Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

אלקטרופיזיולוגיה משמשת בדרך כלל לחקר הפעילות של תעלות יונים מגודרות במתח רקומביננטי בתאי כליה עובריים אנושיים מתורבתים. רישום מוצלח דורש שהתאים יבטאו תעלות ברמות מספיקות בקרום התא לגילוי וכי התאים יהיו מצופים בצפיפות תאים נמוכה מספיק לבידוד של תאים בודדים. ביצוע הקלטות תאים נפגע לעתים קרובות על ידי תקופות הדגירה הארוכות ב-28 מעלות צלזיוס הדרושות לביטוי כזה כאשר בדרך כלל יש אובדן הידבקות התאים ויציבות הממברנה.

כאן, מודגמת שיטה אופטימלית לתרבית תאים וטרנספקציה שעוקפת את הבעיות הללו. התאים עוברים טרנספטציה בשטף מתון, ואז מודגרים ב-28 מעלות צלזיוס עד להשגת ביטוי תקין של תעלת יונים. לאחר מכן, התאים המועברים מצופים על גבי החלקות כיסוי זכוכית בצפיפות נמוכה ומודגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות כדי לאפשר חיבור תאים וייצוב הממברנה.

לאחר שתאים מצופים כראוי מזוהים על ידי EGFP בביטוי משותף ומהדק תיקון תא שלם. ניתן לבצע הקלטה או לדגור שוב את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. כדי להגדיל עוד יותר את ביטוי פני הערוץ, תוצאות מניסויי הקלטה על תאים שהועברו עם תעלות סידן מגודרות מתח כגון L CAV אחד, L, CAV שתיים, או L cav שלוש מצביעות על כך שהתעלות הועברו בהצלחה ובאו לידי ביטוי על ידי התאים.

למרות שרק תוצאות מייצגות עבור L CAV 3 מוצגות במעבדה שלנו, פיתחנו שיטה לשיפור הביטוי של גנים של תעלות יונים המתבטאים בצורה גרועה לרישום מהדק טלאי בשורות תאים אנושיים. כעת הגישה המקובלת היא לפצל תחילה את התאים על החלקות הכיסוי ולהעביר עם CDNA פלזמה המכילים את הגנים של תעלת היונים, ולאחר מכן לדגור במשך ימים רבים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על מנת להשיג ביטוי תעלות יונים יעיל במיוחד לפני ההקלטה האלקטרופיזיולוגית. הגישה החדשה שלנו מפחיתה מאוד את זמן הדגירה הנדרש ב-28 מעלות צלזיוס לפני הרישום.

כעת, על ידי הפחתת זמן הדגירה של 28 מעלות, אנו מגלים שקרומי התאים יציבים הרבה יותר והתאים המועברים נצמדים הרבה יותר להחלקות הכיסוי. זה מגדיל את מספר התאים הניתנים להקלטה והופך את הניסויים ליעילים יותר באופן משמעותי. לפני הטרנספקציה פיצל בקבוק מתכנס מלא של תאי HEK 2 9 3 T, אחד עד ארבעה לבקבוק חדש בגודל 25 סנטימטר מרובע והניח את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני.

אפשר לתאים להיצמד במשך שלוש עד ארבע שעות לאחר ארבע שעות, בדוק את התאים על ידי ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות כדי לאמת את ההתקשרות. שים לב שהתאים כבר לא נראים עגולים והם משתטחים. הרחבות או פסאודופודיה נראות לעין.

פחות תאי מפגש ייראו אותו הדבר אך יהיו מרוחקים יותר זה מזה. לאחר שהתאים התחברו, שלב את הריאגנטים הדרושים לביצוע טרנספקציה סטנדרטית של סידן פוספט. הכן בסך הכל 12 מיקרוגרם DNA ב-600 מיקרוליטר של תמיסת טרנספקציה לכל בקבוק.

כאן משובטים CDNAs מתעלות יונים שונות לתוך שני פלסמיד EGFP של P-I-R-E-S העברה של וקטור ביטוי זה לקו תאים של יונקים. מביא לייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאותו mRNA כמו התוספת המשובטת באמצעות תרגום שהחל באתר כניסה פנימי לריבוזום ממש במורד הזרם של רצף ציפוי תעלת היונים ובמעלה הזרם של רצף ציפוי EGFP. זה מאפשר לזהות תאים שעברו טרנספטציה חיובית ללא הפרעה אפשרית בתפקוד החלבון שעלולה להיגרם על ידי מיזוג חלבון EGFP ישירות לחלבון המבוקש.

פיפטו את תמיסת הטרנספקציה מעל התאים בטיפה, ואז סובבו בעדינות את הבקבוק והניחו אותו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת. בדוק את יעילות הטרנספקציה על ידי צפייה בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים שעברו טרנספטציה חיובית צריכים להופיע ירוקים בכל התא.

