ניסויים פיזיולוגיים עם במעי האחורי סרטן הנהרות: תרגיל מעבדה סטודנטים
18 בינואר 2011
בדו"ח זה אנו מדגימים טכניקות שיכולות לשמש כדי לחקור את הביולוגיה של סרטנים במעי האחורי. אנו מראים כיצד לנתח בטן סרטנים ותחקור את קשורה, פיזיולוגיה מודולציה של פעילות. פעילות כוח peristaltic של התכווצויות נמדדים באמצעות מתמר כוח.
מטרת העל של דוח זה היא להוות כלי הוראה לתלמידי תיכון מתקדמים וסטודנטים לתואר ראשון בקורסי פיזיולוגיה המשתתפים בניסויים פיזיולוגיים. התלמידים לומדים לחשוף ולתעד התכווצויות במעי האחורי של הסרטנים. שלב נוסף הוא כריתת המעי האחורי מבעל החיים, המאפשר יישום ישיר של תרכובות.
לאחר מכן, הכוח והקצב של התכווצויות השרירים החלקים במעי האחורי מנוטרים תוך שימוש בחומרים פרמקולוגיים שונים כדי לבחון את המנגנונים המשנים את עוצמת ההתכווצות. מתקבלות תוצאות המראות את פעולת המודולטורים על הפנימיים העצביים או ישירות על השריר על סמך בדיקות פרמקולוגיות ותת-סוג של קולטנים. שלום, אני ד"ר ג'יי מרסייה מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ברוק.
השתמשתי במעי האחורי של הסרטנים כהכנה לביצוע מחקר על נוירוטרנסמיטורים השולטים בשרירים הקרביים. השתמשתי גם בהכנה זו ככלי הוראה וכחלק משיתוף פעולה עם המעבדה של ד"ר רובין קופר באוניברסיטת קנטקי, אנו משכללים מספר ניסויים המופעלים על ידי סטודנטים למטרות הוראה. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד המעיים התלויים של הסרטנים.
ניתן ליישם אותו גם במחקרים על מחלות כגון מחלות המעורבות במקצבים פריסטלטיים. זה יכול לשמש גם כדי לתאר את המנגנונים העומדים בבסיס אפנון העצבנות של השרירים והעצבים. הסטודנטים ילמדו לפרש נתונים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים באמצעות שימוש בחומרים פרמקולוגיים, נוירוטרנסמיטורים והורמונים נוירולוגיים, וירכשו הבנה כללית של תפקוד הקולטנים.
לגבי אגוניסטים ואנטגוניסטים, התלמידים יבנו עקומות תגובה למינון ויציגו נתונים בצורה גרפית לניתוח סטטיסטי כדי להרדים את החיה, הניחו סרטן באורך גוף של שישה עד 10 סנטימטרים על קרח למשך חמש עד 10 דקות. החזיקו את הסרטנים המורדמים מאחורי הטפרים ביד אחת. חותכים במהירות מארובת העין לאמצע הראש משני הצדדים, ואז עורפים את ראשו של הסרטן.
הדם מהתכשיר יהיה דביק כשהוא מנסה, אז שטפו את הכלים בסיום. לאחר מכן, חתכו את הרגליים ואת הטפרים. לאחר מכן סנפירי הזנב השמאלי והימני, ומשאירים את סנפיר הזנב האמצעי חתוך לאורך הצד הגבי של הבטן עד שמגיעים לקטע האחרון.
ואז חותכים לאורך הקטע האחרון ובמורד הצד השני. הסר את מעטפת הגב. מניחים את הסרטנים המנותחים בצלחת הפטרי המרופדת בסיגאר.
מלח סרטנים מסכן. כדי לכסות את התכשיר השתמשו בסיכות חיתוך כדי להדק את התכשיר לצלחת הפטרי. המעי האחורי מוקף בדרך כלל במסה של כלי דם ורקמת חיבור.
הסר אותם בעזרת מלקחיים. נזהרים לא לפגוע במעיים. המעי האחורי נראה כעת לאורך הבטן.
הניחו לתכשיר הסרטנים המנותחים לשבת בתמיסת המלח למשך כ-10 דקות כדי שיוכל להתאושש מהלם הדיסקציה וחשיפה למי מלח. שימו לב להתכווצויות הפריסטלטיות האיטיות של המעי האחורי. כדי להתחיל, כעת ניתן לחשב את קצב הצירים.
ספור את מספר הקיצורים המתרחשים ב- 30 שניות ורשום אותו ביומן. רשום גם את סוג ההתכווצויות המתרחשות והאם הן פריסטלטיות או ספסטיות. שימו לב לכיוון של כל גל פריסטלטי.
