Name: פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: למד הכנת פרוסות אורגנוטיפיות מעוברי עכברים מבטאי GFP לצפייה בזמן אמת בצמיחת עצבים שדרתיים לכיוון הפריפריה. שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם בביולוגיה התפתחותית ובמדעי העצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים המקור לרעיון לבצע התרבות פרוסה על עוברי עכברים 5. ברצוננו להודות יואכים קירש תמיכה מדעית נדיב אנה Degen עבור מתנהג כמו גופר שלנו במהלך הצילומים. עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמנית (דויטשה Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) של אוניברסיטת היידלברג (Cluster אקסלנס רשתות סלולריות).

חלק 1: הכנת לחתוך culturing. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 ס"מ תרבות צלחות רקמה עם חיתוך בינוני (DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, גלוטמין 1 מ"מ, 2.5 HEPES מ"מ, pH 7.3) ו - 3 ס"מ Millicell-CM-0.4 מיקרומטר תרבות מוסיף קרום ושומרים החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 4% נמוך נקודת התכה agarose ב PBS במיקרוגל ולשמור אותו על צלחת חימום כך שהוא נשאר על כ 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 10 ס"מ צלחות פטרי עם בקטריולוגית PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8mM KH 2 PO 4) ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת התקן קירור microtome או להבטיח מגש חיץ וקירור אלמנטים מאוחסנים במקפיא מראש לקרר אותו. </li></ol> חלק 2: הטבעה העובר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עוברים מן הרחם ולבחון אותם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבדוק ביטוי של GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מקום על הפוך 10 ס"מ צלחת פטרי ו להתמצא אותם באמצעות רצועות נייר Whatman להסיר PBS מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל agarose על העובר כדי לתקן את זה במצב הזה. בואו agarose לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבל את האזור המקיף את העובר על ידי חיתוך בסכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העובר מוטבעים על הצד השני שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל agarose נוסף על הרקמה העוברית כדי להבטיח את העובר מוטבע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לחסום agarose עם קצוות נקי להתקינה על vibratome צ'אק באמצעות Loctite 406, דבק מיוחד דומה "דבק בדבק מגע". </li></ol> חלק 3: בחותכו ההליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מגש חיץ precooled ואת אלמנט הקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צ'אק עם הרקמה דבוק ולהוסיף 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + ללא HBSS, 10 mM HEPES חיץ pH 7.3, 500 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין) מכוסה עד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ולתקן להב precleaned (70% אתנול) microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 350-450 מיקרומטר פרוסות ולהעביר אותם באמצעות קיצור זכוכית pipettes פסטר לתוך צלחות תרבית הרקמה כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים, להסיר בזהירות agarose מתוך כל פרוסה ולהעביר Millicell ממברנות תרבות. כ 4 פרוסות יכול להיות מתורבת על קרום אחד צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות מלא מ"ל 6 של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 (בינוני תרבות: DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, 1mm גלוטמין, HEPES 2.5 מ"מ, pH 7.3). אם אחד מבצע זמן לשגות סדרה הדמיה אחד צריך לשמור על נפח קבוע בינוני. במקרה של סדרה הדמיה מתוזמנים עבור פרק זמן קצר זה מספיק כדי להשאיר את המדיום כפי שהוא. במשך תקופות ארוכות יותר שינויים בתרבות לאחר 12-20 שעות מומלץ. </li></ol> חלק 4: תוצאה הדמיה עצב עמוד השדרה על המיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה העצבים של עמוד השדרה הצבת 10 ס"מ תרבות צלחת רקמות, המכיל ממברנות Millicell תרבות עם פרוסות, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הכיוון של ממברנות Millicell התרבות על הבמה מיקרוסקופ לעמדה נכונה במהלך הנקודה הדמיה בפעם הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב השדרה תמונה תולדה באמצעות 4x (מספרי הצמצם [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), או 20x (NA 0.5) מטרות. </li></ol> איור 1 מציג סדרת הדמיה המתארת ​​את תולדה עצב עמוד השדרה במהלך 20 שעות של תרבות עם מטרות 10x ו 4x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 Imaging סדרת תולדה עצב השדרה פרוסת רוחבי של העובר tauGPF הומוזיגוטים. * = הנוירונים המנוע של חוט השדרה הגחון, חץ = DRG. הגבי (D)-הגחוני (V) ציר של הפרוסה מצוין. Scalebars: 200 מיקרומטר.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

לשם השוואה מקיפה של שיטות להכין תרבויות פרוסה עובריים של אמצע ההיריון עוברי עכברים (E10 - E12), ראינו כי vibratome מייצר ללא ספק את התוצאות הכי אמין לגבי הכדאיות הן הכוללת של תרבויות ושל שחזור של תוצאה העצב דפוסי. לעומת זאת, פרוסות מוכן באמצעות מסוק רקמות McIlwain 3 התבררה inviable לחלוטין. העסקנו במקור שיטה הגיליוטינה 4, שבו כל המלטה של עוברים יכולה להיות מוכנים בו זמנית על ידי חיתוך עם חוטי טונגסטן עטוף סדרתי סביב חיתוך באח לייצר 400 מיקרומטר בסעיפים 1...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>כלי ניתוח</td><td>Fine Science Tools</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>נייר Whatman</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>פיפטאות מקוצרות שעברו עיבוד באש (Fire-polished)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רבייה עוברי (FBS)</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ויברטום</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח</td><td>מערכת דימוי רכה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סבבי Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית של 10 ס"מ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>להבי תער</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>נראה שטרם סופק טקסט לתרגום. אנא שלח את התוכן באנגלית ואתרגם אותו עבורך לעברית אקדמית ומדעית, בהתאם להנחיות שסופקו.</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>סדרת PL</td><td></td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;סדרת PH</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>מערכת דימות רכה</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>ציוד לתא חימום</td><td>Leica Microsystems</td><td>בקר CTI-Controller 3700 ואינקובטור S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

פורסים תרבות organotypic של ה-gfp-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

למטרות רבות, טיפוח vivo עוברי עכבר לשעבר כמו פרוסות organotypic רצוי. לדוגמה, אנו מעסיקים קו עכבר מהונדס (tauGFP) שבו גרסה משופרת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) באה לידי ביטוי באופן בלעדי את כל הנוירונים של מערכת העצבים המרכזית לפיתוח היקפי 1, המאפשר את האפשרות לצלם גם את העצבוב של forelimb ו לתפעל את התהליך הזה עם טכניקות תרופתי ו גנטית 2. הפרמטר הקריטי ביותר לגידול מוצלח של תרבויות פרוסה כזו היא השיטה בה את פרוסות מוכנים. לאחר בדיקה מקיפה של מגוון שיטות, מצאנו כי vibratome הוא המכשיר הטוב ביותר הפרוסה עוברים כך שהם שגרתי תוצאה בתרבות מדגים יכולת הקיום על פני תקופה של מספר ימים, והכי חשוב, מפתחת בעידן באופן ספציפי. עבור אמצע ההריון עוברים, זה כולל את תוצאה נורמלית של העצבים בעמוד השדרה של חוט השדרה ואת הגרעינים השורש הגבי ליעדם בפריפריה וקביעת תקין של רקמת שריר השלד. בעבודה זו, אנו מציגים שיטה לעיבוד עוברים כל יום עובריים (E) E10 ל E12 לתוך 300-400 מיקרומטר פרוסות לגידול בתרבית רקמה רגילה החממה, אשר ניתן ללמוד עד יומיים לאחר הכנה פרוסה. קריטי להצלחה של גישה זו הוא השימוש vibratome על כל פרוסה העובר agarose-מוטבע. זה ואחריו הטיפוח של פרוסות על קרום Millicell מוסיף תרבות דגש על נפח קטן של המדיום, והתוצאה היא טכניקה תרבות ממשק. המלטה אחת עם ממוצע של 7 עוברים באופן שגרתי מייצר לפחות 14 פרוסות (2-3 פרוסות של האזור forelimb לכל העובר), אשר משתנה מעט עקב גיל העוברים כמו גם עובי הפרוסות. כ -80% את פרוסות תרבותי להראות תוצאה עצב, אשר ניתן למדוד througout 2 תקופת culturing. תוצאות נציג באמצעות שורת עכבר tauGFP הם הפגינו.

אנו מציגים שיטה להכין פרוסות organotypic של אמצע ההיריון עוברי עכברים הדמיה טיפוח זמן לשגות תולדה של עצבים היקפיים.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

למטרות רבות, גידול של עוברים של עכברים ex vivo כפרוסות אורגנוטיפיות הוא רצוי. לדוגמה, אנו משתמשים בקו עכברים טרנסגני (tauGFP) ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין פרוסות טרנסוורסליות אורגנוטיפיות של אזור הגפה הקדמית מעוברי עכבר המבטאים GFP, לצורך הדמיה של צמיחת העצבים הספנליים. הדבר מושג תחילה על ידי הטמעת העוברים ב-aros בעל נקודת התכה נמוכה והגבלת שטח הרקמה וה-aros לאזור העניין. לאחר מכן, בלוק ה-aros מורכב לצורך פריסה.לאחר מכן, העוברים המוטמעים בבלוק נחתכים באמצעות הוויברטור. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הסרת ה-aros המקיף את הפרוסות והעברת הפרוסות לצלחות תרבית. הפרוסות מגודלות לאחר מכן ומראות צמיחה של עצבים פריפריים אל ההיקף, דבר שניתן לניטור באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גיליוטינה או קוצץ רקמות, הוא שהפרוסות נוצרות באופן מבוקר יותר ומראות חיוניות משופרת בתרבית. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע בחקר נוירוביולוגיה התפתחותית, כגון בחינת ההכוונה והצמיחה של עצבי השדרה; את ההליך תדגים Isabel barman. התחילו את ההליך בהכנת פלטות תרבית רקמה של 10 סנטימטר עם 6 מיליליטר של תמיסת תרבית, ומסנני ממברנה לתרבית של Milli-Cell במידה של 3 סנטימטר ובנקבוביות של 0.4 מיקרון.שמרו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר מכן, חממו במיקרוגל 4% low melting point agarose ב-PBS, והניחו אותו על פלטת חימום כדי שישמר בטמפרטורה של כ-37 °C. מלאו צלחות פטרי בקטריולו

organotypic-slice-culture-gfp-expressing-mouse-embryos-for-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

סרטון זה מדגים את תרבית ex vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים. העוברים מבודדים ומוטבעים באגרוז. באמצעות ויברטום, פרוסות המכילות את גרעיני oculomotor ואת העיניים מתקבלים. הפרוסות נשמרות בתרבית ומצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תרבית Ex Vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי לגנוטיפ, צביעה והכנה של עכברים עובריים להדמיה של הקרנות אקסון נוציספטור היקפיות בבעל החיים כולו, כשיטה יעילה להערכת פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בפיתוח עכברים מהונדסים גנטית.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למד הכנת פרוסות אורגנוטיפיות מעוברי עכברים מבטאי GFP לצפייה בזמן אמת בצמיחת עצבים שדרתיים לכיוון הפריפריה. שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם בביולוגיה התפתחותית ובמדעי העצב.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

גלה סרטונים נוספים