בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

תאי חיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית במהלך זיהום, טראומה, אוטואימוניות או ניוון עצבי. בעוד שניתן להשתמש בגישות היסטוכימיות כדי לקבוע את מיקום התאים החודרים ולנתח את הפתולוגיה הקשורה אליו, טכניקות אלו מוגבלות על ידי מספר הנוגדנים שניתן להשתמש בהם בו זמנית. כאן מוצגת שיטה לבידוד מהיר של תאים חד-גרעיניים מרקמות המוח וחוט השדרה, בה הרקמה המנותחת עוברת תחילה הומוגניזציה.

לאחר מכן, מגדירים שיפוע פרול ולאחר צנטריפוגה, התאים החד-גרעיניים נאספים מהממשק. לבסוף, התאים נשטפים ומוכתמים בנוגדנים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, מבחינים בין תאים המטוגנים ומיקרוגליה מעקב וניתן לקבוע את הפרופורציות היחסיות שלהם במצבי מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שיפוע אריס או בהיסטוכימיה כזו, הוא שהיא גוזלת פחות זמן.

זה מאפשר לך לעבד יותר רקמות בו זמנית. הדגמת הגדרת השיפוע תהיה טכנאי פלינו מהמעבדה שלי הכן את הריאגנטים שיידרשו לפרוטוקול זה. החל מארבעה מיליליטר של פרול איזוטוני המכונה SIP למוח.

לשם כך יש לשלב תשעה חלקים של פרול עם חלק אחד פי 10 HBSS ללא סידן ומגנזיום מעורבבים בהיפוך. לאחר מכן, הכינו 70% לשיחה תוך ערבוב ה- SIP המוכן עם HBSS חד פעמי ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן הוציאו שני מיליליטר של 70% לקול לתוך צינור חרוטי מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר כדי לאסוף רקמות.

לצורך הליך זה, הנח את המוחות וחוט השדרה המנותחים של כל עכברי המחקר בכוסות המכילות 10 מיליליטר RPMI מעל קרח. לאחר מכן, העבירו את הרקמה להומוגניזטור של שבעה או 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של פעם HBSS עם גודל התאמה רופף. עלי יוצר בעדינות תרחיף תאים, ואז עובר לעלי בגודל B הדוק, ומנתק עוד יותר את הרקמות.

לאחר שהרקמה הומוגנית, הוסף RPMI או פעם אחת HBSS לנפח סופי של שבעה מיליליטר והמשך להגדרת השיפוע להגדרת שיפוע הפרקוקו. התחל בהוספת שלושה מיליליטר SIP לתרחיף התא לריכוז PERCOCO סופי של 30% זכור שיש להשתמש בפרול בטמפרטורת החדר. אם משתמשים בו קר, התאים נוטים להתגבש והפרדת התאים פחות יעילה.

לאחר מכן, באמצעות מצב הגדרת הכבידה של פיפטה שלנו, שכבה איטית של מתלה התאים של 10 מיליליטר על גבי 70% SIP. הימנע מערבוב של תמיסות 70% ו-30%. זהו השלב הקריטי ביותר בהליך.

קו שטוח ברור מאוד צריך להיות גלוי בצומת 70 עד 30%. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהפתרונות השלישי וה-70% יתערבבו במהלך השכבות. השלב הבא, פגיעה בממשק צנטריפוגה 30 דקות של 500 Gs ב-18 מעלות צלזיוס.

ודא שהצנטריפוגה תיפסק עם הפסקה מינימלית או ללא הפסקה כדי שהממשק לא יופרע. לאחר סיבוב השיפועים, צריכה להצטבר שכבה עבה וצמיגה של פסולת בחלק העליון של הצינור. השכבה הבאה היא 30% צהבהבים לשכבת ליבה, שלעתים מכילה פסולת.

הבא הוא ממשק 70 עד 30, שאמור להיות בעל הילה לבנה מוגדרת ומכיל את התאים החד-גרעיניים. לבסוף, בתחתית הצינור נמצאת שכבת פרול שקופה של 70%. אם לא נצפה ממשק, סביר להניח שתפוקת התאים תהיה נמוכה מאוד, מה שמקשה מאוד על ניתוח נוסף.

לכן, בשלב זה, ייתכן שיידרשו תרחיפי תאים טריים כדי להפחית את הזיהום. הסר בזהירות את שכבת הפסולת מהחלק העליון של הצינור והשליך אותה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה מפלסטיק, עברו דרך 30% העליונים לשכבת ליבה ואספו שניים עד שלושה מיליליטר משלב 70 30 והעבירו אותו לצינור חרוטי נקי המכיל שמונה מיליליטר של פעם אחת HBSS.

מערבבים את הממשקים המדוללים כמה פעמים בהיפוך, ואז צנטריפוגה למשך שבע דקות ב-500 GS ב-18 מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר את הסופנה והשהה מחדש את הגלולה. במיליליטר אחד של מאגר צביעת תאים, העבירו את תרחיף התא לצינור של 1.5 מיליליטר ושטפו אותו פעם נוספת.

באמצעות מיקרו צנטריפוגה ב-10,000 GS למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס לפני שתמשיך בצביעת נוגדנים לביצוע צביעת נוגדנים, השהה מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר של CD 16, CD 32 מטוהר נגד ארה"ב, מדולל אחד עד 200 במאגר צביעת תאים כדי לחסום את אתרי הקישור של FC. באשר לכל הליך צביעה, הכרחי שכל הנוגדנים יעברו טיטרציה מספקת על קרח למשך 10 דקות. במהלך הדגירה, הסר שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תאים וספור אותם באמצעות ציטומטר המו.

רקמות המוח וחוט השדרה הנאיביות המשולבות אמורות להניב בערך שלוש עד חמש פעמים 10 עד חמישה תאים לעכבר. במוח המודלק יהיו מספר משתנה של תאים דלקתיים בהתאם לנקודת הזמן שבה הם נאספים ולמודל המחלה לאחר הדגירה עם CD 16 ו-CD 32, הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת קוקטייל נוגדנים ספציפיים לתאי חיסון. התערובת המשמשת בדוגמה זו מכילה נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19 דוגרים על קרח למשך 30 דקות.

חשוב לציין, כל נוגדן חייב להיות קודם כל טיטרציה. כדי להעריך דילול אופטימלי, השתמש בשילובי פלואורוכרום מתאימים שנבחרו בהתאם ליכולות הגדרות הלייזר והמסנן של הזרימה הספציפית שלך. ציטומטר, לאחר צביעת התאים, שוטפים אותם במאגר צביעת תאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר צביעת תאים וסיבובם למשך דקה אחת.

ב-10,000 Gs לאחר הסיבוב, השליכו את חומר השכיבה, ולאחר מכן השעו מחדש את המשטחים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים לניתוח ציטומטרי זרימה מיידי לניתוח מאוחר יותר. ראוס משהה את התאים בפורמלדהיד 2%par שהוכן ב-PBS ומאחסנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מוצגים כאן תאים חד-גרעיניים המתקבלים ומודגרים עם בלוק FC, ואחריהם נוגדנים נגד CD 45, CD 4 ו-CD 19.

בהתאם לפרוטוקול המודגם על ידי זרימה ציטומטרית CD 45 צביעה מפרידה יפה בין CD 45 תאים המטוגניים גבוהים לבין CD 45, DIM מעקב microglia. איור זה משווה בין תאים שבודדו ממוח נאיבי לבין מוח דלקתי מעכבר שהושרה לפתח דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית. CD 45 עוצמת PC מוצגת על ציר ה-Y שבו שלוש אוכלוסיות נפרדות מוצגות במוח הנאיבי.

מתגלים מספר קטן מאוד של תאים גבוהים CD 45. בדרך כלל פחות מ-2% מכלל האוכלוסייה המבודדת. לשם השוואה, מוחות מעכברים שנפגעו מ-EAE מראים זרם מסיבי של תאי דם המגויסים למוח.

תוספת של סמני פני תא אחרים כגון CD 11 b, CD four, CD eight וכו', מאפשרת אפיון נוסף של האוכלוסייה הגבוהה CD 45 לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת השתתפות בהליך זה, חשוב לזכור שגישות היסטולוגיות בשילוב עם פנוטיפ חיסוני על ידי זרימה ציטומטרית הן קריטיות לאפיון מלא של הרכב ההסתננות הדלקתית של מערכת העצבים המרכזית.