בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

תאי מערכת החיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי. בעוד שניתן להשתמש בגישות היסטוכימיות כדי לקבוע את מיקומם של התאים החודרים ולנתח את הפתולוגיה הנלווית, טכניקות אלו מוגבלות על ידי מספר הנוגדנים שניתן להשתמש בהם בו-זמנית. כאן מוצגת שיטה לבידוד מהיר של תאים חד-גרעיניים מרקמות המוח וחוט השדרה, שבה הרקמה החתוכה עוברת תחילה הומוגניזציה.

בשלב הבא, מוכן מדרג של Percoll, ולאחר סרימרגציה, נאספים התאים החד-גרעיניים (mononuclear cells) משכבת הממשק. לבסוף, התאים נשטפים ונצבעים באמצעות נוגדנים. באמצעות אנליזה של ציטומטריה זורמת (flow cytometry), ניתן להבחין בין תאים הממקור הדם לבין מיקרוגליה של מעקב, ולקבוע את הפרופורציות היחסיות שלהם במצבי מחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדרג Aris או היסטוכימיה, הוא שהיא פחות גוזלת זמן.

דבר זה מאפשר לעבד יותר רקמות בו-זמנית. הדגמת הגדרת המדרג תבוצע על ידי טכנאי מהמעבדה שלי. הכין את הריאגנטים שיהיו דרושים לפרוטוקול זה. התחל עם ארבעה מיליליטר של תמיסת stock isotonic perol, המכונה SIP, עבור כל מוח.

כדי לעשות זאת, ערבבו תשעה חלקים של perol עם חלק אחד של HBSS בריכוז 10x ללא סידן ומגנזיום על ידי היפוך המבחנה. לאחר מכן, הכינו תמיסת per call בריכוז 70% על ידי ערבוב ה-SIP שהוכן עם HBSS בריכוז 1x ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטרים של תמיסת per cole בריכוז 70% למבחנה קונית מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר לאיסוף רקמות.

עבור הליך זה, הנח את המוחות ושרירי השדרה המוצאים של כל העכברים במחקר בתוך כוסות כימיות המכילות 10 milliliters של RPMI על קרח. לאחר מכן, העבר את הרקמה להומוגניזר מסוג Dounce בנפח של שבעה או 15 milliliters המכיל שלושה milliliters של HBSS בריכוז one times. השתמש בעדינות בעשקן (pestle) בגודל התואם לרפיעה (loose fitting) כדי ליצור סספנזיית תאים, ולאחר מכן החלף לעשקן בגודל B התואם להדקה (tight fitting), והמשך בפירוק הרקמות.

לאחר הומוגנציה של הרקמה, הוסיפו RPMI או HBSS בריכוז של פי אחד עד לנפח סופי של שבעה מיליליטרים והמשיכו להכנת הגרדיאנט של percoco. התחילו בהוספה של שלושה מיליליטרים של SIP לתמיחת התאים עד לריכוז סופי של 30% PERCOCO. שימו לב כי יש להשתמש ב-perol בטמפרטורת החדר. אם נעשה בו שימוש כשהוא קר, התאים נוטים להצטבר והפרדת התאים פחות יעילה.

לאחר מכן, בעזרת עזר למטרטה (pipette aid) במצב כבידה, העבירו באיטיות את תרחיף התאים בנפח 10 milliliter מעל ה-70%SIP. הימנעו מערבוב של התמיסות בריכוז 70% ו-30%. זהו השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול.

קו שטוח וברור מאוד צריך להיות נראה בנקודת המפגש בין ה-70% ל-30%. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שהתמיסות השלישית וה-70% יתערבבו במהלך השקיצה. השלב הבא, כדי לייצב את הממשק, הוא סבב צנטריפוגה למשך 30 דקות במהירות של 500 Gs בטמפרטורה של 18 °C.

וודא שהצנטריפוגה תעצור עם בלימה מינימלית או ללא בלימה כלל, כדי שהממשק לא יופר. לאחר סבב הצנטריפוגה של הגרדיאנטים, שכבה עבה וצמיגה של פסולת צריכה להצטבר בחלקו העליון של המבחנה. השכבה הבאה היא שכבת ה-30% per core הצהוב-רהה, שבין השאר עשויה להכיל פסולת.

בשלב הבא נראה את הממשק בין ה-70 ל-30, אשר אמור להציג הילה לבנה מוגדרת המכילה את התאים החד-גרעיניים. לבסוף, בתחתית המבחנה נמצאת שכבת ה-70% Percoll השקופה. אם לא נצפה ממשק, סביר להניח שתבואת התאים תהיה נמוכה מאוד, מה שיהפוך את המשך הניתוח לקשה ביותר.

לפיכך, בנקודה זו, עשוי להיות דרוש שימוש בסספנסיות תאים טריות כדי להפחית את הזיהום. הסירו בזהירות את שכבת השאריות מעל השפופרת והשליכו אותה. לאחר מכן, באמצעות פיפט פלסטיק, עברו דרך השכבה העליונה (30%) ואספו שני עד שלושה מיליליטרים מהממשק (interphase) של 70/30 והעבירו אותם לשפופרת קונוית נקייה המכילה שמונה מיליליטרים של 1x HBSS.

ערבבו את הממשקים המדוללים מספר פעמים על ידי הפיכה, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה למשך שבע דקות ב-500 GS ב-18 degrees Celsius. לאחר הסבוב, הסירו את העל-משקע ותלו את המשקע. העבירו את תרחיף התאים לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר ושטפו אותו פעם אחת נוספת במיליליטר אחד של תמיצת צביעת תאים.

השתמשו במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 GS למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לפני השגת שלב הצביעה בנוגדנים. כדי לבצע את הצביעה בנוגדנים, השעיקו מחדש את המשקעים ב-50 µL של נוגדן anti-US CD 16, CD 32 מטוהר, המדולל ביחס של 1:200 בבופר לצביעת תאים, על מנת לחסום את אתרי הקישור של ה-FC. כפי שנדרש בכל הליך צביעה, חיוני שכל הנוגדנים יהיו בתיתור מתאים. הדגירו על קרח למשך 10 דקות. במהלך ההדגרה, העבירו שני עד חמישה µL של תאים וספרו אותם באמצעות המוציטומטר.

רקמות משולבות של מוח וחוט שדרה נאיביים צפויות להניב כ-3 עד 5 כפול 10⁵ תאים לכל עכבר. במוחות דלקתיים יהיה מספר משתנה של תאי דלקת, בהתאם לנקודת הזמן שבה נאספו ולמודל המחלה. לאחר הדגירה עם CD 16 ו-CD 32, הוסף 50 µL של תערובת נוגדנים ספציפית לתאי מערכת החיסון. התערובת המשמשת בדוגמה זו מכילה נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19. הדגר על קרח למשך 30 דקות.

חשוב לציין כי יש לבצע טיטרציה לכל נוגדן תחילה. כדי להעריך את הדילול האופטימלי, השתמשו בשילובי פלואורוכרומים מתאימים שנבחרו בהתאם ליכולות הלייזר ולהגדרות המסננים של ציטומטר הזרימה הספציפי שלכם. לאחר צביעת התאים, שטפו אותם במאפה לצביעת תאים על ידי הוספת 1 mL של מאפה לצביעת תאים וסבב של דקה אחת במערכת הצנטריפוגה.

ב-10,000 Gs לאחר הסבוב, השליכו את העילאי, ולאחר מכן השעיקו שוב את המשקעים ב-100 עד 200 µL של בופר לצביעת תאים לצורך אנליזה מיידית בציטומטריה של זרימה או לאנליזה מאוחרת יותר. השעיקו שוב את התאים ב-2% paraformaldehyde שהוכר ב-PBS ואחסנו למשך לילה ב-4 °C. מוצגים כאן תאים חד-גרעיניים שהופקו והודגרו עם FC block, ולאחריהם נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19.

בהתאם לפרוטוקול שהודגם, צביעת CD 45 באמצעות ציטומטריה של זרימה מפרידה היטב בין תאי המטוגנוס בעלי ביטוי CD 45 גבוה לבין מיקרוגליה של מעקב עם ביטוי CD 45 נמוך (DIM). איור זה משווה בין תאים שהבודדו ממוח נאיבי לבין תאים ממוח דלקתי של עכבר שהושרה בו פיתוח של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסונית. עוצמת ה-CD 45 A PC מוצגת בציר ה-Y, שבו ניתן להבחין בשלוש אוכלוסיות נפרדות במוח הנאיבי.

מספר מועט מאוד של תאים עם ביטוי גבוה של CD 45 מזוהה. בדרך כלל פחות מ-2% מכלל האוכלוסייה שבודדה. להשוואה, מוחות של עכברים שנפגעו מ-EAE מראים זרימה מאסיבית של תאי דם שגויסו למוח.

הוספה של סממני פני שטח תאיים אחרים כגון CD 11 b, CD 4, CD 8 וכדומה, מאפשרת אפיון נוסף של אוכלוסיית ה-CD 45 high. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי גישות היסטולוגיות בשילוב עם פנוטיפ免疫י באמצעות ציטומטריה של זרימה הן קריטיות לאפיון מלא של הרכב התסננויות הדלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS).