ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

המטרה העיקרית של הליך זה היא לנטר את הספיגה והתנועה של פריונים על ידי תאי מערכת החיסון שעות ספורות לאחר ההדבקה. לתחילת התהליך, יש לטהר ולסמן בצבע פלואורוכרומי מוטות פריון מצוברי ממוח נגוע, ולאחר מכן להחדיר מוטות פריון אלו לחלל הפריטוני של עכברים. לאחר שעתיים, יש לאסוף תאים מהפריטוניום, מהטחול וכן מהקשריות הלימפה המדיאסטינליות והמזנטריאליות. לבסוף, יש לצבוע את התאים שהופקו באמצעות סממנים פנוטיפיים חיסוניים ולנתח אותם כדי לבחון את שימור ה-PreOn.

לדוגמה, ניתן להשתמש בתוצאות הציטומטריית זרימה כדי להראות שמוטות פריון נשמרים ומועברים בעיקר על ידי מקרופגים ותאים דנדריטיים, באופן משני על ידי מונוציטים ובשלישי על ידי תאי B. מערכת ניסויית זו נועדה לשפוך אור על מאגרי פריונים ויעדים טיפוליים פוטנציאליים על ידי מענה על שאלות מפתח, כגון אילו תאים קולטים PreOn מיד לאחר ההדבקה, לאן הם מעבירים אותם ובאיזו מהירות הם מגיעים לשם?

את הפרוצדורה הזו ידגימו Crystal, Mt.And Brady Michael, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. על מנת לאסוף את חלבוני ה-PreOn, הומוגניזרו 100 milligrams של רקמת מוח שזוהמה ב-PreOn בתוך 900 milliliters של באפר הומוגניזציה קר מאוד (בטמפרטורת קרח) למשך דקה אחת במהירות מקסימלית בבלנדר מסחרי, והניחו מיד על קרח למשך שתי דקות. חזרו על תהליך זה שלוש פעמים כדי להגדיל את תנובת החלבון.

סובב את ההומוגנאט בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-3000 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר ושמור את ה-snat על קרח. השהה מחדש את המשקע בליטר אחד של hp וחזור על שלבי ההומוגניזציה והצנטריפוגה.

כעת, אגדו את ה-snat וסובבו במערך צנטריפוגה למשך 60 דקות ב-100,000 GS בטמפרטורה של zero degrees Celsius. השליכו את הסופרנאטנט. השעו שוב את המשקע ב-100 milliliters של TBST.

מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת בראדפורד (Bradford Assay) והתאימו את הנפח כך שריכוז החלבון יהיה חמישה mg/mL ב-TBST. קררו על קרח למשך 30 דקות. שוב, סבבו בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-100,000 ×g בטמפרטורה של 0°C.

שפשפו את ה-SNA ושטפו את המשקע תחילה ב-50 milliliters של TBST. לאחר מכן, ב-100 milliliters של TBS, השעיכו את המשקע שהתקבל ב-100 milliliters של 1X PBS המכיל 1% sarcas seal ותערובת מעכבי פרוטאז (proteus inhibitor cocktail), וערבבו למשך 120 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כדי לבצע גרדיאנט סוכרוז, הניחו את הדגימה בשכבה מעל 900 milliliters של 320 millimolar סוכרוז וסבבו בצנטריפוגה למשך 60 דקות.

ב-100,000 GS בטמפרטורה של 10 degrees Celsius. השליכו את העלינוס ותלו את המשקע ב-10 milliliters של 2.3 molar sodium chloride, 5%Sarco seal. כעת בצעו סוניקציה לדגימה חמש פעמים למשך 40 seconds בהספק מקסימלי של 70% במרווחי זמן של one minute.

