Name: מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: חקור שינויים גנומיים בפשתן תחת לחץ חומרי מזון באמצעות PCR ו-Q-R-T-P-C-R. השיטה מאפשרת לזהות את האלמנט LIS one ולהבין מנגנוני הסתגלות צמחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. צמיחה של פשתן בתנאים גרימת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 "סירים מלאים באדמה firmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה זרעים לכל סיר נטועים ¼ אינץ עמוק באדמה firmed על הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סירים הם להשקות אז עם 100 מ"ל של פתרונות תזונה מתאימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא גרימת (ג) תנאי השליטה להשתמש כוח 1 / 10 ה Miracle-Gro מדי שבוע. מצב תזונתי גבוה (NPK הטיפול) היה נס כוח מלא לגדול להחיל שבועי. מזין נמוכה - צמחים רק מי ברז מיושם ברחבי הצמיחה שלהם. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמחים גדלים תחת אור טבעי במהלך הקיץ. בחורף הם גדלו תחת אורות נתרן עם מחזור אור / חושך 16 / 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרווחים שבועי עלים meristems נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החומר צמח הוא קפוא מהירה בחנקן נוזלי. </li></ol> תוצאות שלושת גנוטיפים לצמוח בשיעורים יחסית שונה בהתאם לתנאי (איור 1). לכן בתנאים לשלוט קו Pl גדל בצורה הטובה ביותר עם L להיות נמרצת יותר S (איור 1 א). תחת מזינים נמוכה (מים), S גדל יותר או L או Pl (איור 1b). תחת תזונתי גבוה (NPK) L גדל יותר Pl שרק גדל מעט טוב יותר מאשר S (איור 1 ג'). השוואה בין כל השורות גדל פי שלושה טיפולים שונים מוצג באיור 1 ד - ו Pl גדל הטובה ביותר בתנאים הביקורת (איור 1d), L הטובה ביותר תחת תזונתי גבוה (איור 1e) ו-S דומה תחת מזין הן גבוהות ותנאים הביקורת (איור 1f). נתונים אלו מראים כי שלושת הקווים יכול להיות מובחן על בסיס הצמיחה שלהם תחת שלוש סביבות. יש לציין כי Pl גדל בתנאים הטובים ביותר תוך שליטה L גדל הטובה ביותר בתנאים NPK (תחת אשר היה מושרה). S גדל על זהה בכל שלושת התנאים, כלומר, הוא אינו מסוגל לנצל את התנאים תזונתי משופר, אך הוא מסוגל יותר לגדול בתנאים תזונתי נמוך מאוד. הפרמטרים צמיחה שרלוונטיות בידול של צמחים כוללים את גובה הצמח (הקשורים עם אורך זה internode, כלומר המרחק בין כל עלה), גודל העלה ואת מידת הסתעפות. עבור Pl בתנאים בקרה צמח גבוה עם ענפים ועלים ירוקים גדולים וכהים. תחת מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד, המרחק בין כל עלה גם הוא קצר מאוד העלים ירוק קטן וקל. העלים בקצה ירוקים כהים יותר מאלו למטה גזע. תחת מזינים גבוהה הצמח נראה דומה מאוד לזו בתנאים השליטה אלא גם את גזע הראשי יורה לוואי קצר יותר מאשר במפעלי שליטה. עבור genotroph הגדול הצמחים נראים דומים מאוד לאלה של Pl מלבד הגידול הנמרץ ביותר כי תחת מזינים גבוהה. שוב תחת חומרים מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד ויש לו עלים בצבע ירוק בהיר. Genotroph S גדל באופן דומה בכל שלושת סביבות למרות העלים ירוק בהיר תחת מזינים נמוכה. עם זאת, התנאים התזונתי נמוך genotroph S הרבה יותר נמרצת יותר משתי שורות Pl או L. 2. RNA ו-DNA עקירות מ meristems פשתן ועלים נעשים בנפרד. סך רוש RNA ערכת הכנה שימש עקירות RNA ו-DNA DNeasy Qiagen הצמח מכין ערכת שימש עקירות DNA. הפקת רנ"א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 meristems בתוספת כמה עלים סביב מועברים מן cryovial אחסון לתוך צינור Eppendorf והניח לתוך חנקן נוזלי עד מוכן להיות הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חול סטרילית מתווסף צינור רקמות הקרקע באמצעות micropestle עד דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 תמוגה ul / חיץ מחייב מ רוש סך RNA ערכת הכנה נוסף ורקמות היא קרקע נוספת עד גושים לא גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה הוא vortexed במשך 15 שניות כדי לסייע תמוגה ואז הסתחרר דקות 1 בסל"ד 13,000 לאסוף חול וכל פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant מתווסף ספין עמודה שאר הוראות הכנה RNA ערכת הם אחריו כמו מכוונת. </li></ol> DNAse טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 10 נפח RNA מדגם של חיץ DNAse 10X הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 יחידות של DNAse נוסף והתגובה היא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו - 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> Reverse Transcription <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Applied Biosystems RNA לערכה cDNA משמש לכל הכיוונים, התגובה מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ו - 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> CDNA משמש אז PCR או qPCR qPCR qPCR בוצעה באמצעות מערכת אחת ABI שלב. כל מבחני בוצעו בשלושה עותקים על כל סיבוב. הגן אקטין שימש לשלוט עותק המספרמשק הבית הכי זמין גן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד פריימר מתאים נוספה צינור כל 1μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CDNA היה