הקלטות פיזיולוגיים של NMJs פלט גבוה ונמוך על שרירים ברגליים סרטן הנהרות extensor

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד לחשוף ולהבחין בין הטרמינלים המוטוריים הפאזיים והטוניים באמצעות צביעה מורפולוגית והקלטה אלקטרופיזיולוגית בשריר הפושט (extensor muscle) של סרטן נחל. דבר זה מושג תחילה על ידי תלישת הרגל המהלכת הראשונה או השנייה מסרטן נחל בגודל בינוני, חיתוך הקוטיקולה והסרת השריר הכופף (flexor muscle) במקטע ה-meite. פעולה זו חושפת את השריר הפושט ואת צרור העצבים.

השלב השני של הפרוצדורה הוא צביעת הדגימה באמצעות four ethyl amino sterile ו-methyl peritoneum iodide, או four D two asp, כדי להדמיות של האקסונים וסופי העצבים. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא גירוי סלקטיבי של נוירונים טוניים ו/או פאזיים, ובמקביל ביצוע רישומים תוך-תאיים של EPSPs שעוררו בסיב השריר. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שימוש באלקטרודה מוקדית כדי לרשום אירועי qu ספונטניים ועוררו מהסופים.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המפרידות בין טרמינלים טוניים לפאזיים, מבחינה מורפולוגית ופיזיולוגית, באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה ואלקטרופיזיולוגיה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית בנושאים כגון עייפות שרירים, דכאון סינפטי (synaptic depression) ודיבור סינפטי (synaptic crosstalk). הניסוי מתחיל בתפיסה זהירה של הסרטן כדי להימנע מהצבתפיו.

נתקו את הרגל מהגוף במקטע ה-isia pod. צביטה חזקה במקטע ה-isia pod תגרום לסרטן המים לבצע אוטומיה (automize) או לשבור באופן טבעי את רגל ההליכה הראשונה. הדימום של סרטן המים ייפסק, ולאחר מכן החזירו אותו למיכל השמירה.

אין להקריב את סרטן הנהר. הניחו את הרגל על פיסת נייר סופג כדי שניתן יהיה לסובב את הדגימה בקלות בעת ביצוע החתכים. סובבו את הרגל עד שהצד החיצוני, שהוא הצד הלטרלי, פונה כלפי מעלה על משטח הנתיחה.

בדרך כלל הצד המקושת פונה כלפי מעלה. באמצעות להב תער חד המחובר לשובור להבי סקאלפל, חרצו את הקוטיקולה בתוך סגמנט ה-meite לפי התבנית המוצגת באיור. היזהרו לא לחתוך רחוק מדי באופן דיסטלי בחיתוך מהצד הדורסלי לוונטרלי לאורך מפרק ה-meite carpod.

חיתוך זה יוצר חלון ב-meite מעל שרירי הרגל שמתחתיו. השאר את הקוטיקולה במקומה כעת. הנח את הדגימה בצלחת ניתוח המכילה תמיסה פיזיולוגית לסרטנים.

בשלב זה, מקם סיכה במרכז סגמנט ה-carpod ובהיבט הגבי (dorsal) של סגמנט ה-ischia pod; בעזרת פינצטה עדינה, הרם מעט את החלון שנגזר בקיטיקולה מהקצה הדיסטלי, ובאמצעות התער תגזור את סיבי שריר הכופף (flexor muscle) מהקיטיקולה. המשך לגזור בכיוון מהקצה הדיסטלי לפרוקסימלי, ולבסוף הרם והסר את חלון הקיטיקולה. כדי לחשוף את שריר הפושט (extensor muscle), יש להסיר את שריר הכופף המכסה אותו.

הפרידו את הגיד של שריר הכופף (flexor muscle) על ידי הזזתו משריר הכופף באמצעות סיכה. לאחר מכן, חתכו את הגיד במפרק ה-Mari poddy carpod. כפי שמוצג, הקפידו למשוך את הגיד הרחק מחלל הרגל לפני ביצוע החיתוך, ולהקפיד לחתוך רק את הגיד ולא את עצב הרגל הראשי הנמצא בצדו הפנימי של הגיד.