לאחר אימות הטרנספקציה, פיפטה בזהירות ארבעה עד חמישה מיליליטר של מדיום חם לתוך הבקבוק ההפוך. שטפו את התאים על ידי הפיכת הבקבוק לאט כך שמשטח התא יהיה למטה ונדנוד הבקבוק כך שתמיסת הכביסה תעבור בעדינות מעליהם. הסר את המדיום וחזור על שטיפה זו.

צעד עוד פעמיים. לאחר מכן מוסיפים שישה מיליליטר בינוני לבקבוק ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. ביטוי של תעלות יונים חסרי חוליות מציב כמה אתגרים.

ראשית, הם לרוב בגודל גדול ולכן עשויים לקחת זמן רב לתרגם ברטיקולום האנדופלזמי. כמו כן, ייתכן שהם לא יהיו ממוקדים ביעילות לקרום התא בקו תאי יונקים. לבסוף, מכיוון שמינים שונים מציגים תדירות שימוש שונה בקודונים, CDNAs הטרולוגיים עשויים להכיל תדרים גבוהים של קודונים שאינם נפוצים בתאי יונקים כגון HEK 2 9 3 T כדי להתגבר על חלק מהקשיים הללו.

לאחר הדגירה של שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שטיפת טרנספט, העבירו את הצלוחיות לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שישה ימים כדי להאריך את תקופת הביטוי. יש לקבוע את זמן הדגירה באופן אמפירי עבור כל סוג של תעלת יונים המתבטאת. מכיוון שדגירה ב-28 מעלות צלזיוס לפרקי זמן ממושכים מובילה לניתוק תאים וליציבות ירודה של הממברנה.

יש צורך בהכנת תאים נוספת לפני ביצוע מחקרים אלקטרופיזיולוגיים. ראשית, הסר את המדיה מהתאים המועברים על ידי פיפטת שאיפה מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין של 37 מעלות צלזיוס לתוך בקבוק הפוך. לאחר מכן החזר בעדינות את הבקבוק למצב פני התא למטה כדי לאפשר לטריפסין לעבור בעדינות על התאים.

הפוך את הבקבוק בחזרה והסר את הטריפסין. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של טריפסין חם ישירות על התאים ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות עד שהתאים מתנתקים. בינתיים, הניחו שלושה עד שמונה מחליקי כיסוי מצופים פולי L ליזין לתוך צלחת תרבית של 60 מילימטר והוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום תרבית חם.

לאחר שהתאים ניתקו את הרסוס, השעו אותם בארבעה מיליליטר של מדיום חם על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כשש פעמים לאחר מכן, באמצעות קצה המיקרו פיפטה, דחפו כלפי מטה את החלקות הכיסוי כדי לוודא שהם בתחתית הצלחת. לאחר מכן הוסף 250 עד 500 מיקרוליטר של תאים תלויים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות כדי לאפשר להם להיצמד להחלקות הכיסוי.

השארת התאים זמן רב מדי ב-37 מעלות תגרום לחלוקת תאים ודילול של הפלסמידים המועברים. התאים המועברים צריכים להיות מצופים בצפיפות נמוכה מספיק כך שהם מבודדים זה מזה כפי שמוצג כאן. זה יקל על רישום אלקטרופיזיולוגי.

עבור תאים הדורשים יחידות משנה נלוות, לעתים קרובות יש צורך להעביר את התאים ל -28 מעלות צלזיוס ולדגור אותם במשך שלושה עד ארבעה ימים נוספים לפני האלקטרופיזיולוגיה. ההקלטה מתבצעת עבור תאים שאינם דורשים יחידות משנה נלוות. ניתן לבצע הקלטה מיד לאחר דגירה זו.

מתקן האלקטרופיזיולוגיה המשמש כאן כולל מגבר, מניפולטורים ממונעים, פיפטה כפולה, ומיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי ומערכות זלוף. הציוד הותקן על שולחן בידוד רעידות ותועה. רעש חשמלי מוגבל על ידי כלוב חמוס מסוג 40 אינץ' מסוג שני מערכות בקרה אלקטרוניות כולל מחשב המצויד בנתונים ספרתיים 1440, ממשק ממיר אנלוגי לדיגיטלי בשילוב עם תוכנת P clamp 10.1.

מגבר צג המחשב, מניפולטור ממונע ומערכת בקרת שפע של חוליות שסתומים מותקנים כולם מחוץ לכלוב פאראדיי. על מתלה חשמלי מתכתי עצמאי בגודל 19 אינץ', כל הציוד החשמלי מוארק למפיץ נחושת ומחובר לשנאי בידוד בדרגה רפואית, המספק בידוד קו, הארקה עקבית ודיכוי נחשולים. התכוננו לניסויים על ידי הרכבת מיקרו פיפטות מלוטשות באש עם התנגדות של שניים עד חמישה מגה אוהם על מחזיק המיקרו פיפטה על הבמה הראש.