מדולל לריכוז 9μl מתאימים שנוספו צינור אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl של SYBR כוח 2x גרין PCR MasterMix (ABI) וכן נוספה צינור אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנית הגברה התוכנית: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות 95 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 מחזורים של 15sec ב 95 ° C, 1 דקות ב 60 ° C </li></ul> Denaturation צעד תרמי לאמת סגוליות ההגברה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמות הביטוי היחסי נקבעו על ידי הערך של 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> ה-DNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר AP1 מ Qiagen DNeasy הצמח DNA ערכת הכנה מתווסף 6 עלים עם חול סטרילי בתוך שפופרת microfuge. רקמה היא קרקע עם micropestle עד גושים לא גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוראות ערכת הן בעקבות ההנחיות. </li></ol> תוצאות הגברה PCR של ה-DNA שבודד יוצאת בשעה בתפקידים שונים לאורך גזע מוכיח כי המראה של LIS-1 מתרחשת כאשר הצמחים גדלים בתנאים גרימת (4). תוצאות qPCR מראים כי נוכחות של LIS-1 (או שינויים גנומיים אחרים הקשורים הזירוז) משפיע על הביטוי של גנים בסביבה הקרובה של LIS-1 (איור 2). ששת הגנים שמוצג באיור 2 הם כולם הביעו דיפרנציאלי עם ארבעה שיש ביטוי גבוה PL (ללא LIS-1) ושני שיש ביטוי גבוה S (אשר יש LIS-1) ב Pl ו-S. לוח 1 ו -2 הם שני הגנים הקרובים אל נקודת ההוספה של LIS-1. הביטוי של גנים אלה של ב genotroph גדול (אשר יש לו שינויים המושרה אבל אין LIS-1) ואת הביטוי בתנאי גידול שונים יהיה צורך לקבוע כל קשר סיבתי בין LIS-1 ואת השינויים ביטוי. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Pl, L ו-S גדל תחת שלושה משטרים שונים מזין. לוחות - שליטה ב - מזינים נמוכה ג - NPK. ד - Pl, דואר - S, ו - פאנלים ל ד - ו, משמאל לימין: מזינים נמוכה, מלאה NPK. D - Pl, e - L, F - ס <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="איור 2 אגודל" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2 האגודל"> איור 2. Gene הביטוי סביב נקודת הכניסה של LIS-1. ג'ין 1 (מעכבי צמיחה) הוא מיד 5 "אל LIs1 ואת הגן 2 (קיפ הקשורות cyclin תלויי קינאז מעכב id 3" של LIS-1. הגנים האחרים הם כל הזמן הפיגום זהה (~ 500KB) בנוי מ להשלים רצף הגנום פשתן. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">לחץ כאן כדי לראות דמות גדולה</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Amplifications PCR של DNAs שחולצו מן העלים של צמחים בודדים של סטורמונט Cirrus גדל בתנאים תזונתי נמוך. המוצרים PCR הופרדו על ג'ל agarose-TBE 2%. האתר uninserted מוצג בלוח, שני קצוות של האתר מוכנס מוצגים לוחות B ו-C דגימות עלים 1-6 בודדו במרווחים שבועי עם מדגם 1 להיות הראשונה לאחר הזריעה.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פשתן נראה הגנום יציב מטבעו. מספר זנים מסחריים סיבי פשתן הפך במהירות לא אחידה כאשר גדל במשך כמה דורות. התצפיות זהה לא נראה נכון גם לגבי זני שמן פשתן. לכן נראה שיש קשר בין הבחירה באיכות סיבים וחוסר יציבות הגנום. המושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן זוהו במקור דרך החקירה של תצפיות אגרונומית הצמיחה של היבול סיבים. תצפיות אלה הדיר של וריאציות פנוטיפי ו גנומית ספציפית מעלה את השאלה כיצד ולחץ סביבתי יכול להשפיע על חבילה של rearrangements גנומית שעלול להתרחש. המראה חוזרות ונשנות של LIS-1 בתגובה בסביבות מסוימות עולה בקנה אחד עם מוטציה זו להיות במישרין או בעקיפין שנבחר. הצמיחה של קווי המושרה על ידי טיפולים שונים גם מצביע על ביצועים משופרים בתנאים גרימת הרלוונטיים. שינויים בביטוי קשור גם עם נוכחותם של LIS-1 שוב מציין כי הכניסה הזאת להשפיע על ביצועי הצמח. מצגת וידאו מספק פורום התבוננות שינויים צמח פנוטיפי בצורה בלתי אפשרי להעביר דרך החומר המודפס המסורתי.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי פשתן של מגוון המקורי Cirrus סטורמונט מצוין Pl ואת genotrophs L ו ס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 &quot;סירים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתילה בקרקע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Miracle-Gro </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן בלחץ גבוה אורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרגמה pestles </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropestles וצינורות microfuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycler </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה ציוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה דיגיטלית ההתקנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> StepOne qPCR מודול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Qiagen DNeasy הצמח DNA ערכת הכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Applied Biosystems RNA לערכה cDNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוש סך RNA ערכת הכנה </li></ul>

