Name: בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למדו לבודד תאים מונונוקלאריים מהמוח וחוט השדרה בעכברים באמצעות מדרגות Percoll. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פנוטיפי מקיף של תאי חיסון בזרימה ציטומטרית במחלות מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי טרשת נפוצה האגודה הלאומית (ת&quot;א 3021-A1 / T ל AEC) של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.

הכנה של ריאגנטים הכינו מלאי איזוטוני percoll (SIP), 4 מ"ל לכל המוח, על ידי ערבוב 9 חלקים percoll עם חלק אחד של 10X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +. הכן SIP ב 70% 1X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +, 2 מ"ל לכל המוח לוותר לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל חרוטי. הערה: מומלץ percoll יש להשתמש בטמפרטורת החדר, אם משתמשים בו קר, תאים נוטים גוש והפרדה התא הוא פחות יעיל. רקמות איסוף homogenization הרדימי עכברים perfuse דרך החדר השמאלי עם קרים כקרח HBSS 1X. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ולשמור על RPMI ללא פנול אדום עד שכל העכברים מוקרבים. רקמות מקום 7 או 15 מ"ל dounce homogenizer המכיל 3 מ"ל של RPMI, בעדינות לעשות השעיה תא עם העלי רפויים (גודל) ואחריו העלי Tigh צמודה (גודל ב ') כדי להמשיך לנתק את הרקמות. השלם את נפח של המתלים התא מ"ל 7 עם RPMI. צבע להגדיר הוסף 3 מ"ל של SIP כדי השעיית התא לבצע SIP 30% הסופי לאט לאט שכבת ההשעיה תא 10 מ"ל על גבי SIP 70%. זהו השלב הקריטי ביותר של ההליך, השתמש פיפטה, סיוע להגדיר במצב כבידה למנוע ערבוב של 70% ו 30% פתרונות. קו שטוח מאוד ברור צריך להיות גלוי בצומת 70% -30%. צנטריפוגה 30 דקות ב 500 גרם 18 ° C. ודא צנטריפוגות יפסיקו עם בלם מינימלית או לא, כך שלבי הביניים אינה מופרעת. שימוש pipet העברה, בעדינות להסיר את השכבה של פסולת מהחלק העליון של הצינור ולאסוף 2.0-3.0 מ"ל של שלבי הביניים 70% -30% לתוך צינור חרוטי נקי המכיל 8 מ"ל של 1X HBSS. ודא percoll המכיל את שלבי הביניים הוא מדולל על פי שלוש, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך centrifugre ו 7 דקות ב 500 גרם ב 18 ° C. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מכתים תא ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל לשטוף עוד פעם אחת באמצעות צנטריפוגות מיקרו ב 10,000 G 1 דקות ב 4 ° C. נוגדן מכתים כדורי Resuspend ב 50 μl של מטוהרים antimouse CD16/CD32 מדולל 1:200 במאגר מכתים התא כדי לחסום את אתרי הקישור Fc. לדגור על קרח למשך 10 דקות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. הוסף 50 μl של שילוב נוגדן קוקטייל לדגור על קרח למשך 30 דקות. נוגדן כל חייב להיות טיטרציה הראשון להעריך דילול אופטימלי. השתמש שילובים fluorochrome המתאים נבחר על פי היכולות של לייזר הגדרות המסנן של cytometer תזרים הספציפית שלך. שטפו תאים חיץ תא מכתים, כדורי resuspend ב μl 100-200 של חיץ מכתים תא ולנתח מיד cytometer, או לחילופין תאים ניתן resuspended paraformaldehyde ב 2% (PFA) שהוכנו PBS ומאוחסנים יתר בלילה 4 ° C . נציג תוצאות: אחרי סיבוב הדרגתיים, את שלבי הביניים 70% -30% צריך הילה לבנה מוגדר, quantitation של תאים התאושש עכבר תמים צריך להניב 3-5 x10 5 תאים לכל עכבר (המוח וחוט השדרה ועוד). דלקת המוח אולי החל מספרים של תאים דלקתיים בהתאם העלבון CNS או מודל המחלה (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בידוד של תאים mononuclear, מן תמים EAE מוח על המחלה שיא. תאים השעיות המוח הופרדו על רציפות 70% / 30% percoll הדרגתיים. מוכתם תאים הודגרו עם FC-לחסום ואחריו אנטי CD45 נוגדנים למשך 30 דקות על הקרח. תאים שהיו שטופים במאגר מכתים התא קבוע ברכישת PFA 2% מוקדם LSR-II. CD45 העוצמה נמדדת על ציר Y, ​​כאשר שלוש האוכלוסיות ברורים הם דמיינו. אפיון נוסף של פנוטיפ החיסונית של CD45 בתאי היי חדירה מיושמת באמצעות נוגדנים נוספים ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ניתוח של השטח סמנים תא leukocytes CNS מרקמות עכבר רגיל מודלק נוצל במשך כמה עשורים 1-3. פרוטוקולים בידוד מבוססים הפרדת microglia ו leukocytes ידי 4 צנטריפוגה צפיפות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של בידוד CNS leukocytes באמצעות רציפה הדרגתיים percoll. אחרי בידוד של תאים, צביעה עם נוגדנים שונים כגון, אך לא מוגבל-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, וכו &#39;מאפשר זיהוי של אוכלוסיות החיסונית לחדור למערכת העצבים המרכזית על אינדוקציה של פתולוגיה מסוימת. מכתים עם אנטי C...

רקמות homogenization והדרגות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Percoll (Amersham) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס 10X &quot;פתרון מאוזן מלח, בלי סידן ומגנזיום (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI בינוני 1640, ללא אדום פנול (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7-מ&quot;ל או 15 מ&quot;ל רקמות Dounce Grinders (VWR) </li></ul> תזרים cytometry <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Cell Buffer (Biolegend) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש מטוהרים אנטי עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc בלוק), BD Pharmingen </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemacytometer (פישר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Anti-CD45 העכבר (שיבוט 30-F11), CD4 (שיבוט RM4-5), CD19 (שיבוט 6D5), BioLegend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 10X שנאגרו מלוחים, ללא סידן ומגנזיום (Thermo Scientific) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde (Sigma Aldrich) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry ניתוח תזרים ביצע עם השנייה LSR (BD Biosciences) </li></ul>

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש percoll gradients

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

בידוד של תאים חיסוניים כי לחדור למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך, אוטואימוניות זיהום, טראומה או ניוון מוחיים, נדרש לעתים קרובות להגדיר את הפנוטיפ שלהם פונקציות מפעיל. גישות Histochemical הם סייעה לקבוע את המיקום של התאים שחדרו ולנתח את מערכת העצבים המרכזית קשורה לפתולוגיה. עם זאת, ב-situ histochemistry וטכניקות צביעה immunofluorescent מוגבלים במספר נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בכל פעם בודד כדי לאפיין תת תא החיסון ברקמה מסוימת. לכן, גישות היסטולוגית יחד עם החיסון phenotyping ידי cytometry זרימה הם קריטיים לחלוטין לאפיין את ההרכב של חדירה למערכת העצבים המרכזית המקומית. פרוטוקול זה מבוסס על הפרדה של מערכת העצבים המרכזית השעיות הסלולר על discontinous percoll הדרגתיים. המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל באופן יעיל לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות של החיסון יחיד מדגם ידי cytometry הזרימה.

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל ביעילות עבור ניתוחים תזרים cytometric.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

בידוד של תאי חיסון המסננים למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי, נדרש לעיתים קרובות...

תאי מערכת החיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי. בעוד שניתן להשתמש בגישות היסטוכימיות כדי לקבוע את מיקומם של התאים החודרים ולנתח את הפתולוגיה הנלווית, טכניקות אלו מוגבלות על ידי מספר הנוגדנים שניתן להשתמש בהם בו-זמנית. כאן מוצגת שיטה לבידוד מהיר של תאים חד-גרעיניים מרקמות המוח וחוט השדרה, שבה הרקמה החתוכה עוברת תחילה הומוגניזציה.בשלב הבא, מוכן מדרג של Percoll, ולאחר סרימרגציה, נאספים התאים החד-גרעיניים (mononuclear cells) משכבת הממשק. לבסוף, התאים נשטפים ונצבעים באמצעות נוגדנים. באמצעות אנליזה של ציטומטריה זורמת (flow cytometry), ניתן להבחין בין תאים הממקור הדם לבין מיקרוגליה של מעקב, ולקבוע את הפרופורציות היחסיות שלהם במצבי מחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדרג Aris או היסטוכימיה, הוא שהיא פחות גוזלת זמן.דבר זה מאפשר לעבד יותר רקמות בו-זמנית. הדגמת הגדרת המדרג תבוצע על ידי טכנאי מהמעבדה שלי. הכין את הריאגנטים שיהיו דרושים לפרוטוקול זה. התחל עם ארבעה מיליליטר של תמיסת stock isotonic perol, המכונה SIP, עבור כל מוח.כדי לעשות זאת, ערבבו תשעה חלקים של perol עם חלק אחד של HBSS בריכוז 10x ללא סידן ומגנזיום על ידי היפוך המבחנה. לאחר מכן, הכינו תמיסת per call בריכוז 70% על ידי ערבוב ה-SIP שהוכן עם HBSS בריכוז 1x ללא סי

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית.

בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד נוירונים בעמוד השדרה מעכבר יילודים לצורך מחקרי מבחנה.

בידוד נוירונים בחוט השדרה: הליך שיפוע צפיפות לבידוד נוירונים בעמוד השדרה בילודים למחקרי מבחנה

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי מוח ותאי חיסון שחדרו מרקמות מוח איסכמיות של עכברים על ידי עיכול אנזימטי, ולאחר מכן הסרת פסולת תאים ומיאלין על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, כדי לחקור תגובות דלקתיות בחקר שבץ.

השגת תרחיפים של תאים מרקמת מוח איסכמית של עכבר

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

למדו לבודד תאים מונונוקלאריים מהמוח וחוט השדרה בעכברים באמצעות מדרגות Percoll. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פנוטיפי מקיף של תאי חיסון בזרימה ציטומטרית במחלות מערכת העצבים המרכזית.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

גלה סרטונים נוספים