העבירו מיליליטר אחד של דגימה אל מבחנות איבנור (Eppendorf) וסובבו במערך צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-13,000 g בטמפרטורה של 4°C. שטפו את המשקעים פעמיים עם TBS ואחסנו את המאגרים בטמפרטורה של 70-°C. סמנו (Conjugate) מבחנה אחת של מוטות Prion מופרדים באמצעות בקבוקון אחד של כרומופור DITE 649 בהתאם לפרוטוקול היצרן.

לבסוף, החליפו את בופר סימון ה-dite ב-PBS באמצעות סבב צנטריפוגה בעמודי סינון. אחסנו במנות של 20 µL בטמפרטורה של 70°C- הרחק מאור עד למועד השימוש. חלק זה כולל הזרקה תוך-פריטוניאלית, הזרקת פריונים, והשבת תאים מהפריטוניאום, מקשרי הלימפה המדיאסטינליים והמזנטריים ומהטחול מיד לפני השימוש ב-D loop fluorescent prion.

החזק את העכברים ב-PBS בצוואר (scruff) באמצעות האגודל והאצבע. סובב בעדינות את העכבר כך שיפנה אליך וקבע את הזנב עם הזרת. הנח את העכבר במנח שכיבה על הגב (supinate), תוך הרמת החלק האחורי של הגוף מעל הראש והחזקתו במצב הפוך מעט.

באמצעות מזרק אינסולין בכיול 30, מזריקו 100 µL של מוטות פיוני פלואורסצנטיים, סנטימטר אחד לטרלית לקו האמצע ואחד עד שני סנטימטרים אנטריורית למפרק הסקרו-איליאק. הכניסו את המחט סנטימטר אחד דרך העור בזווית של 45 מעלות מדיאלית. עבור עכברי ביקורת, השתמשו בדילול של 1:50 של חרוזי פלואורסצנציה או ב-PBS בלבד. בהתאם למערך הניסוי, הדגירו את העכברים למשך הזמן שנקבע כדי להתחיל בניתוחים.

יש להקריב את העכברים בהתאם לפרוטוקולים המאושרים של ועדת הרווחה לבעלי חיים. מזריקים 10 milliliters של PBS לחלל הפריטונאום באמצעות מזרק של 12 milliliter ומחט במידה 25 gauge. יש לנדנד בעדינות את העכבר לאורכו במשך דקה אחת לפני המעבר לנתיחה של העכבר.

הרטיב היטב את הצד הגחוני של פרוות העכבר ב-70% ethanol. הרם את העור בקו האמצע, ממש מתחת לכלוב הצלעות, באמצעות פינצטה, ובצע חתך קטן בעור בעזרת מספריים. בצע חתך באורך של שלושה עד חמישה סנטימטרים דרך העור בשני הכיוונים, לכיוון הראש ולכיוון הזנב.

בצעו שני חתכים באורך שני סנטימטרים מהקו האמצעי לכיוון הצדדים מכל קצה, קלפו והצמידו את העור בעזרת סיכות כדי לחשוף את חלל הפריטונאום ואת חלל בית החזה. אספו את תרחיף התאים מהפריטונאום באמצעות אותה מזרק ומחט בקוטר 16 gauge. העבירו את הנזילה (exudate) לפרועת קונית בנפח 15 מיליליטר ושמרו על קרח.

חתכו בזהירות את הקרומי השקוף הדק המקיף את הפריטונאום והסיטו את בית החזה כדי לחשוף את המדיאסטינום. כעת אתרו והסִירו שני עד ארבעה קשרי לימפה מדיאסטינליים, הממוקמים מעט דורסלית ובצד, בסמוך לתימוס ובסמוכות מדיאלית לעורק הברכיוצפלי ליד הצד הוונטרלי של הקנה. לאחר מכן, אתרו והסִירו עד שישה קשרי לימפה מזנטריים השקועים ברקמה המזנטרית הלבנה והרכה המעגנת את המעיים לדופן הבטן האחורית.

שמרו את קשרי הלימפה במיליליטר אחד של מצע PMI 1640 על קרח עד לסיום הפרוצדורה. לבסוף, אתרו והוציאו את הטחול. זהו איבר ארוך בצבע אדום כהה הממוקם בצד השמאלי של העכבר, לטרלי לקו האמצע ודורסלי למעיים.