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

כמה זנים פשתן להגיב ללחץ תזונתי על ידי שינוי הגנום שלהם שינויים אלה יכולים לעבור בתורשה דרך דורות רבים. קשור גם שינויים אלה הם גנטי תורשתי פנוטיפי 1,2 וריאציות. סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין שונים יכולים להישאר ועין מתנהלת (בתנאים שליטה), או להיות שונה ביציבות אל גם את genotroph גדול או קטן על ידי צמיחה בתנאים תזונתי גבוה או נמוך בהתאמה. הקווים וכתוצאה מגידול ראשוני תחת כל התנאים האלה מופיעים לגדול יותר כאשר גדל בתנאים זהים בדורות הבאים, בעיקר את הקו Pl גדל הטובה ביותר תחת טיפול הבקרה המצביע על כך הצמחים הגדלים תחת שני החומרים המזינים גבוה ונמוך נמצאים תחת הלחץ. אחד השינויים גנומית המשויכים אינדוקציה של תורשתי שינויים היא הופעתו של אלמנט הכניסה (LIS-1) 3, 4 בעוד הצמחים גדלים תחת הלחץ מזין. בהתייחס לאירוע זה הכניסה, סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין אחר יכול להישאר ללא שינוי (בתנאים שליטה), יש הכניסה מופיעים כל הצמחים (תחת מזינים נמוך) ויש להם זה מועבר לדור הבא, או לקבל את הכניסה (או חלקים ממנו) מופיעים אבל לא להיות מועבר מדור לדור (תחת מזינים גבוהה) 4. תדירות הופעתם של הכניסה זה עולה, כי היא תחת סלקציה חיובית, שגם היא עולה בקנה אחד עם התגובה גידול הדורות הבאים. עלים או meristems שנקטפו בשלבים שונים של צמיחה המשמשים לבידוד דנ&quot;א רנ&quot;א. RNA משמש לזיהוי וריאציה בביטוי הקשורים סביבות גידול שונים ו / או לא הוא נוכחות / היעדרות של LIS-1. ה-DNA בודד משמש כדי לזהות אותם צמחים אשר הכניסה התרחש.

גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.

