Name: Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: למדו שיטה משופרת לתרבות וטרנספקציה של תאי HEK-293T לביטוי ערוצי יון מבוקרי מתח. הפרוטוקול מייעל את היציבות הממברנלית ומאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמינות מבודדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק דיסקברי ההפעלה JDS של מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC) של קנדה, NSERC אלכסנדר גרהם בל קנדה מלגות לתארים מתקדמים (דוקטורט) (א &#39;Senatore) וקרן לב ושבץ, גרנט -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היכולת להקליט כל תא זרמים באמצעות פרוטוקולים תיאר ופתרונות מציין כי transfection היה מוצלח וכי הרצוי מתח מגודרת תעלות יונים או ערוץ מתחמי יון נמצאים עם כמויות משמעותיות על קרום התא. התאים צריכה להיות transfected חיובי (כלומר פלואורסצנטי ירוק), אך לא זרמים לצריבה, זמן נוסף על 28 מעלות צלזיוס ייתכן שתידרש כדי לאפשר לחלבון ערוץ להיות ארוז כראוי מוכנס לתוך קרום התא. שים לב דגירה ממושכת בגיל 28 ° C גורם לתאי להתנתק coverslips, ואת הקרומים לערער לצבור פסולת תאים מתים, מה שהופך מהדק הקלט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP פלסמיד </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> חוג זכוכית coverslips </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-545-80 </td><td> מעגלים מס &#39;1-.13 כדי 0.17mm עבה, גודל: 12mm </td></tr><tr><td> מגבר </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Axopatch 200B או 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data System רכישה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Electrophysiology תוכנה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה המניפולטורים </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הפוך Epifluorescence </td><td> Zeiss קנדה </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> אקסון מכשירים </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודה Headstage המחזיק </td><td> אקסון מכשירים </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Microelectrode בעל הקרקע עבור אלקטרודה </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Electrophysiology צינורות נימי </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> BF-150-86-15 </td><td> זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15 ס&quot;מ ארוך </td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette אש לטש </td><td> Narishige </td><td> מיקרו Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> זלוף מיקרו התרופה מערכת </td><td> להפוך מדעי </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> זלוף והתרופות מערכת </td><td> להפוך מדעי </td><td> Valvelink8.2 עם טפלון שסתומים </td><td></td></tr></table>

transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב hek-293t תאים

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

בביטוי במבחנה אלקטרו הקלטה של מתח מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T) היא אסטרטגיית המחקר נמצא בכל מקום. HEK-293T התאים חייב להיות מצופה על coverslips זכוכית בצפיפות מספיק נמוך כדי שהם לא נמצאים במגע זה עם זה על מנת לאפשר הקלטה אלקטרו ללא תופעות בלבול כתוצאה ממגע עם תאים סמוכים. ערוצי transfected צריך גם לבטא עם יעילות גבוהה על קרום התא עבור כל הקלטה תאים תיקון מהדק של זרמים לגילוי מעל רמות הרעש. תעלות יונים Heterologous לעיתים קרובות דורשים תקופות דגירה ארוך 28 מעלות צלזיוס לאחר transfection על מנת להשיג ביטוי הולם קרום, אבל יש להגדיל את ההפסדים של הידבקות התא coverslip ויציבות הממברנה בטמפרטורה זו. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה מותאם transfect צלחת HEK-293T תאים. שיטה זו דורשת כי התאים להיות transfected בבית confluency גבוה יחסית, מודגרות ב 28 ° C לפרקי הדגירה שלאחר transfection כדי לאפשר ביטוי נאות ערוץ יון חלבון. תאים transfected הם מצופה ומשם coverslips זכוכית מודגרות ב 37 ° C למשך מספר שעות, המאפשרת התקשרות תא נוקשה coverslips ו restabilization הממברנה. תאים ניתן להקליט זמן קצר לאחר ציפוי, או ניתן להעביר 28 מעלות צלזיוס במשך הדגירה נוספת. אנו מוצאים כי הדגירה הראשונית ב 28 ° C, לאחר transfection אבל לפני ציפוי, הוא המפתח לביטוי יעיל של תעלות יונים Heterologous שבדרך כלל אינם מבטאים היטב את הממברנה הפלסמטית. Transfected חיובי, תאים בתרבית מזוהים שיתוף הביע eGFP או eGFP הביע מן וקטור bicistronic (למשל pIRES2-EGFP) המכיל את ערוץ יון רקומביננטי cDNA רק נגד הזרם של אתר כניסה פנימי הריבוזום ואת רצף eGFP קידוד. Whole-cell מהדק הקלטה התיקון דורש ציוד מיוחד, בתוספת crafting של אלקטרודות הקלטה מלוטשת בצורת אלקטרודות לקרקע ממשטח הזכוכית בורוסיליקט. משלוח סמים כדי ללמוד את פרמקולוגיה של תעלות יונים יכולה להיות מושגת על ידי ישירות micropipetting סמים לתוך צלחת ההקלטה, או באמצעות microperfusion או זרימת הכבידה מערכות המייצרות זרמים רצוף של פתרון התרופה על תאים מוקלט.

שיטה אמינה היעילה ביותר<em&gt; במבחנה</em&gt; הביטוי הקלטה אלקטרו הבאות של רקומביננטי מתח מגודרת תעלות יונים של האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

ביטוי in vitro והקלטה אלקטרופיזיולוגית של תעלות יונים רקומיננטיות תלויות-מתח בתאי כליה עובריים אנושיים בתרבית (HEK-293T) ...

אלקטרופיזיולוגיה משמשת באופן נפוץ לחקר הפעילות של תעלות יונים רקומיננטיות תלויות-מתח בתאי כליה עובריים של בן אדם בתרבית. הקלטה מוצלחת מחייבת שהתאים יבטא את התעלות ברמות מספיקות בממברנת התא לצורך גילוי, ושהתאים יזרעו בצפיפות תאים נמוכה מספיק כדי לבודד תאים בודדים. ביצוע הקלטות מתאים נבלם לעיתים קרובות על ידי תקופות דגירה ארוכות ב-28 °C הדרושות לביטוי כזה, שבהן חלה בדרך כלל פגיעה בהיצמדות התאים וביציבות הממברנה.כאן מוצגה שיטה מותאמת עבור תרביות תאים וטרנספקציה העוקפת בעיות אלו. התאים עוברים טרנספקציה ביעילות בינונית, ולאחר מכן מדגרימים בטמפרטורה של 28 °C עד להשגת ביטוי מספק של תעלות יונים. התאים שעברו טרנספקציה נזרעים לאחר מכן על לוחות זכוכית (cover slips) בצפיפות נמוכה ומודגרימים בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים וייצוב של הממברנה.לאחר מכן, תאים שזריעתם בוצעה כראוי מזוהים באמצעות ביטוי משותף של EGFP ושיטת patch clamp של תא שלם. ניתן לבצע הקלטה, או להדגיר את התאים שוב בטמפרטורה של 28 °C. כדי להגביר עוד יותר את הביטוי של התעלות על פני השטח, תוצאות מניסויי הקלטה בתאים שטרנספקטו עם תעלות סידן תלויות-מתח כגון L CAV one, L CAV two או L cav three מעידות על כך שהתעלות עברו טרנספקציה בהצלחה ובוטאו על ידי התאים.למרות שמוצגות תוצאות מייצגות עבור L CAV three בלבד, פיתחנו במעבדתנו שיטה להגברת הביטוי של גנים של תעלות יונים בעלי ביטוי נמוך לצורך הקלטות patch clamp בקווי תאים אנושיים. נכון להיום, הגישה המקובלת היא לפצל תחילה את התאים על לוחות כיסוי ולהחדיר באמצעות טרנספקציה cDNA של פלסמידים המכילים את הגנים של תעלות היונים, ולאחר מכן לדגור למשך מספר ימים ב-28 °C כדי להשיג ביטוי יעיל וגבוה של תעלות היונים לפני ההקלטה האלקטרופיזיולוגית. הגישה החדשה שלנו מקצרת באופן משמעותי את זמן הדגירה הנדרש ב-28 °C לפני ההקלטה.כעת, על ידי קיצור זמן הדגירה ב-28 מעלות, אנו מוצאים כי קרומי התאים יציבים הרבה יותר והתאים שעברו טרנספקציה נצמדים הרבה יותר ללוחיות הזכוכית. דבר זה מגדיל את מספר התאים שניתן להקליט והופך את הניסוי ליעיל באופן משמעותי. לפני הטרנספקציה, פצלו בקבוק מלא בתאי HEK 2 9 3 T שהגיעו למצב של התמסחות מלאה (confluent), ביחס של 1:4, לבקבוק חדש של 25 סנטימטר רבוע, והניחו את התאים באינקובטור ב-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide.אפשרו לתאים להיקשר למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לוודא את ההיקשרות. שימו לב שהתאים כבר אינם נראים עגולים והם נפרסים. שלוחות או פסאודופודיה (pseudopodia) נראות לעין.תאים בעלי התמזגות (confluence) נמוכה יותר ייראו באופן דומה, אך יהיו מרווחים יותר זה מזה. לאחר שהתאים נצמדו, שלבו את הרכיבים הדרושים לביצוע טרנספקציה סטנדרטית של סידן פוספט. הכינו סך הכל 12 micrograms של DNA ב-600 microliters של תמיסת טרנספקציה לכל בקבוק.