צבטו בפינצטה את הגיד בנקודת החיתוך ומשכו את שריר הכופף (flexor muscle) מהרגל על ידי הרמתו לכיוון הגב. כדי לחשוף את העצב המוביל לשריר הפושט (extensor muscle), חתכו את עצב הרגל הראשי במפרק ה-merepod carpod ומשכו בזהירות את עצב הרגל הראשי לאחור מעל שריר הפושט. ניתן להקל על הפרדתו של העצב המוביל לשריר הפושט מעצב הרגל הראשי על ידי משיכה עדינה של הקצה הדיסטלי של עצב הרגל הראשי לצד הדגימה. בעת קילוף עצב הרגל הראשי לאחור מעל שריר הפושט, ייתכן שיהיה צורך לחתוך ענפים קטנים של האקסון המעכב (inhibitory axon).

ניתן להדמיאן את צרור העצבים באמצעות צביעה במתילן כחול. עם זאת, לא יעשה שימוש במתילן כחול עבור רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתמונה עליונה זו. חצים אדומים מסמנים את נתיב העצב הרלוונטי.

צרור העצבים המדובר הוא הצרור הגדול יותר המסתעף מעצב הרגל הראשי ליד הקצה הפרוקסימלי של אזור המרפוד (merepod). שימו לב להסתעפות האקסונים ולשני האקסונים הנראים בבירור בתוך העצב. כעת, כאשר העצב והשריר חשופים, הכינו את המכשור המשמש לניסוי.

ההקלטות התוך-תאיות והחוץ-תאיות מבוצעות באמצעות head stage ומגבר סטנדרטיים. אנו משתמשים במגבר מדגם axon clamp two B וב-one XLU head stage. נדרשות שלוש אלקטרודות, אחת תוך-תאית ושתיים חוץ-תאיות.

שתי האלקטרודות החוץ-תאיות ישמשו לגירוי העצב ולהקלטה של אירועי qual סינפטיים מעוררים וספונטניים. בצעו ליטוש באש (fire polish) לאלקטרודות המוקדיות וכופפו אותן קלות מעל גוף חימום. לאחר מילוי אלקטרודה מוקדית בתמיסת מלח (saline), הניחו אותה במחזיק אלקטרודת הגירוי והחדירו את חוט המגרה כך שיהיה במגע עם תמיסת המלח.

זה מחובר ליחידת בידוד גירוי grass P 15, המחוברת למעורר grass S 88. במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, משתמשים בצבע חיוני D two ASP כדי להדמיא את האקסונים; לצורך צביעת האקסונים, מחליפים את תמיסת המלח באמבט בתמיסת מלח המכילה 5 µM של צבע four D two as per למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, ממלאים מחדש את הצלחת בתמיסת מלח פיזיולוגית לסרטן נחל, מניחים את הדגימה תחת מיקרוסקופ ומשתמשים בעדשת Forex.

ובתחת הגדלה של 10x בעדשה, העבירו את אלקטרודת הגירוי לאזור המעניין. השלב הבא הוא להניח את הלומן של אלקטרודת גירוי ה-macro patch על האקסון הפאזי או על האקסון הטוני. תצלום זה של תכשיר שנצבע בשני צבעים מראה כי האקסון הטוני נראה בבירור יותר בשל התוכן המיטוכונדרי המוגבר.

תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הקצוות הטוניים (tonic terminals) מראים וריקוזיטויות (varicosities) רבות, בעוד שהקצוות הפאזיים (phasic terminals) הם בעלי אופי דק יותר. באמצעות עדשה של 20x, מניחים את האלקטרודה על האקסון הטוני או הפאזי. כאן, האלקטרודה מונחת על האקסון הטוני.

הכנס את האלקטרודה התוך-תאית לתוך המיקרו-מניפולטור שלה, והחדר את האלקטרודה התוך-תאית אל תוך תא של שריר פושט. אלקטרודה זו תשמש להקלטה של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים תוך-תאיים (EPSPs). להקלטת EPSPs איכותיים.

הנח את אלקטרודת המוקד השנייה בתוך מיקרו-מניפולטור. פעולה זו מבוצעת על ידי הסרת האלקטרודה התוך-תאית והמחזיק הקודמים והחלפתם במחזיק אלקטרודות נקי. השתמש במיקרו-מניפולטור כדי להניח את הלומן של אלקטרודת המוקד השנייה ישירות מעל בליטה סינפטית (synaptic varicosity).

התנגדות האלקטרודה והאטם נקבעות על ידי העברת פולסי זרם לבדיקה דרך האלקטרודה. בניסויים שלנו, התנגדויות האטם נעו בין 0.3 ל-1 mega ohm והתנגדות האלקטרודה נעה בין 0.5 ל-1 mega ohm. ניתן לנטר את התנגדות האטם לאורך כל ההקלטה.

כאשר תהיו מוכנים להתחיל בגירוי, הפעילו את תוכנת scope 5.0 והתחילו בגירוי של האקסון המבודד. בצורר העצבים, האקסון הטוני מגורה באמצעות אלקטרודת יניקה, וה-EPSPs של סיב השריר נרשמים באמצעות אלקטרודה תוך-תאית או חוץ-תאית. ה-EPSPs נרשמים למחשב דרך ממשק power lab forest.

בעקבות גירוי של האקסון הטוני (tonic axon), ניתן להעביר את אלקטרודת הגירוי אל האקסון הפאזי (phasic axon) ולחזור על הניסוי לאחר גירוי העצב. האלקטרודה התוך-תאית מקליטה EPSPs הנוצרים בתגובה לפעילות של נוירונים מוטוריים הן טוניים והן פאזיים. פסיליטציה סינפטית של הצמתים העצביים-שריריים הטוניים תלויה בתדירות גירוי העצב, כפי שמוצג כאן עבור רצפים עוקבים של כ-20 גירויים כל אחד בתדירות של 60 hertz.

שימו לב להקלות (facilitation) המתרחשת עם גירויים מרובים. איור זה משווה את האמפליטודות של ה-EPSPs שנוצרו על ידי גירוי של העצב הטוני בתדרים של 20 hertz בכחול, 40 hertz בירוק ו-60 hertz באדום; שימו לב להקלות הבולטת המוצגת בתדרי גירוי גבוהים יותר. לטרמינלים טוניים יש יעילות סינפטית נמוכה, אך הם מראים תגובות מוקללות דרמטיות כפי שמוצג.

כאן מוצגים ה-EPSPs הטוניים לבדם, ולאחר מכן התגובות הפאזיות מוערכות מעליהם באותו קנה מידה. בניגוד לטרמינלים הטוניים, הטרמינלים הפאזיים הם בעלי יעילות קוונטלית גבוהה, אך מראים דפרסיה סינפטית בעת גרייה בתדר גבוה. דפרסיה סינפטית בטרמינלים הפאזיים קשורה גם היא לתדר הגרייה, כפי שמוצג כאן.

גירוי רציף בתדר של 5 Hz למשך 30 דקות מדכא את התגובה בצומת העצבי-שרירי. בתדר גירוי גבוה יותר, הדגימה תדכא במהירות רבה יותר תחת גירוי מתאים. הצומת העצבי-שרירי של הסרטן מייצר EPSPs שאינם פוטנציאלי פעולה (non-spiking).

ניתן להשתמש ב-EPSPs אלו כדי לחקור את התכונות האיכותניות המרכיבות את האותות החשמליים המדורגים בשרירים אלו. כאן מוצגות התגובות הסינפטיות האיכותניות של הטרמינל הטוני. שימו לב שלא כל ניסיונות הגירוי מובילים לאירוע איכותני.

ספירה ישירה של אירועים קוונטליים אפשרית בעזרת גרייה בתדירות נמוכה עבור כל תגובה מעוררת. ניתן לקבוע בקלות את מספר האירועים הקוונטליים עבור הטרמינלים הטוניים. על ידי ספירת אירועים קוונטליים, ניתן להקליט את התגובות הסינפטיות מהנוירון המוטורי הפאזי באופן דומה.

עם זאת, התגובות שהופעלו הן בעלות אופי רב-קוואלי (multi qual). תוכן ה-qual הממוצע מוערך באמצעות שימוש באמפליטודה או בשטח הממוצע של ההסטות, יחד עם האמפליטודה או השטח הממוצע של שיאי האירועים הספונטניים. תזכורת אחרונה: יש להיזהר בעת הסרת שריר הכיפוף (flexor muscle) כדי לא לפגוע בעצב בזמן החשיפה של שריר הפשיטה (extensor muscle).

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.