זני פשתן מסוימים מגיבים למחסור בחומרים מזינים באמצעות שינוי הגנום שלהם, ושינויים אלו עשויים להוריש לאורך דורות רבים. כמו כן...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים שיטה לגידול זן פשתן הניתן להשראה תחת תנאים הגורמים לווריאציה גנומית תורשתית. יתרה מכך, שינויים גנומיים מנוטרים וצמיחתם של הצמחים המושרועים בדורות הבאים נצפית תחת סביבות שונות. כדי להשיג זאת, הפשתן גודל תחת מגוון של תנאי השראה.לאחר מכן נאספים רקמות עלה וגבעול של Maris בנקודות זמן שונות במהלך צמיחת הצמחים בתנאי הסביבה השונים. בשלב הבא, מבודדים DNA ו-RNA מדגימות הרקמה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ביצוע PCR באמצעות דגימות ה-DNA ו-Q-R-T-P-C-R באמצעות ה-RNA המבודד, כדי לזהות שינויים גנומיים ושינויים בביטוי גנים הנובעים מצמיחה בתנאי סביבה שונים.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התגובה הגנומית לתנאי גידול עם הופעתו של אלמנט ההכנסה הבודד LIS בנקודה ספציפית בגנום, והבדלי ביטוי הקשורים לנוכחותו של אותו אלמנט כפי שהם מוצגים באמצעות PCR ו-R-T-P-C-R שבוצעו עם חומצת גרעין שבודדה מרקמות של צמחים מטופלים. שלום, אני כריס קאל מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Case Western Reserve. אני קורי ג'ונסון ממעבדתו של קאל.ואני טיפני מוס, גם אני ממעבדת Cull. ואני מרשל לוקאס, סטודנט לתואר ראשון בתוכנית הקיץ למחקר עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת Cull.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים בגנום וביטוי גנים הנובעים מווריאציות בסביבת הגדילה. אז בואו נתחיל. כדי לגדל פשתן תחת תנאי השראה, התחילו במילוי עציצים של חמישה אינץ' באדמה והדקו אותה.בשלב הבא, יש לשתול שלושה זרעי פשתן בכל עציץ, בעומק של רבע אינץ'. לאחר מכן, יש לכסות את הזרעים באדמה עבור תנאי הביקורת ללא השראה. השקו את הצמחים ב-100 milliliters של תמיסת miracle grow בריכוז של 1/10.טפל בצמחים בתנאי תזונה גבוהים עם 100 milliliters של Miracle grow בריכוז מלא. לבסוף יש להחיל.השקה את הצמחים בעלי התזונה הנמוכה במי ברז בלבד. גדל את הצמחים תחת תאורה טבעית במהלך הקיץ תוך כדי צמיחתם. השקה את כל הצמחים באמצעות מערכת ריסוס אוטומטית פעמיים ביום למשך חמש דקות.יש להחיל את תנאי הגידול על הצמחים פעם בשבוע. יש לאסוף את העלים וגבעולי ה-mari במרווחי זמן שבועיים. עבור מיצוי DNA נאספים שישה עלים, ועבור מיצוי RNA נדרשים שלושה גבעולי me. לאחר האיסוף, יש להניח את החומר הצמחי במבחנה לקריו (cryo vial), להקפיאו במהירות בחנקן נוזלי ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד המיצוי.שלושת הגנוטיפים גדלים בקצבים יחסיים שונים בהתאם לתנאים. תחת תנאי ביקורת, זן הפשת השבוי storm או קו ה-PL גדלים בצורה הטובה ביותר. מספר קווים נגזרו מהורה זה, כאשר זן גדול או L הוא חיוני יותר מהזן הקטן או S.עם זאת, בתנאי דלות בחומרי הזנה S גדל טוב יותר מאשר L או pl. ובתנאי עשירות בחומרי הזנה, L גדל טוב יותר מאשר pl, שגדל רק מעט טוב יותר מ-S. השוואה בין כל אחד מהקוים שגדלו תחת שלושת הטיפולים השונים מעלה כי PL גדל בצורה הטובה ביותר בתנאי ביקורת. L גדל בצורה הטובה ביותר בתנאי עשירות בחומרי הזנה, ו-S גדל באופן דומה הן בתנאי עשירות בחומרי הזנה והן בתנאי ביקורת.נתונים אלו מראים שניתן להבדיל בין שלושת הקווים על סמך צמיחתם תחת שלושת הסביבות. בעוד ש-PL ו-L גדלים טוב יותר בסביבות ספציפיות, S גדל באופן דומה בשלושת התנאים. S אינו מסוגל לנצל תנאי תזונה משופרים, אך מסוגל לצמוח טוב יותר תחת תנאי תזונה נמוכים מאוד.לצורך מיצוי DNA, הוסיפו באפר AP1 מתוך ערכת Qiagen DNEasy Plant DNA Prep לששה עלים עם חול סטרילי בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה, וגרסו את הרקמה בעזרת מיקרו-מכתש עד שלא ייראו גושים. המשיכו במיצוי בהתאם להוראות הערכה. כדי להתחיל במיצוי RNA, העבירו שלושה גבעולים של maris בתוספת מספר עלים סביבם מתוך מבחנת קריו לאחסון למבחנה למיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו חול סטרילי למבחנה וגרסו את הרקמה בעזרת מיקרו-מכתש עד לקבלת גרסה דקה.