בעזרת בוכנה של מזרק של מיליליטר אחד, מעכו את קשרי הלימפה ודחפו אותם דרך נפה עם רשת של 40 מיקרון אל תוך שלוש מיליליטר של PBS בצלחת פטרי מפלסטיק. שטפו את הנפה עם שתי מיליליטר נוספות של PBS והעבירו את תליית התאים הכוללת, בהיקף של חמש מיליליטר, לפרועת קונית של 15 מיליליטר. כמו כן, שטפו את צלחת הפטרי עם חמש מיליליטר נוספות של PBS והעבירו לאותה הפרועה.

סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-250 gs. השלך את העלייה (supernatant) ותלה שוב את משקע התאים. העבר את התאים המבודדים, בתוך מיליליטר אחד של באפר fax, למבחורת EOR בנפח 1.5 מיליליטר.

בדרך כלל, ניתן להשתמש בפרוטוקול צביעה זה לזיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים כנגד סממנים מאופיינים של פני השטח של תאי מערכת החיסון כדי להוסיף את כל הנוגדנים לתוך בופר fax. מיד לפני השימוש, ספרו את התאים והעבירו 10⁶ תאים לשפרויות epinephrine, שקעו את התאים על ידי סנטריפוגציה ושטפו את המשקע פעמיים ב-1 mL של בופר fax כדי לחסום רצפטורים פנימיים של FC.

דגרו את התאים ב-100 µL של 2 ng/mL של rat anti-US CD 1632 למשך 20 דקות על קרח, צנטריפגו ושטפו את התאים עם FACS buffer. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של 1 ng/mL של הנוגדן או הנוגדנים הפלואורסצנטיים המתאימים לכל דגימה ודגרו על קרח למשך שעה אחת. הוסיפו 100 µL של FACS buffer בלבד לתאי הביקורת, צנטריפגו ושטפו את התאים פעמיים עם FACS buffer.

ששע על שם התאים ב-1 mL של act buffer, והדגר על קרח למשך דקה אחת. כדי ללוטט כדוריות דם אדומות, צנטריפוג את התאים ושטוף אותם עם fax buffer, ולאחר מכן ששע את התאים ב-1 mL של fax buffer. נתח את הדגימות בציטומטר זרימה (flow cytometer), בדרך כלל עם לייזרי עירור של 405, 488 ו-633 nm, וחמישה עד עשרה גלאי פליטה פלואורסצנטית.

הומוגנאט של מוח נגוע בפריון גולמי עשיר מאוד בפריונים. תהליך הטיהור כולל שימוש בדטרגנט, המסה ואולטרסנטריפוגציה של הומוגנאט מוח של שני איילים (E).

ניתוח FACS עמיד ל-K של אוכלוסיות תאים ספציפיות מדגים שתאים מציגי אנטיגן מגיעים לחושפת הבטן (peritoneum) תוך שעתיים ושומרים על החרוזיים הפלואורסצנטיים ועל מוטות הפריון. תאים מעכברים שהוזרקו חרוזים ופריונים הראו פלואורסצנציה משמעותית, במיוחד במונוציטים, בתאים דנדריטיים ובמקרופאגים.

מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופאגים הנושאים PreOn נמצאו גם בקשרי הלימפה המדיאסטינליים. שעתיים לאחר ההזרקה, לא זיהינו חרו지를 או מוטות PreOn בקשרי הלימפה שבעור או בקשרי הלימפה המזנטריים. בניסוי זה, הסרטון הדגים מספר פרוטוקולים לטיהור מוטות פריון מצוברים ממוח נגוע לצורך ביצוע הזרקות תוך-פריטוניאליות, לזיהוי ובידוד נכונים של קשרי לימפה, ולבסוף לבידוד וצביעה של תאי מערכת החיסון.