כאן משובטות cDNA של תעלות יונים שונות לתוך הפלסמיד P-I-R-E-S two EGFP. טרנספקציה של וקטור ביטוי זה לסוג תאים של יונקים גורמת לייצור של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) מאותו mRNA של הרצף המשובט, באמצעות תרגום שמתחיל באתר כניסת ריבוזומים פנימי (IRES) הממוקם מיד לאחר רצף הקידוד של תעלת היונים ולפני רצף הקידוד של ה-EGFP. דבר זה מאפשר זיהוי של תאים שעברו טרנספקציה חיובית ללא הפרעה אפשרית בתפקוד החלבון, שעלולה להיגרם מהיתוך ישיר של חלבון ה-EGFP לחלבון המחקרי.טפטפו את תמיסת הטרנספקציה על התאים, לאחר מכן סובבו בעדינות את הבקבוק והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. בדקו את יעילות הטרנספקציה על ידי צפייה בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. תאים שעברו טרנספקציה בהצלחה אמורים להיראות בירוק בכל חלקי התא.לאחר שאישור הטרנספקציה הושג, העבירו בזהירות בעזרת פיפט ארבעה עד חמישה מיליליטרים של מצע חם אל תוך הבקבוק ההפוך. שטפו את התאים על ידי הפיכה איטית של הבקבוק כך ששטח פני התאים יהיה כלפי מטה, וניעור הבקבוק כך שתמיסת השטיפה תעבור על פניהם בעדינות. הסירו את המצע וחזרו על פעולת השטיפה זו.בצעו את הפעולה פעמיים נוספות. לאחר מכן, הוסיפו שישה מיליליטרים של מצע לבקבוק והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. ביטוי של תעלות יונים של חוליות מציב מספר אתגרים.ראשית, הם לרוב בעלי גודל גדול ולכן עשויים לדרוש זמן רב לתרגום ברשתית התוך-פלזמית. כמו כן, ייתכן שלא יכוונו ביעילות לממברנת התא בשורת תאים של יונקים. לבסוף, מכיוון שמינים שונים מראים תדירויות שימוש שונות בקודונים, CDNAs הטרולוגיים עשויים להכיל תדירויות גבוהות של קודונים שאינם נפוצים בתאי יונקים כגון HEK 2 9 3 T כדי להתגבר על חלק מקשיים אלו.לאחר דגירה של שעתיים ב-37 degrees Celsius בעקבות שטיפת התרחיל, העבירו את הבקבוקים למדגרה ב-28 degrees Celsius למשך יומיים עד שישה ימים כדי להאריך את תקופת הביטוי. יש לקבוע את זמן הדגירה באופן אמפירי עבור כל סוג של תעלת יונים המובעת. זאת מאחר שדגירה ב-28 degrees Celsius למשך פרקי זמן ממושכים מובילה להיסגרות של התאים וליציבות ממב ferrite נמוכה.נדרשת הכנה נוספת של התאים לפני ביצוע מחקרים אלקטרופיזיולוגיים. ראשית, הסר את המצע מהתאים שעברו טרנספקציה באמצעות פיפטת שאיבה, והחדל מיליליטר אחד של תמיסת trypsin בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לתוך בקבוק הפוך. לאחר מכן, החזר בעדינות את הבקבוק למצב שבו פיית הבקבוק פונה כלפי מטה אל פני התאים, כדי לאפשר ל-trypsin לזרום בעדינות על התאים.הפוך את הבקבוק חזרה והסר את ה-trypsin. לאחר מכן, הוסף 250 µL של trypsin חם ישירות על התאים והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות, עד שהתאים ינשלו. בינתיים, הנח שלוש עד שמונה כיסויות זכוכית (coverslips) מצופות poly L lysine לתוך צלחת תרבית של 60 mm והוסף 5 mL של מצע גידול חם.