ערבב את הדגימה במערבל (Vortex) למשך 15 שניות כדי לסייע בליזיס, ולאחר מכן סבב במערבל (spin) למשך דקה אחת במהירות של 13,000 RPM כדי לאסוף חול ושאריות כלשהן. הוסף את ה-SNAT לעמודת הסבב (spin column) והמשך בהכנת ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר שחולץ ה-RNA מהרקמה, העבר 10 XDNA buffer בנפח של עשירית מנפח דגימת ה-RNA לתגובה.ובנוכחות 30 יחידות של DNase, דגרו את התגובה ב-37 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-70 °C למשך חמש דקות. בצעו שעתוק הפוך באמצעות ערכת RNA to cDNA של Applied Biosystems. בהתאם להוראות היצרן, דגרו את התגובה ב-37 °C למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-95 °C למשך חמש דקות.לבסוף, הרץ 5 µL של ה-CDNA על ג'ל AROS בריכוז 1.5% כדי לקבוע את התנובה. לאחר שה-CDNA של הפשתן הוכן, השתמש בו עבור QPCR. בצע את ה-QPCR באמצעות מערכת ABI StepOne.בצע את כל הבדיקות בשלוש חזרות לכל ריצה, והשתמש בגן הביתי Acton כביקורת למספר עותקים להכנת התגובות עבור QPCR. הוסף מיקרוליטר אחד של זוג הפריימרים המתאים לכל מבחנה. דלל את ה-CD NA לריכוז המתאים והוסף תשעה מיקרוליטרים לכל מבחנה.לבסוף, הוסף 10 µL של ה-two x cyberg green PCR master mix לכל מבחנה. לאחר מכן, הגדר את תוכנית ההגברה בהתאם להגדרות ההגברה. חשב את רמות הביטוי היחסיות על סמך מספר המחזורים לסף (threshold), הנקבע לפי פרמטרי ברירת המחדל בתוכנת step one ומאושר על ידי בדיקה של עקומות ההגברה.הגברה באמצעות PCR של DNA, שבודד מעלים במיקומים שונים לאורך הגבעול, מדגימה את הופעתו של מקטע DNA בודד בגודל 5.7 kilobase, המכונה רצף הכנסה של השורה, או LIS one, כאשר הצמחים גדלים תחת תנאים מעוררים. LIS one מופיע כאשר PL גדל תחת תנאי השראה של חסר בחומרי הזנה ובסופו של דבר הופך להומוזיגוט. כאן, דגימות עלים אחת עד שש בודדו במרווחים שבועיים, כאשר דגימה אחת היא המוקדמת ביותר לאחר הזריעה, ולאחר מכן חולץ DNA מהדגימות.הגברת PCR חושפת את נוכחותם של שני הקצוות של LAS one בכל הדגימות למעט הראשונה. דבר זה תואם את היעלמותו של אתר ההחדרה הבלתי מושבב (unins inserted site) ואת היעדר הראיות לקיומו ב-QPCR של העלה החמישי. התוצאות מראות כי נוכחות LAS one או שינויים גנומיים אחרים הקשורים להשראה משפיעים על ביטוי הגנים בסמיכות מיידית ל-S one.ששת הגנים המוצגים כאן מביעים ביטוי דיפרנציאלי ב-PL וב-S; לארבעה מהגנים יש ביטוי גבוה יותר ב-pl, שאינו בעל LIS one. לעומת זאת, לשניים יש ביטוי גבוה יותר ב-S, שכן הוא בעל LIS one. כעת הדגמנו כיצד לגדל שורות פשתן הניתנות להשראה. לפיכך, הגנום משתנה בתגובה לסביבת הגידול ולמאפייני הצמיחה של הדורות הבאים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לשכפל את תנאי הגידול כדי להשיג השראה עקבית של שינויים. וזהו זה. אני יודע שרבים מכם סקפטיים לגבי תופעה זו, אך כעת תוכלו לשחזר את התצפיות בעצמכם.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן ( Linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.

שורש שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך בתוך הטאררי כוסמת (Fagopyrum טאטארנום)

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

אנו מתארים גישה למדידת שינויים ביעילות הפוטוסינתטית בצמחים לאחר טיפול ב-CO2 נמוך באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל.

הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

חקור שינויים גנומיים בפשתן תחת לחץ חומרי מזון באמצעות PCR ו-Q-R-T-P-C-R. השיטה מאפשרת לזהות את האלמנט LIS one ולהבין מנגנוני הסתגלות צמחיים.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

גלה סרטונים נוספים