Name: בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למדו לבודד תאים מונונוקלאריים מהמוח וחוט השדרה בעכברים באמצעות מדרגות Percoll. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פנוטיפי מקיף של תאי חיסון בזרימה ציטומטרית במחלות מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי טרשת נפוצה האגודה הלאומית (ת&quot;א 3021-A1 / T ל AEC) של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.

הכנה של ריאגנטים הכינו מלאי איזוטוני percoll (SIP), 4 מ"ל לכל המוח, על ידי ערבוב 9 חלקים percoll עם חלק אחד של 10X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +. הכן SIP ב 70% 1X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +, 2 מ"ל לכל המוח לוותר לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל חרוטי. הערה: מומלץ percoll יש להשתמש בטמפרטורת החדר, אם משתמשים בו קר, תאים נוטים גוש והפרדה התא הוא פחות יעיל. רקמות איסוף homogenization הרדימי עכברים perfuse דרך החדר השמאלי עם קרים כקרח HBSS 1X. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ולשמור על RPMI ללא פנול אדום עד שכל העכברים מוקרבים. רקמות מקום 7 או 15 מ"ל dounce homogenizer המכיל 3 מ"ל של RPMI, בעדינות לעשות השעיה תא עם העלי רפויים (גודל) ואחריו העלי Tigh צמודה (גודל ב ') כדי להמשיך לנתק את הרקמות. השלם את נפח של המתלים התא מ"ל 7 עם RPMI. צבע להגדיר הוסף 3 מ"ל של SIP כדי השעיית התא לבצע SIP 30% הסופי לאט לאט שכבת ההשעיה תא 10 מ"ל על גבי SIP 70%. זהו השלב הקריטי ביותר של ההליך, השתמש פיפטה, סיוע להגדיר במצב כבידה למנוע ערבוב של 70% ו 30% פתרונות. קו שטוח מאוד ברור צריך להיות גלוי בצומת 70% -30%. צנטריפוגה 30 דקות ב 500 גרם 18 ° C. ודא צנטריפוגות יפסיקו עם בלם מינימלית או לא, כך שלבי הביניים אינה מופרעת. שימוש pipet העברה, בעדינות להסיר את השכבה של פסולת מהחלק העליון של הצינור ולאסוף 2.0-3.0 מ"ל של שלבי הביניים 70% -30% לתוך צינור חרוטי נקי המכיל 8 מ"ל של 1X HBSS. ודא percoll המכיל את שלבי הביניים הוא מדולל על פי שלוש, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך centrifugre ו 7 דקות ב 500 גרם ב 18 ° C. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מכתים תא ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל לשטוף עוד פעם אחת באמצעות צנטריפוגות מיקרו ב 10,000 G 1 דקות ב 4 ° C. נוגדן מכתים כדורי Resuspend ב 50 μl של מטוהרים antimouse CD16/CD32 מדולל 1:200 במאגר מכתים התא כדי לחסום את אתרי הקישור Fc. לדגור על קרח למשך 10 דקות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. הוסף 50 μl של שילוב נוגדן קוקטייל לדגור על קרח למשך 30 דקות. נוגדן כל חייב להיות טיטרציה הראשון להעריך דילול אופטימלי. השתמש שילובים fluorochrome המתאים נבחר על פי היכולות של לייזר הגדרות המסנן של cytometer תזרים הספציפית שלך. שטפו תאים חיץ תא מכתים, כדורי resuspend ב μl 100-200 של חיץ מכתים תא ולנתח מיד cytometer, או לחילופין תאים ניתן resuspended paraformaldehyde ב 2% (PFA) שהוכנו PBS ומאוחסנים יתר בלילה 4 ° C . נציג תוצאות: אחרי סיבוב הדרגתיים, את שלבי הביניים 70% -30% צריך הילה לבנה מוגדר, quantitation של תאים התאושש עכבר תמים צריך להניב 3-5 x10 5 תאים לכל עכבר (המוח וחוט השדרה ועוד). דלקת המוח אולי החל מספרים של תאים דלקתיים בהתאם העלבון CNS או מודל המחלה (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בידוד של תאים mononuclear, מן תמים EAE מוח על המחלה שיא. תאים השעיות המוח הופרדו על רציפות 70% / 30% percoll הדרגתיים. מוכתם תאים הודגרו עם FC-לחסום ואחריו אנטי CD45 נוגדנים למשך 30 דקות על הקרח. תאים שהיו שטופים במאגר מכתים התא קבוע ברכישת PFA 2% מוקדם LSR-II. CD45 העוצמה נמדדת על ציר Y, ​​כאשר שלוש האוכלוסיות ברורים הם דמיינו. אפיון נוסף של פנוטיפ החיסונית של CD45 בתאי היי חדירה מיושמת באמצעות נוגדנים נוספים ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ניתוח של השטח סמנים תא leukocytes CNS מרקמות עכבר רגיל מודלק נוצל במשך כמה עשורים 1-3. פרוטוקולים בידוד מבוססים הפרדת microglia ו leukocytes ידי 4 צנטריפוגה צפיפות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של בידוד CNS leukocytes באמצעות רציפה הדרגתיים percoll. אחרי בידוד של תאים, צביעה עם נוגדנים שונים כגון, אך לא מוגבל-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, וכו &#39;מאפשר זיהוי של אוכלוסיות החיסונית לחדור למערכת העצבים המרכזית על אינדוקציה של פתולוגיה מסוימת. מכתים עם אנטי C...

רקמות homogenization והדרגות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Percoll (Amersham) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס 10X &quot;פתרון מאוזן מלח, בלי סידן ומגנזיום (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI בינוני 1640, ללא אדום פנול (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7-מ&quot;ל או 15 מ&quot;ל רקמות Dounce Grinders (VWR) </li></ul> תזרים cytometry <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Cell Buffer (Biolegend) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש מטוהרים אנטי עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc בלוק), BD Pharmingen </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemacytometer (פישר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Anti-CD45 העכבר (שיבוט 30-F11), CD4 (שיבוט RM4-5), CD19 (שיבוט 6D5), BioLegend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 10X שנאגרו מלוחים, ללא סידן ומגנזיום (Thermo Scientific) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde (Sigma Aldrich) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry ניתוח תזרים ביצע עם השנייה LSR (BD Biosciences) </li></ul>

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש percoll gradients

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

בידוד של תאים חיסוניים כי לחדור למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך, אוטואימוניות זיהום, טראומה או ניוון מוחיים, נדרש לעתים קרובות להגדיר את הפנוטיפ שלהם פונקציות מפעיל. גישות Histochemical הם סייעה לקבוע את המיקום של התאים שחדרו ולנתח את מערכת העצבים המרכזית קשורה לפתולוגיה. עם זאת, ב-situ histochemistry וטכניקות צביעה immunofluorescent מוגבלים במספר נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בכל פעם בודד כדי לאפיין תת תא החיסון ברקמה מסוימת. לכן, גישות היסטולוגית יחד עם החיסון phenotyping ידי cytometry זרימה הם קריטיים לחלוטין לאפיין את ההרכב של חדירה למערכת העצבים המרכזית המקומית. פרוטוקול זה מבוסס על הפרדה של מערכת העצבים המרכזית השעיות הסלולר על discontinous percoll הדרגתיים. המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל באופן יעיל לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות של החיסון יחיד מדגם ידי cytometry הזרימה.

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל ביעילות עבור ניתוחים תזרים cytometric.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

בידוד של תאי חיסון המסננים למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי, נדרש לעיתים קרובות...

תאי מערכת החיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי. בעוד שניתן להשתמש בגישות היסטוכימיות כדי לקבוע את מיקומם של התאים החודרים ולנתח את הפתולוגיה הנלווית, טכניקות אלו מוגבלות על ידי מספר הנוגדנים שניתן להשתמש בהם בו-זמנית. כאן מוצגת שיטה לבידוד מהיר של תאים חד-גרעיניים מרקמות המוח וחוט השדרה, שבה הרקמה החתוכה עוברת תחילה הומוגניזציה.בשלב הבא, מוכן מדרג של Percoll, ולאחר סרימרגציה, נאספים התאים החד-גרעיניים (mononuclear cells) משכבת הממשק. לבסוף, התאים נשטפים ונצבעים באמצעות נוגדנים. באמצעות אנליזה של ציטומטריה זורמת (flow cytometry), ניתן להבחין בין תאים הממקור הדם לבין מיקרוגליה של מעקב, ולקבוע את הפרופורציות היחסיות שלהם במצבי מחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדרג Aris או היסטוכימיה, הוא שהיא פחות גוזלת זמן.דבר זה מאפשר לעבד יותר רקמות בו-זמנית. הדגמת הגדרת המדרג תבוצע על ידי טכנאי מהמעבדה שלי. הכין את הריאגנטים שיהיו דרושים לפרוטוקול זה. התחל עם ארבעה מיליליטר של תמיסת stock isotonic perol, המכונה SIP, עבור כל מוח.כדי לעשות זאת, ערבבו תשעה חלקים של perol עם חלק אחד של HBSS בריכוז 10x ללא סידן ומגנזיום על ידי היפוך המבחנה. לאחר מכן, הכינו תמיסת per call בריכוז 70% על ידי ערבוב ה-SIP שהוכן עם HBSS בריכוז 1x ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטרים של תמיסת per cole בריכוז 70% למבחנה קונית מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר לאיסוף רקמות.עבור הליך זה, הנח את המוחות ושרירי השדרה המוצאים של כל העכברים במחקר בתוך כוסות כימיות המכילות 10 milliliters של RPMI על קרח. לאחר מכן, העבר את הרקמה להומוגניזר מסוג Dounce בנפח של שבעה או 15 milliliters המכיל שלושה milliliters של HBSS בריכוז one times. השתמש בעדינות בעשקן (pestle) בגודל התואם לרפיעה (loose fitting) כדי ליצור סספנזיית תאים, ולאחר מכן החלף לעשקן בגודל B התואם להדקה (tight fitting), והמשך בפירוק הרקמות.לאחר הומוגנציה של הרקמה, הוסיפו RPMI או HBSS בריכוז של פי אחד עד לנפח סופי של שבעה מיליליטרים והמשיכו להכנת הגרדיאנט של percoco. התחילו בהוספה של שלושה מיליליטרים של SIP לתמיחת התאים עד לריכוז סופי של 30% PERCOCO. שימו לב כי יש להשתמש ב-perol בטמפרטורת החדר. אם נעשה בו שימוש כשהוא קר, התאים נוטים להצטבר והפרדת התאים פחות יעילה.לאחר מכן, בעזרת עזר למטרטה (pipette aid) במצב כבידה, העבירו באיטיות את תרחיף התאים בנפח 10 milliliter מעל ה-70%SIP. הימנעו מערבוב של התמיסות בריכוז 70% ו-30%. זהו השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול.קו שטוח וברור מאוד צריך להיות נראה בנקודת המפגש בין ה-70% ל-30%. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שהתמיסות השלישית וה-70% יתערבבו במהלך השקיצה. השלב הבא, כדי לייצב את הממשק, הוא סבב צנטריפוגה למשך 30 דקות במהירות של 500 Gs בטמפרטורה של 18 °C.וודא שהצנטריפוגה תעצור עם בלימה מינימלית או ללא בלימה כלל, כדי שהממשק לא יופר. לאחר סבב הצנטריפוגה של הגרדיאנטים, שכבה עבה וצמיגה של פסולת צריכה להצטבר בחלקו העליון של המבחנה. השכבה הבאה היא שכבת ה-30% per core הצהוב-רהה, שבין השאר עשויה להכיל פסולת.בשלב הבא נראה את הממשק בין ה-70 ל-30, אשר אמור להציג הילה לבנה מוגדרת המכילה את התאים החד-גרעיניים. לבסוף, בתחתית המבחנה נמצאת שכבת ה-70% Percoll השקופה. אם לא נצפה ממשק, סביר להניח שתבואת התאים תהיה נמוכה מאוד, מה שיהפוך את המשך הניתוח לקשה ביותר.לפיכך, בנקודה זו, עשוי להיות דרוש שימוש בסספנסיות תאים טריות כדי להפחית את הזיהום. הסירו בזהירות את שכבת השאריות מעל השפופרת והשליכו אותה. לאחר מכן, באמצעות פיפט פלסטיק, עברו דרך השכבה העליונה (30%) ואספו שני עד שלושה מיליליטרים מהממשק (interphase) של 70/30 והעבירו אותם לשפופרת קונוית נקייה המכילה שמונה מיליליטרים של 1x HBSS.ערבבו את הממשקים המדוללים מספר פעמים על ידי הפיכה, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה למשך שבע דקות ב-500 GS ב-18 degrees Celsius. לאחר הסבוב, הסירו את העל-משקע ותלו את המשקע. העבירו את תרחיף התאים לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר ושטפו אותו פעם אחת נוספת במיליליטר אחד של תמיצת צביעת תאים.השתמשו במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 GS למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לפני השגת שלב הצביעה בנוגדנים. כדי לבצע את הצביעה בנוגדנים, השעיקו מחדש את המשקעים ב-50 µL של נוגדן anti-US CD 16, CD 32 מטוהר, המדולל ביחס של 1:200 בבופר לצביעת תאים, על מנת לחסום את אתרי הקישור של ה-FC. כפי שנדרש בכל הליך צביעה, חיוני שכל הנוגדנים יהיו בתיתור מתאים. הדגירו על קרח למשך 10 דקות. במהלך ההדגרה, העבירו שני עד חמישה µL של תאים וספרו אותם באמצעות המוציטומטר.רקמות משולבות של מוח וחוט שדרה נאיביים צפויות להניב כ-3 עד 5 כפול 10⁵ תאים לכל עכבר. במוחות דלקתיים יהיה מספר משתנה של תאי דלקת, בהתאם לנקודת הזמן שבה נאספו ולמודל המחלה. לאחר הדגירה עם CD 16 ו-CD 32, הוסף 50 µL של תערובת נוגדנים ספציפית לתאי מערכת החיסון. התערובת המשמשת בדוגמה זו מכילה נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19. הדגר על קרח למשך 30 דקות.חשוב לציין כי יש לבצע טיטרציה לכל נוגדן תחילה. כדי להעריך את הדילול האופטימלי, השתמשו בשילובי פלואורוכרומים מתאימים שנבחרו בהתאם ליכולות הלייזר ולהגדרות המסננים של ציטומטר הזרימה הספציפי שלכם. לאחר צביעת התאים, שטפו אותם במאפה לצביעת תאים על ידי הוספת 1 mL של מאפה לצביעת תאים וסבב של דקה אחת במערכת הצנטריפוגה.ב-10,000 Gs לאחר הסבוב, השליכו את העילאי, ולאחר מכן השעיקו שוב את המשקעים ב-100 עד 200 µL של בופר לצביעת תאים לצורך אנליזה מיידית בציטומטריה של זרימה או לאנליזה מאוחרת יותר. השעיקו שוב את התאים ב-2% paraformaldehyde שהוכר ב-PBS ואחסנו למשך לילה ב-4 °C. מוצגים כאן תאים חד-גרעיניים שהופקו והודגרו עם FC block, ולאחריהם נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19.בהתאם לפרוטוקול שהודגם, צביעת CD 45 באמצעות ציטומטריה של זרימה מפרידה היטב בין תאי המטוגנוס בעלי ביטוי CD 45 גבוה לבין מיקרוגליה של מעקב עם ביטוי CD 45 נמוך (DIM). איור זה משווה בין תאים שהבודדו ממוח נאיבי לבין תאים ממוח דלקתי של עכבר שהושרה בו פיתוח של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסונית. עוצמת ה-CD 45 A PC מוצגת בציר ה-Y, שבו ניתן להבחין בשלוש אוכלוסיות נפרדות במוח הנאיבי.מספר מועט מאוד של תאים עם ביטוי גבוה של CD 45 מזוהה. בדרך כלל פחות מ-2% מכלל האוכלוסייה שבודדה. להשוואה, מוחות של עכברים שנפגעו מ-EAE מראים זרימה מאסיבית של תאי דם שגויסו למוח.הוספה של סממני פני שטח תאיים אחרים כגון CD 11 b, CD 4, CD 8 וכדומה, מאפשרת אפיון נוסף של אוכלוסיית ה-CD 45 high. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי גישות היסטולוגיות בשילוב עם פנוטיפ免疫י באמצעות ציטומטריה של זרימה הן קריטיות לאפיון מלא של הרכב התסננויות הדלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS).

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית.

בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד נוירונים בעמוד השדרה מעכבר יילודים לצורך מחקרי מבחנה.

בידוד נוירונים בחוט השדרה: הליך שיפוע צפיפות לבידוד נוירונים בעמוד השדרה בילודים למחקרי מבחנה

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

למדו לבודד תאים מונונוקלאריים מהמוח וחוט השדרה בעכברים באמצעות מדרגות Percoll. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פנוטיפי מקיף של תאי חיסון בזרימה ציטומטרית במחלות מערכת העצבים המרכזית.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

גלה סרטונים נוספים