ספרו את קצב ההתכווצויות קרוב לפי הטבעת ובאמצע הדרך לאורך הבטן, בדקו אם יש הבדלי קצב בין שני האזורים הללו. הכינו מגוון פתרונות בדיקה ובאותה טמפרטורה כמו מי מלח הרחצה. הפתרון הראשון שנבדק כאן יהיה סרוטונין מיקרו-מולרי אחד המיוצר במי מלח סרטנים.
בעזרת פיפטה, הסירו את מי המלח מחלל הבטן החשופה של הסרטנים ומרחו את תמיסת הסרוטונין המיקרו-מולרית ישירות על המעי האחורי. מיד לאחר הוספת התמיסה החדשה, המתן 30 שניות ולאחר מכן ספור 30 שניות של התכווצויות באזור ליד פי הטבעת, ולאחר מכן ספור את 30 השניות הבאות של התכווצויות באמצע הדרך לאורך הבטן. רשום מספרים אלה בתרשים ושים לב גם לסוג ההתכווצויות המתרחשות. הבא.
יוצקים את תמיסת הבדיקה מכלי ההקלטה ושוטפים את המעי האחורי מספר פעמים במי מלח סרטנים רגילים. לאחר מכן שוטפים את התכשיר כל 30 שניות למשך חמש דקות. בשלב זה, אתה יכול להוסיף את פתרון הבדיקה הבא, שבהדגמה זו הוא אחד טופמין מיקרומולרי.
רשום את התצפיות שלך כמו קודם וחזור על תהליך זה עבור שאר תרכובות הבדיקה. כאשר משתמשים בריכוזים מרובים של אותו חומר, הקפידו להתחיל בריכוז הנמוך ביותר ולעבוד לריכוזים גבוהים יותר. המערך למדידת כוח התכווצויות ה-GI כולל מחשב נייד עם תוכנת תרשים מעבדה שבע, תרמיל הגשר, מעבדת הכוח, 26 T ומתמר הכוח.
לפני שתוכל למדוד את עוצמת התכווצויות שרירי מערכת העיכול, עליך לבודד את מערכת העיכול. כדי להשיג זאת, חתכו את השרירים בקטע הבטן האחרון, הניחו שני סיכות או יותר דרך הציפורן הגחונית הרכה משני צידי פי הטבעת, ואז חתכו את שאר הבטן, והשאירו את המעי האחורי ופי הטבעת מחוברים לחתיכת ציפורן קטנה. יש לחתוך את המעי קרוב לצומת בית החזה והבטן.
כעת העבירו את מערכת העיכול לכלי רדוד עם תחתית מצופה זרוע. יש כלי דם שעובר לאורך ההיבט הגבי של מערכת העיכול. הרחיקו אותו בזהירות ממערכת העיכול.
יוצקים מלח סרטנים טריים על התכשיר. העבר את מתמר הכוח לתכשיר. התבונן מקרוב בסיכה המודבקת לתחתית מתמר הכוח.
לקצה שמתחבר למעיים יש עיקול קטן. חבר את העיקול הקטן של הסיכה לקצה החתוך של המעי האחורי. לאחר חיבור המעי האחורי, הזיזו מעט את המנה עד שהמעי האחורי מתוח.
היזהר בשלב זה מכיוון שהמעיים צריכים להיות מתוחים, אך לא הדוקים מדי. לחץ מדי עלול לפגוע בשריר. כאשר המנה במצב האופטימלי, השתמש בשעווה או בחימר כדי להחזיק את המנה יציבה.
לאחר מכן, הפעל את התוכנה. כדי להתחיל בהקלטה, פתח את תוכנת תרשימי המעבדה. סגור את תרשים המעבדה, מרכז הפתיחה.
עבור להגדרה בפינה הימנית העליונה. לחץ על הגדרות הערוץ בפינה הימנית התחתונה. שנה את הגדרות הערוץ כך שיהיו ערוץ אחד בלבד.
לחץ על אישור בצד שמאל של המסך. עבור לערוץ תרמיל גשר פתוח אחד. הגדר את הטווח להגדרה הרגישה ביותר, 200 מיקרו-וולט במקרה זה בחלק העליון של התרשים בפינה הימנית.
הגדר מחזורים לשנייה ל-2K. כעת אתה מוכן להקליט. לחץ על התחל כדי לוודא שההתקנה פועלת כהלכה.
גע קלות בקצה המתמר בעזרת פיפטה. אתה אמור לראות שינוי בעוצמה שנרשם על ידי התוכנה. לחץ על עצור בתוכנה ולאחר מכן לחץ על התחל ותן לתוכנית לפעול.
למשך כ-20 שניות, לחץ על עצור והוסף הערה עם התווית מלח. חשב את קצב ההתכווצויות רק על ידי מדידת הזמן מתחילת סטייה אחת לתחילת הבאה, או על ידי ספירת הסטייה הכוללת על פני דקה או שתיים. חשב את הקצב כהתכווצויות לדקה או כהתכווצויות לשנייה בהתאם למהירות שבה הם מתרחשים.
כדי למדוד את עוצמת הקיצורים, השתמש במדד יחסי כדי להשוות קיצורים בתנאים שונים בקובץ השמור. הזז את הסמן M לקו הבסיס, ולאחר מכן הזז את הסמן לשיא הסטייה ושים לב לערך המופיע בפינה השמאלית העליונה של המסך. זהו ערך דלתא שהוא ההפרש מ-M לשיא.
שימו לב שצריך להשאיר את הסמן נייח בשיא כדי למדוד את השינוי. לאחר מכן העבר את סמן M ואת הסמן לצורת הגל הבאה המעניינת וחזור על המדידה כדי לבחון את השפעת המודולטורים. בתכשיר זה, העבירו לאט את מי המלח לתמיסת בדיקה.
במקרה זה, סרוטונין מיקרומולרי אחד, והמשך לרשום את קצב ועוצמת ההתכווצויות כמבחן האחרון. לצורך בדיקת הכנה זו האם מעכבי צומת פער משנים את קצב או כוח ההתכווצויות, מעכבי צומת פער כוללים אתנול אחד או מי מלח שבעבעו בפחמן דו חמצני. תרכובות אלו משמשות אחרונות מכיוון שהן עלולות לפגוע בסיבי השריר לאחר חשיפה ממושכת כדי להשוות את ההשפעה של התרכובות השונות, גרף את הנתונים בתרשים.
שימוש מעניין נוסף בתכשיר זה הוא תיעוד הכוח שנוצר על ידי השרירים המעגליים. עם זאת, אם החלת מעכבי צומת פער על התכשיר שלך, ייתכן שהמעכבים פגעו בשרירים המעגליים, ובמקרה זה עליך להשתמש בתכשיר מעי אחורי טרי כדי לבדוק את השרירים המעגליים. כדי לחשוף את השרירים העגולים, חתכו את צינור המעי במישור אורכי בעזרת מספריים עדינים.
השתמש בסיכות עדינות כדי להצמיד צד אחד היטב למנה. חבר את הסיכה המחוברת על המתמר לצד השני של הרצועה. חשוף את התכשיר לאותן תרכובות שנבדקו על שרירי האורך, הקשר בין התרכובות שנבדקו ומספר וסוג ההתכווצויות מוצג כאן.
אתה יכול לשרטטגרף של מספר ההתכווצויות לעומת הזמן עבור תמיסות המלח, הסרוטונין והגלוטמט. אתה יכול לשרטט גרף של מספר ההתכווצויות לעומת כוח ההתכווצויות במילי-וולט עבור תמיסות סרוטונין גלוטמט מלוחות. השתלה זו יכולה להיעשות הן עבור שרירי האורך והן עבור השרירים המעגליים כדי לבדוק אם שרירי האורך והמעגלים באזורים השונים של המעי מציגים תגובות שונות למודולטורים השונים.
ניתן לחזור על הניסויים לעיל באזורים שונים מפי הטבעת ומעלה לאורך הבטן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר לא לפגוע במערכת העיכול עם הפינצטה ולא למשוך חזק מדי עם מתמר הכוח לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיות, הקלטות של השריר כדי לטפל בבעיות אחרות כגון תפקודי תעלות יונים ומודולציות, ואשר יכולות לשמש כמודל ורקמות אחרות במודלים אחרים של בעלי חיים.
סקירה כללית
דו"ח זה מציג טכניקות לחקירת הביולוגיה של המעי האחורי של סרטן נחלים, כולל נתיחה ומדידה של פעילות פריסטלטית. המחקר נועד לספק תובנות לגבי האנטומיה, הפיזיולוגיה והוויסות של התכווצויות המעי האחורי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירופיזיולוגיה
- פיזיולוגיה השוואתית
- פרמקולוגיה
רקע
- המעי האחורי של הסרטן (crayfish) משמש כמודל לחקר הבקרה על שרירים ויסרליים.
- הבנת הוויסות של התכווצויות עשויה לסייע במחקרי מחלות קשורות.