לאחר שהתאים התנתקו, השהה אותם בארבעה מיליליטר של מצע חמים על ידי פיפוט מעלה ומטה כשישה פעמים. לאחר מכן, בעזרת קצה המיקרו-פיפט, לחץ על לוחות הכיסוי כדי לוודא שהם נמצאים בתחתית הצלחת. לאחר מכן, הוסף 250 עד 500 µL של תאים שהושהו. הדגר את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות כדי לאפשר להם להיצמד ללוחות הכיסוי.השארת התאים למשך זמן רב מדי בטמפרטורה של 37 מעלות תוביל לחלוקת תאים ולדילול של הפלסמידים שעברו טרנספקציה. יש לזרע את התאים שעברו טרנספקציה בצפיפות נמוכה מספיק כדי שיהיו מבודדים זה מזה, כפי שמוצג כאן. דבר זה יקל על ההקלטה האלקטרופיזיולוגית.עבור תאים הדורשים תתי-יחידות עזר, לעיתים קרובות יש להעביר את התאים ל-28 degrees Celsius ולהדגיר אותם למשך שלושה עד ארבעה ימים נוספים לפני ביצוע בדיקה אלקטרופיזיולוגית. עבור תאים שאינם דורשים תתי-יחידות עזר, ניתן לבצע את ההקלטה מיד לאחר הדגירה זו.מתקן האלקטרופיזיולוגיה שנעשה בו שימוש כאן כולל מגבר, מניפולטורים ממונעים לשתי פיפטות, מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) ומערכות פרפוזיה. הציוד הותקן על שולחן בידוד רעידות, ורעשים חשמליים חיצוניים מוגבלים על ידי כלוב פראדיי (Faraday cage) מסוג 2 בגובה 40 אינץ'. מערכות הבקרה האלקטרוניות כוללות מחשב המצויד ב-Digitron 1440, ממשק ממיר מאנלוגי לדיגיטלי, בשילוב עם תוכנת P clamp 10.1.מגבר מסך המחשב, המניפולטור הממוטור and מערכת בקרת זרימה של קישורי שסתומים מותקנים כולם מחוץ לכלוב פאראדיי. על גבי מדף חשמל מתכתי בודד בגודל 19 אינץ', כל הציוד החשמלי מוארק למפצל נחושת ומחובר לשנאי בידוד בדרגה רפואית, המספק בידוד קווי, הארקה עקבית והגנה מפני נחשולי מתח. הכינו את הניסויים על ידי התקנת מיקרו-פיפטות מלוטשות באש בעלות התנגדות של two to five mega ohms על תושבת המיקרו-פיפטות בראש הבמה.ממלאים את פיפטות ה-patch בתמיסה פנימית, נקישים עליהן להסרת בועות אוויר ובסוף מרכיבים אותן על ה-head stage. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, מעבירים לוחות כיסוי אחד עם תאים שנשתלו לצלחית פטרי פלסטית של 35 מילימטר המכילה 3 מיליליטר של תמיסת הקלטה חיצונית בטמפרטורת החדר. יש למדוד את נפח תמיסת ההקלטה במדויק בעת ביצוע ניסויי תרופות, שבהם מוסיפים לצלחית כמויות ידועות של תרופה באמצעות מיקרו-פיפטה; מניחים את הצלחית עלבמת המיקרוסקופ.לאחר מכן, מלאו חצי תא של מחזיק מיקרו-אלקטרודה ב-cesium chloride בריכוז של three molar. לאחר מכן, הכניסו את אלקטרודת הייחוס אל חצי התא והניחו את אלקטרודת ההארקה בתוך האמבט באמצעות המיקרו-מניפולטור, והורידו את פיפטת הפאץ' אל תוך תמיסת האמבט. הדמינו את התאים במצב פלואורסצנציה ומרכזו תא ירוק דביק, מבודד ומעובד חיובית (positively transfected), במרכז שדה הראייה.בעודכם במצב אמבט (bath mode), קרבו את פיפט הפאץ' (patch pipette) לסמיכות לתא. אפסו את עקב גל הריבוע הנצפה על מסך המחשב. כוון את מיקום פיפט הפאץ' כך שיגע רק בתא, ועד שעקב זרם הריבוע על המסך יתחיל להתנודד.יש להפעיל שאיבה עדינה באמצעות מזרק מחובר עד להשגת אטימה ברמת giga ohm. לאחר שהושגה אטימה ברמת giga ohm, יש להעביר את התוכנה למצב patch. יש להפעיל פולס שאיבה מהיר עם המזרק כדי לפרוץ את ממברנת התא.לאחר מכן, עברו למצב תא (cell mode) והשתמשו בפרמטרים של תא שלם במגבר. כדי לפצות על תגובה קיבולית חולפת (capacitive transient), יש להמתין לשיווי משקל של ה-patch כך שתמיסת ההקלטה התו-תאית תדיאליז לתוך התא שנבחר. הזינו כאן את פרוטוקולי מתח ה-voltage clamp שנכתבו עבור ניסוי זה.הנסיין תכנן פרוטוקול למדידת זרמי יונים דרך תעלות יונים תלויות-מתח, הנוצרים כאשר המתח על פני קרום התא משתנה. במקרה זה, אנו בוחנים פרוטוקול IV הקובע כי התוכנה תשמור את התא במתח החזקה של 110- מיליוולט, ולאחר מכן תבצע קפיצה (SEP) למתח של 70- מיליוולט למשך 250 מילישניות. לאחר מכן, המתח יחזור למתח ההחזקה של 110- מיליוולט. בכל פעם, גובה הקפיצה יעלה ב-10 מיליוולט, כך שהקפיצות יהיו ל-70- מיליוולט, 60- מיליוולט, וכן הלאה, עד שהקפיצה האחרונה תהיה ל-20+ מיליוולט.סננו את הזרמים המוקלטים ב-10 kilohertz באמצעות מסנן Bessel Lowpass במגבר, ובצעו דיגיטציה בתדר דגימה של שני kilohertz באמצעות תוכנת clamp X 10.1; השתמשו רק בהקלטות עם דליפה מינימלית, פחות מ-10%. לצורך הניתוח, תאי HEK 2 93 T גודלו והועברו להם (transfected) L Cav. שלושה תעלות סידן כפי שמוצג כאן. טרנספקציה מוצלחת של cDNA של תעלות יונים הטרולוגיות סומנה על ידי פלואורסצנציה שנוצרה מווקטור P-I-R-E-S two eeg FP.כאן אנו מראים ביטוי מוצלח של תעלה סידן מסוג cav three של חסרי חוליות. כאשר התאים אינם טרנספקטומים, לא ניתן לעורר זרמי סידן. לעומת זאת, תאים טרנספקטומים מייצרים זרמים גדולים כאשר מיושמים על התאים פרוטוקולי voltage clamp של תא שלם.חוקרים יכולים להשתמש בתנאים אלקטרופיזיולוגיים ובמשטרי ניתוח נתונים שונים בהתאם לדרישותיהם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בשיקול דעתכם בנוגע לתזמון הניסויים. מכיוון שתעלים שונות מובעות ביעילויות שונות בממברנת התא, הבחירה באסטרטגיה האופטימלית להגברת חיוניות התאים וכן למקסום הביטוי על פני השטח של התעלים שבהם אתם מעוניינים נתונה לשיקול דעתכם.לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שרכשתם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לתרבת ולתחזק שורת תאים אנושית, וכן כיצד לבצע טרנספקציה של CDNAs של תעלות יונים הטרולוגיות ו-CDNAs של תת-יחידות לתאים אלו, לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

אסטרטגיות טיפוליות הרומן של רפואה רגנרטיבית הלב דורשים מקיף ומפורט הלימודים במודלים של בעלי חיים פרה גדולה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם. כאן, נדגים שיטה הזרקת intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית בארנבים, וזה יקר עבור בדיקת יעילותם של טיפולים חדשניים כאלה השערות.

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

למדו שיטה משופרת לתרבות וטרנספקציה של תאי HEK-293T לביטוי ערוצי יון מבוקרי מתח. הפרוטוקול מייעל את היציבות הממברנלית ומאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמינות מבודדות.

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

גלה סרטונים נוספים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים