מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן
26 בינואר 2011
גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים שיטה לגידול זן פשתן הניתן להשראה תחת תנאים הגורמים לווריאציה גנומית תורשתית. יתרה מכך, שינויים גנומיים מנוטרים וצמיחתם של הצמחים המושרועים בדורות הבאים נצפית תחת סביבות שונות. כדי להשיג זאת, הפשתן גודל תחת מגוון של תנאי השראה.
לאחר מכן נאספים רקמות עלה וגבעול של Maris בנקודות זמן שונות במהלך צמיחת הצמחים בתנאי הסביבה השונים. בשלב הבא, מבודדים DNA ו-RNA מדגימות הרקמה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ביצוע PCR באמצעות דגימות ה-DNA ו-Q-R-T-P-C-R באמצעות ה-RNA המבודד, כדי לזהות שינויים גנומיים ושינויים בביטוי גנים הנובעים מצמיחה בתנאי סביבה שונים.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התגובה הגנומית לתנאי גידול עם הופעתו של אלמנט ההכנסה הבודד LIS בנקודה ספציפית בגנום, והבדלי ביטוי הקשורים לנוכחותו של אותו אלמנט כפי שהם מוצגים באמצעות PCR ו-R-T-P-C-R שבוצעו עם חומצת גרעין שבודדה מרקמות של צמחים מטופלים. שלום, אני כריס קאל מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Case Western Reserve. אני קורי ג'ונסון ממעבדתו של קאל.
ואני טיפני מוס, גם אני ממעבדת Cull. ואני מרשל לוקאס, סטודנט לתואר ראשון בתוכנית הקיץ למחקר עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת Cull.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים בגנום וביטוי גנים הנובעים מווריאציות בסביבת הגדילה. אז בואו נתחיל. כדי לגדל פשתן תחת תנאי השראה, התחילו במילוי עציצים של חמישה אינץ' באדמה והדקו אותה.
בשלב הבא, יש לשתול שלושה זרעי פשתן בכל עציץ, בעומק של רבע אינץ'. לאחר מכן, יש לכסות את הזרעים באדמה עבור תנאי הביקורת ללא השראה. השקו את הצמחים ב-100 milliliters של תמיסת miracle grow בריכוז של 1/10.
טפל בצמחים בתנאי תזונה גבוהים עם 100 milliliters של Miracle grow בריכוז מלא. לבסוף יש להחיל.
השקה את הצמחים בעלי התזונה הנמוכה במי ברז בלבד. גדל את הצמחים תחת תאורה טבעית במהלך הקיץ תוך כדי צמיחתם. השקה את כל הצמחים באמצעות מערכת ריסוס אוטומטית פעמיים ביום למשך חמש דקות.
יש להחיל את תנאי הגידול על הצמחים פעם בשבוע. יש לאסוף את העלים וגבעולי ה-mari במרווחי זמן שבועיים. עבור מיצוי DNA נאספים שישה עלים, ועבור מיצוי RNA נדרשים שלושה גבעולי me. לאחר האיסוף, יש להניח את החומר הצמחי במבחנה לקריו (cryo vial), להקפיאו במהירות בחנקן נוזלי ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד המיצוי.
שלושת הגנוטיפים גדלים בקצבים יחסיים שונים בהתאם לתנאים. תחת תנאי ביקורת, זן הפשת השבוי storm או קו ה-PL גדלים בצורה הטובה ביותר. מספר קווים נגזרו מהורה זה, כאשר זן גדול או L הוא חיוני יותר מהזן הקטן או S.
עם זאת, בתנאי דלות בחומרי הזנה S גדל טוב יותר מאשר L או pl. ובתנאי עשירות בחומרי הזנה, L גדל טוב יותר מאשר pl, שגדל רק מעט טוב יותר מ-S. השוואה בין כל אחד מהקוים שגדלו תחת שלושת הטיפולים השונים מעלה כי PL גדל בצורה הטובה ביותר בתנאי ביקורת. L גדל בצורה הטובה ביותר בתנאי עשירות בחומרי הזנה, ו-S גדל באופן דומה הן בתנאי עשירות בחומרי הזנה והן בתנאי ביקורת.
נתונים אלו מראים שניתן להבדיל בין שלושת הקווים על סמך צמיחתם תחת שלושת הסביבות. בעוד ש-PL ו-L גדלים טוב יותר בסביבות ספציפיות, S גדל באופן דומה בשלושת התנאים. S אינו מסוגל לנצל תנאי תזונה משופרים, אך מסוגל לצמוח טוב יותר תחת תנאי תזונה נמוכים מאוד.
לצורך מיצוי DNA, הוסיפו באפר AP1 מתוך ערכת Qiagen DNEasy Plant DNA Prep לששה עלים עם חול סטרילי בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה, וגרסו את הרקמה בעזרת מיקרו-מכתש עד שלא ייראו גושים. המשיכו במיצוי בהתאם להוראות הערכה. כדי להתחיל במיצוי RNA, העבירו שלושה גבעולים של maris בתוספת מספר עלים סביבם מתוך מבחנת קריו לאחסון למבחנה למיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו חול סטרילי למבחנה וגרסו את הרקמה בעזרת מיקרו-מכתש עד לקבלת גרסה דקה.
ערבב את הדגימה במערבל (Vortex) למשך 15 שניות כדי לסייע בליזיס, ולאחר מכן סבב במערבל (spin) למשך דקה אחת במהירות של 13,000 RPM כדי לאסוף חול ושאריות כלשהן. הוסף את ה-SNAT לעמודת הסבב (spin column) והמשך בהכנת ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר שחולץ ה-RNA מהרקמה, העבר 10 XDNA buffer בנפח של עשירית מנפח דגימת ה-RNA לתגובה.
ובנוכחות 30 יחידות של DNase, דגרו את התגובה ב-37 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-70 °C למשך חמש דקות. בצעו שעתוק הפוך באמצעות ערכת RNA to cDNA של Applied Biosystems. בהתאם להוראות היצרן, דגרו את התגובה ב-37 °C למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-95 °C למשך חמש דקות.
לבסוף, הרץ 5 µL של ה-CDNA על ג'ל AROS בריכוז 1.5% כדי לקבוע את התנובה. לאחר שה-CDNA של הפשתן הוכן, השתמש בו עבור QPCR. בצע את ה-QPCR באמצעות מערכת ABI StepOne.
בצע את כל הבדיקות בשלוש חזרות לכל ריצה, והשתמש בגן הביתי Acton כביקורת למספר עותקים להכנת התגובות עבור QPCR. הוסף מיקרוליטר אחד של זוג הפריימרים המתאים לכל מבחנה. דלל את ה-CD NA לריכוז המתאים והוסף תשעה מיקרוליטרים לכל מבחנה.
לבסוף, הוסף 10 µL של ה-two x cyberg green PCR master mix לכל מבחנה. לאחר מכן, הגדר את תוכנית ההגברה בהתאם להגדרות ההגברה. חשב את רמות הביטוי היחסיות על סמך מספר המחזורים לסף (threshold), הנקבע לפי פרמטרי ברירת המחדל בתוכנת step one ומאושר על ידי בדיקה של עקומות ההגברה.
הגברה באמצעות PCR של DNA, שבודד מעלים במיקומים שונים לאורך הגבעול, מדגימה את הופעתו של מקטע DNA בודד בגודל 5.7 kilobase, המכונה רצף הכנסה של השורה, או LIS one, כאשר הצמחים גדלים תחת תנאים מעוררים. LIS one מופיע כאשר PL גדל תחת תנאי השראה של חסר בחומרי הזנה ובסופו של דבר הופך להומוזיגוט. כאן, דגימות עלים אחת עד שש בודדו במרווחים שבועיים, כאשר דגימה אחת היא המוקדמת ביותר לאחר הזריעה, ולאחר מכן חולץ DNA מהדגימות.
הגברת PCR חושפת את נוכחותם של שני הקצוות של LAS one בכל הדגימות למעט הראשונה. דבר זה תואם את היעלמותו של אתר ההחדרה הבלתי מושבב (unins inserted site) ואת היעדר הראיות לקיומו ב-QPCR של העלה החמישי. התוצאות מראות כי נוכחות LAS one או שינויים גנומיים אחרים הקשורים להשראה משפיעים על ביטוי הגנים בסמיכות מיידית ל-S one.
ששת הגנים המוצגים כאן מביעים ביטוי דיפרנציאלי ב-PL וב-S; לארבעה מהגנים יש ביטוי גבוה יותר ב-pl, שאינו בעל LIS one. לעומת זאת, לשניים יש ביטוי גבוה יותר ב-S, שכן הוא בעל LIS one. כעת הדגמנו כיצד לגדל שורות פשתן הניתנות להשראה. לפיכך, הגנום משתנה בתגובה לסביבת הגידול ולמאפייני הצמיחה של הדורות הבאים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לשכפל את תנאי הגידול כדי להשיג השראה עקבית של שינויים. וזהו זה. אני יודע שרבים מכם סקפטיים לגבי תופעה זו, אך כעת תוכלו לשחזר את התצפיות בעצמכם.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה לגידול זני פשתן תחת עקה תזונתית כדי להשרות וריאציה גנומית. המחקר מדגיש את הקשר בין שינויים גנומיים ספציפיים לבין תגובות פנוטיפיות בצמחי פשתן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה של צמחים
- וריאציה גנומית
- ניתוח פנוטיפי
רקע
- זני פשתן מראים תגובות גדילה שונות תחת תנאי תזונה משתנים.
