Name: Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: למדו שיטה משופרת לתרבות וטרנספקציה של תאי HEK-293T לביטוי ערוצי יון מבוקרי מתח. הפרוטוקול מייעל את היציבות הממברנלית ומאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמינות מבודדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק דיסקברי ההפעלה JDS של מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC) של קנדה, NSERC אלכסנדר גרהם בל קנדה מלגות לתארים מתקדמים (דוקטורט) (א &#39;Senatore) וקרן לב ושבץ, גרנט -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היכולת להקליט כל תא זרמים באמצעות פרוטוקולים תיאר ופתרונות מציין כי transfection היה מוצלח וכי הרצוי מתח מגודרת תעלות יונים או ערוץ מתחמי יון נמצאים עם כמויות משמעותיות על קרום התא. התאים צריכה להיות transfected חיובי (כלומר פלואורסצנטי ירוק), אך לא זרמים לצריבה, זמן נוסף על 28 מעלות צלזיוס ייתכן שתידרש כדי לאפשר לחלבון ערוץ להיות ארוז כראוי מוכנס לתוך קרום התא. שים לב דגירה ממושכת בגיל 28 ° C גורם לתאי להתנתק coverslips, ואת הקרומים לערער לצבור פסולת תאים מתים, מה שהופך מהדק הקלט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP פלסמיד </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> חוג זכוכית coverslips </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-545-80 </td><td> מעגלים מס &#39;1-.13 כדי 0.17mm עבה, גודל: 12mm </td></tr><tr><td> מגבר </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Axopatch 200B או 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data System רכישה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Electrophysiology תוכנה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה המניפולטורים </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הפוך Epifluorescence </td><td> Zeiss קנדה </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> אקסון מכשירים </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודה Headstage המחזיק </td><td> אקסון מכשירים </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Microelectrode בעל הקרקע עבור אלקטרודה </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Electrophysiology צינורות נימי </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> BF-150-86-15 </td><td> זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15 ס&quot;מ ארוך </td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette אש לטש </td><td> Narishige </td><td> מיקרו Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> זלוף מיקרו התרופה מערכת </td><td> להפוך מדעי </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> זלוף והתרופות מערכת </td><td> להפוך מדעי </td><td> Valvelink8.2 עם טפלון שסתומים </td><td></td></tr></table>

transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב hek-293t תאים

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

בביטוי במבחנה אלקטרו הקלטה של מתח מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T) היא אסטרטגיית המחקר נמצא בכל מקום. HEK-293T התאים חייב להיות מצופה על coverslips זכוכית בצפיפות מספיק נמוך כדי שהם לא נמצאים במגע זה עם זה על מנת לאפשר הקלטה אלקטרו ללא תופעות בלבול כתוצאה ממגע עם תאים סמוכים. ערוצי transfected צריך גם לבטא עם יעילות גבוהה על קרום התא עבור כל הקלטה תאים תיקון מהדק של זרמים לגילוי מעל רמות הרעש. תעלות יונים Heterologous לעיתים קרובות דורשים תקופות דגירה ארוך 28 מעלות צלזיוס לאחר transfection על מנת להשיג ביטוי הולם קרום, אבל יש להגדיל את ההפסדים של הידבקות התא coverslip ויציבות הממברנה בטמפרטורה זו. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה מותאם transfect צלחת HEK-293T תאים. שיטה זו דורשת כי התאים להיות transfected בבית confluency גבוה יחסית, מודגרות ב 28 ° C לפרקי הדגירה שלאחר transfection כדי לאפשר ביטוי נאות ערוץ יון חלבון. תאים transfected הם מצופה ומשם coverslips זכוכית מודגרות ב 37 ° C למשך מספר שעות, המאפשרת התקשרות תא נוקשה coverslips ו restabilization הממברנה. תאים ניתן להקליט זמן קצר לאחר ציפוי, או ניתן להעביר 28 מעלות צלזיוס במשך הדגירה נוספת. אנו מוצאים כי הדגירה הראשונית ב 28 ° C, לאחר transfection אבל לפני ציפוי, הוא המפתח לביטוי יעיל של תעלות יונים Heterologous שבדרך כלל אינם מבטאים היטב את הממברנה הפלסמטית. Transfected חיובי, תאים בתרבית מזוהים שיתוף הביע eGFP או eGFP הביע מן וקטור bicistronic (למשל pIRES2-EGFP) המכיל את ערוץ יון רקומביננטי cDNA רק נגד הזרם של אתר כניסה פנימי הריבוזום ואת רצף eGFP קידוד. Whole-cell מהדק הקלטה התיקון דורש ציוד מיוחד, בתוספת crafting של אלקטרודות הקלטה מלוטשת בצורת אלקטרודות לקרקע ממשטח הזכוכית בורוסיליקט. משלוח סמים כדי ללמוד את פרמקולוגיה של תעלות יונים יכולה להיות מושגת על ידי ישירות micropipetting סמים לתוך צלחת ההקלטה, או באמצעות microperfusion או זרימת הכבידה מערכות המייצרות זרמים רצוף של פתרון התרופה על תאים מוקלט.

שיטה אמינה היעילה ביותר<em&gt; במבחנה</em&gt; הביטוי הקלטה אלקטרו הבאות של רקומביננטי מתח מגודרת תעלות יונים של האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

ביטוי in vitro והקלטה אלקטרופיזיולוגית של תעלות יונים רקומיננטיות תלויות-מתח בתאי כליה עובריים אנושיים בתרבית (HEK-293T) ...

אלקטרופיזיולוגיה משמשת באופן נפוץ לחקר הפעילות של תעלות יונים רקומיננטיות תלויות-מתח בתאי כליה עובריים של בן אדם בתרבית. הקלטה מוצלחת מחייבת שהתאים יבטא את התעלות ברמות מספיקות בממברנת התא לצורך גילוי, ושהתאים יזרעו בצפיפות תאים נמוכה מספיק כדי לבודד תאים בודדים. ביצוע הקלטות מתאים נבלם לעיתים קרובות על ידי תקופות דגירה ארוכות ב-28 °C הדרושות לביטוי כזה, שבהן חלה בדרך כלל פגיעה בהיצמדות התאים וביציבות הממברנה.כאן מוצגה שיטה מותאמת עבור תרביות תאים וטרנספקציה העוקפת בעיות אלו. התאים עוברים טרנספקציה ביעילות בינונית, ולאחר מכן מדגרימים בטמפרטורה של 28 °C עד להשגת ביטוי מספק של תעלות יונים. התאים שעברו טרנספקציה נזרעים לאחר מכן על לוחות זכוכית (cover slips) בצפיפות נמוכה ומודגרימים בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים וייצוב של הממברנה.לאחר מכן, תאים שזריעתם בוצעה כראוי מזוהים באמצעות ביטוי משותף של EGFP ושיטת patch clamp של תא שלם. ניתן לבצע הקלטה, או להדגיר את התאים שוב בטמפרטורה של 28 °C. כדי להגביר עוד יותר את הביטוי של התעלות על פני השטח, תוצאות מניסויי הקלטה בתאים שטרנספקטו עם תעלות סידן תלויות-מתח כגון L CAV one, L CAV two או L cav three מעידות על כך שהתעלות עברו טרנספקציה בהצלחה ובוטאו על ידי התאים.למרות שמוצגות תוצאות מייצגות עבור L CAV three בלבד, פית

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

אסטרטגיות טיפוליות הרומן של רפואה רגנרטיבית הלב דורשים מקיף ומפורט הלימודים במודלים של בעלי חיים פרה גדולה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם. כאן, נדגים שיטה הזרקת intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית בארנבים, וזה יקר עבור בדיקת יעילותם של טיפולים חדשניים כאלה השערות.

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

למדו שיטה משופרת לתרבות וטרנספקציה של תאי HEK-293T לביטוי ערוצי יון מבוקרי מתח. הפרוטוקול מייעל את היציבות הממברנלית ומאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמינות מבודדות.

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

גלה סרטונים נוספים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים