תיאור אינדוקציה הניתוח של אנדומטריוזיס בעכברים וחולדות על ידי השתלת אוטומטית של רקמת הרחם אל מפל העורקים של mesentery המעי.

עכבר דגם של אנדומטריוזיס בניתוח המושרה על ידי השתלת אוטומטי של רקמות הרחם

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

פיתחנו מודל של chorioamnionitis כדי לדמות חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) ללא סיבוכים של אורגניזמים חיים כדי לבחון את ההשפעות של FEMI על התפתחות מערכת העיכול של הצאצאים. זה מאפשר מחקר של סיבות מכניות להתפתחות של פגיעה במעיים בעקבות chorioamnionitis.

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

מחקר זה מציג מודל עכבר חדש שתוכנן במיוחד כדי לדמות אנדומטריומה, תת-סוג משמעותי קלינית של אנדומטריוזיס. על ידי שימוש בעכברי C57BL/6J, המודל שואף להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס אי פוריות הקשורה לאנדומטריומה, ומציע כלי מעודן לגשר על פער הידע הנוכחי ברפואת הרבייה.

הקמת מודל עכברי ניסיוני של אנדומטריומה כדי לחקור את אי הפוריות הקשורה אליה

למד שתל בתוך הרחם בעכברים לחקר תאי גזע וטיפול גני. שיטה זו מאפשרת השתלת תאים או וירוסים לעוברים ומדידת השתלבות תאית באמצעות PCR וציטומטריית זרימה.

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

גלה סרטונים נוספים