- וריאציות גנומיות עשויות להוביל לשינויים פנוטיפיים בצמחים.
- הבנת וריאציות אלו עשויה להנחות פרקטיקות חקלאיות.
- המחקר מתמקד בתפקידו של אלמנט ההחדרה LIS one בהסתגלות לצמיחה.
מטרת המחקר
- לבחינת השפעותיהם של עקה תזונתית על השונות הגנומית של פשתן.
- למעקב אחר שינויים גנומיים ושינויים בביטוי גנים לאורך דורות.
- לזיהוי אלמנטים גנומיים ספציפיים הקשורים לצמיחה בתנאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול פשתן תחת תנאי תזונה מבוקרים.
- איסוף דגימות רקמה מעלים ומגבעים לצורך אנליזה.
- בידוד DNA ו-RNA מרקמות צמחים.
- ביצוע PCR ו-Q-R-T-P-C-R להערכת שינויים גנומיים ובביטוי.
תוצאות עיקריות
- נצפתה שונות גנומית בזני פשתן תחת תנאי תזונה שונים.
- אלמנט ההחדרה LIS one זוהה כגורם מפתח בהסתגלות הצמיחה.
- קווי פשתן שונים הראו קצבי צמיחה משתנים בהתבסס על זמינות רכיבי התזונה.
- תגובות פנוטיפיות נקשרו לשינויים גנומיים ספציפיים.
מסקנות
- עקה תזונתית עלולה להשראות וריאציה גנומית משמעותית בפשתן.
- הבנת וריאציות אלו יכולה לשפר את העמידות של היבול.
- הממצאים תורמים לידע רחב יותר על מנגנוני הסתגלות של צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
שינויים גנומיים תורשתיים המושרים על ידי הסביבה בפשת מספקים מודל להבנה כיצד תנאי עקה יכולים להוביל לווריאציה פנוטיפית ומולקולרית יציבה ותורשתית. מערכת זו מאפשרת לבחון אלמנטים גנומיים המגיבים לעקה ואת העברתם, ובכך מספקת ביטחון חיזוי ביציבות תכונות לאורך דורות. תובנות אלו רלוונטיות באופן אסטרטגי עבור תהליכי גילוי מוקדם ומחקר תרגומי המתמקדים במכניזמים של הסתגלות ובירושה אפיגנטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של אלמנטים גנומיים מושרי-מתח לצורך תיקוף של מטרות פונקציונליות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין טריגרים סביבתיים לשינויים גנומיים תורשתיים.
- מעניק ביטחון חיזוי בנוגע לירושת תכונות ויציבותן לאורך דורות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקף לניטור שינויים גנומיים ובביטוי תחת תנאים מוגדרים.
- מאפשר זיהוי הדיר של אירועי השחלה ושל ביטוי גנים נלווה באמצעות PCR ו-QRT-PCR.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות לכימות תגובות מולקולריות תורשתיות למעקה סביבתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק מודל למחקר של רציפות שינויים גנומיים המושרים על ידי סטרס, משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני.
- עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור אירועים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות.
- מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על יכולת ניבוי של תכונות תורשתיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו ממוקמת בתוך הרצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת בדיקת השערות לגבי השראה סביבתית, הפחתת סיכונים מכניסטית והעברת תכונות.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות לגבי השראה וירושה של שינויים גנומיים תחת עקה.
- סריקה: מספקת תוצרי PCR כמותיים וניתנים לשחזור לזיהוי השחלות ואפיון ביטוי גנים.
- אנליזה: מספקת תוצאות מדידות להשוואת גנוטיפים ותגובות סביבתיות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של הסתגלות תורשתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר שינויים תורשתיים המושרים על ידי הסביבה במערכות אחרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביציבות ובירישה של שינויים גנומיים המושרים על ידי סטרס.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשראה וגילוי הדירים של אירועים גנומיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go על בסיס יכולת הניבוי של תכונות תורשתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תוכניות לתכונות אדפטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית של צמחים ובניתוח חומצות גרעיניות.
- נדרשת גישה לתשתיות PCR, QRT-PCR ואחסון דגימות.
- דורש שכפול קפדני של תנאי הגידול לצורך הדירות (reproducibility).
- עשוי לדרוש התאמה לשימוש במערכות צמחים או במודלים אחרים.
- תלוי ביכולת לניטור מקבילי של שינויים גנומיים ושינויים בביטוי הגנים.