פיפטות התיקון ממולאות בתנועת תמיסה פנימית להסרת בועות אוויר ולבסוף מותקנות על הראש stage. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מעבירים פתק כיסוי אחד עם תאים מצופים לצלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של תמיסת הקלטה חיצונית בטמפרטורת החדר. יש למדוד במדויק את נפח תמיסת ההקלטה בעת ביצוע ניסויים תרופתיים שבמהלכם מוסיפים כמויות ידועות של תרופה לצלחת בעזרת מיקרו פיפטה, מניחים את המנה על במת המיקרוסקופ.

לאחר מכן מלאו חצי תא מחזיק מיקרו אלקטרודה בשלושה צזיום כלוריד מולארי. לאחר מכן הכנס את אלקטרודת הייחוס לחצי התא והנח את האלקטרודה הקרקעית לאמבטיה באמצעות מניפולטור המיקרום, הורד את פיפטת התיקון לתמיסת האמבטיה. דמיין את התאים במצב פלואורסצנטי ומרכז תא ירוק דבק מבודד שעבר טרנספטציה חיובית באמצע שדה הראייה.

במצב אמבטיה, הביאו את פיפטת התיקון לקרבת התא. אפס את עקבות הגל הריבועי שנצפו על מסך המחשב. התאם את המיקום של פיפטת התיקון כך שהיא רק נוגעת בתא ועקבות הזרם המרובע על המסך יתחילו להשתנות.

יש למרוח יניקה עדינה עם מזרק מחובר עד שנוצר חותם ג'יגה אוהם. לאחר השגת חותם ג'יגה אוהם, העבר את התוכנית למצב תיקון. החל דופק יניקה מהיר עם המזרק על מנת לפרוץ את קרום התא.

לאחר מכן עבור למצב תא והשתמש בפרמטרים של תא שלם במגבר. כדי לפצות על חולף קיבולי, יש צורך לאזן את התיקון כך שתמיסת ההקלטה התוך-תאית תעבור דיאליזה לתא המתוקן. הזן את פרוטוקולי מהדק המתח שנכתבו עבור ניסוי זה כאן.

הנסיין עיצב פרוטוקול למדידת זרמי יונים דרך תעלות יונים מגודרות מתח הנוצרות כאשר המתח על פני קרום התא מווסת. במקרה זה, אנו מסתכלים על פרוטוקול IV המציין שהתוכנה מחזיקה את התא במינוס 110 מילי-וולט ולאחר מכן SEP למינוס 70 מילי-וולט למשך 250 אלפיות השנייה. ואז חזרה למינוס 110 מילי-וולט החזקת פוטנציאל בכל פעם שהצעד גדל ב-10 מילי-וולט כך שהשלבים הם מינוס 70 מילי-וולט, מינוס 60 מילי-וולט וכו', עד שהשלב האחרון הוא פלוס 20 מילי-וולט.

סנן את הזרמים המוקלטים ב-10 קילו-הרץ באמצעות מסנן Lowpass Bessel על המגבר ודיגיטציה בתדר דגימה של שני קילו-הרץ באמצעות תוכנת clamp X 10.1 השתמש רק בהקלטות עם דליפה מינימלית של פחות מ-10%לניתוח, תאי HEK 2 93 T תורבבו והועברו עם L Cav. שלוש תעלות סידן כפי שמוצג כאן. טרנספקציה מוצלחת של CDNA של תעלות יונים הטרולוגיות צוינה על ידי פלואורסצנטיות שנוצרה מווקטור P-I-R-E-S שני EEG FP.

כאן אנו מראים ביטוי מוצלח של תעלת סידן חסרת חוליות cav שלוש מתח. כאשר תאים אינם עוברים טרנספטציה, לא ניתן לעורר זרמי סידן. ואילו תאים שעברו טרנספטציה מייצרים זרמים גדולים כאשר פרוטוקולי מהדק מתח תא שלם מוחלים על התאים.

נסיינים יכולים להשתמש בתנאים אלקטרופיזיולוגיים שונים ובמשטרי ניתוח נתונים בהתאם לדרישותיהם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשיקול הדעת שלך לגבי תזמון הניסויים. מכיוון שערוצים שונים מתבטאים ביעילות שונה בקרום התא, זה תלוי בך לקבוע את האסטרטגיה האופטימלית שבה יש להשתמש כדי להגביר את הכדאיות של התאים וכן למקסם את ביטוי פני השטח של הערוצים שאתה מעוניין בהם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שהשגתם הבנה טובה כיצד לתרבית ולתחזק קו תאים אנושיים, כמו גם כיצד להעביר CDNA של תעלות יונים הטרולוגיות ו-CDNA תת-יחידות לתאים אלה. לרישום אלקטרופיזיולוגי.