- הכנה זו משמשת למטרות מחקר והוראה כאחד.
- סטודנטים לומדים לפרש נתונים פיזיולוגיים באמצעות ניסויים.
מטרת המחקר
- להוראת סטודנטים מתקדמים על ניסויים פיזיולוגיים.
- לבחון את ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על התכווצויות שרירים.
- להגביר את ההבנה של תפקודי קולטנים ופעולת מוליכים עצביים.
שיטות שנutilized
- ניתוח של סרטן המים כדי לחשוף את המעי האחורי.
- מדידת קצבי התכווצות באמצעות מתמר כוח (force transducer).
- החלה של סוכנים פרמקולוגיים שונים כדי להעריך את השפעתם.
- תיעוד וניתוח של נתוני התכווצות לצורך הערכה סטטיסטית.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקות לבידוד ולבדיקה של המעי האחורי.
- זיהוי ההשפעה של תרכובות שונות על עוצמת ההתכווצות.
- הצגת שינויים בקצבי ההתכווצות באזורים שונים של המעי האחורי.
- אספקת מסגרת לבניית עקומות תגובה-מנה.
מסקנות
- מעי התחתון של הסרטן מהווה מודל יעיל לחקר מודולציה של שרירים.
- בדיקות פרמקולוגיות יכולות להשיל את המנגנונים של בקרת התכווצות.
- שיטה זו מגבירה את מעורבות הסטודנטים במחקר פיזיולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של התכווצויות המעי האחורי של סרטני נהר מספק פלטפורמה חזקה לבחינת מודולציה נוירו-מוסקולרית ופרמקולוגיה של רצפטורים במערכת ex vivo מבוקרת. מודל זה תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטי עבור תרכובות המשפיעות על תפקוד השריר החלק, עם רלוונטיות ישירה לפיזיולוגיה השוואית ומחקר תרגומי. יכולת השחזור וההתאמה שלו הופכות אותו לבעל ערך לשילוב בתהליכי פיתוח (pipeline) ולהכשרה רב-תחומית במו"פ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה תפקודית של השפעות מוליכים עצביים ומודולטורים על התכווצות שריר ויסצרלי.
- תומך בסיווג של תתי-סוגי רצפטורים ובפרופיל פרמקולוגי לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- מסייע בבניית עקומות תגובה-מנה לצורך קבלת מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועוצמה (potency).
- מספק מודל השוואתי להערכת מסלולים נוירו-מוסקולריים שמורים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות סטנדרטיות וכמותיות של כוח ותדירות התכווצות לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מאפשר בדיקה הדירה של תרכובות וריכוזים מרובים בתוך דגימה אחת.
- תומך בניטור חזותי ומכשורי עבור תהליכי סריקה (screening) חסונים.
- מאפשר חזרה מהירה ואופטימיזציה של תנאי הבדיקה עבור יישומים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מציע מערכת הרלוונטית למחלה לצורך חקר של ויסות קצב הפריסטלטיקה והפרעות נוירו-שריריות.
- מתכתב עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי הענקת אפשרות למדידה כמותית של תגובות פיזיולוגיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני עבור מטרות של שריר חלק.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוססות על תובנות מכניסטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוצעת ex vivo, מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של נוירומודולטורים וליגנדים של קולטנים. היא משתלבת עם תהליכי עבודה החל מתיקוף מטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת בניתוחים השוואתיים בין תרכובות ותנאים שונים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על פעולתם של מוליכים עצביים ומודולטורים במערכת רקמות מבוקרת.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות ותקינה של בדיקות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של קצבי התכווצות וכוחות תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים רלוונטיים למחלה של פריסטלזה ותפקוד נוירומוסקולרי.
- שימוש חוזר בארגון: משמשה כפלטפורמה רב-פעמית להכשרה, פיתוח בדיקות ומחקרים מכניסטיים בקרב צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות נוירו-שריריות ובבירור מנגנונים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות פיזיולוגיות לצורך הדירות וניתנות להרחבה במחקרים בשלבים מוקדמים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות נתונים מכניסטיים חסונים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות למחקר שריר חלק וניומודולציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של נשח, טיפול ברקמות והקלטה פיזיולוגית.
- נחוץ מיכשור של מתמר כוח (force transducer) ותוכנה תואמת לרכישת נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בדיקה ושיטות ניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לתרכובות ולריכוזים שונים, אך מוגבל להקשר של רקמה ex vivo.
- מגבלות פוטנציאליות של חיוניות הרקמה מחייבות טיפול זהיר וביצוע ניסויים בזמן.
