מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג רישומים אלקטרופיזיולוגיים סימולטניים של פוטנציאל פעולה של נוירון מוטורי ושל התגובה הסינפטית הנלווית בשריר המטרה. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת העור מהצד העליון של הדג. השלב השני של הפרוצדורה הוא חשיפת חוט השדרה על ידי הסרת כל תאי השריר הגביים המכסים אותו.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא חשיפת שריר המהיר שהיא המטרה על ידי הסרת השכבה העליונה של השריר האיטי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע current clamp לנוירון הראשוני או לנוירון ה-cap וביצוע voltage clamp לשריר השלד המטרה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התגובות הסינפטיות בשריר הקשורות להפעלת פוטנציאלי פעולה של נוירון מוטורי, וזאת באמצעות current clamp סימולטני של הנוירון המוטורי ו-voltage clamp של השריר המטרה.

דגי LaVar Super Fish הציעו שילוב של יתרונות, המאפשרים הקלטה של צומת מוטורון-שריר שלד, גודלו הקטן של השריר מאפשר קיבוע מתח (voltage clamp) יעיל, והמאפיינים הסטריאוטייפיים של המוטורון בקצה מאפשרים זיהוי וגישה קלה. כעת, אעבור על הפרוצדורות הנדרשות להקמת patch clamp הן של הנוירון והן של השריר. לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו חמישה תמיסות מפתח, הכוללות: תמיסת רחצה (Bath solution), תמיסת רחצה עם Trica, תמיסת רחצה עם IDE, תמיסות פנימיות לנוירון ותמיסות פנימיות לשריר.

לאחר מכן, אספו זבוב דג זברה (zebra fish) בודד בגיל שבין 72 ל-96 שעות והניחו אותו בתמיסת רחצה עם trica. תוך דקה אחת של חשיפה לחומר ההרדמה, הדג יפסיק להגיב. כדי לבדוק את רמת ההרדמה, הניחו את הדג על גבי צלחת פלסטיק ובאמצעות מיקרוסקופ סטריאו בצעו עריפת ראש בעזרת להב תער בעל שני קצוות חדים.

העבירו את הדג לתא הקלטה מזכוכית מצופה ב-sard ומלא בתמיסת bass. צרו פתח בעור סביב הקצה הרוסטרלי של הדג באמצעות סיכה, כדי לאפשר אחיזה הולמת עבור פינצטה עדינה. הסירו את העור העליון על ידי תפיסתו בפינצטה עדינה סמוך לסיכה הרוסטרלית.

קלפו באיטיות בכיוון הזנב כדי להסיר את העור. טפלו בדג באמצעות 3 mL של תמיסת אמבט עם form IDE למשך שלוש עד חמש דקות כדי לחסום התכווצויות שרירים שעלולות להפריע להקלטות. שטפו חמש פעמים עם תמיסת אמבט רגילה.

הסירה חלק מהשכבה השטחית של השריר מעל חמישה עד שישה סגמנטים על ידי גירוד עדין עם צדו של סיכת טונגסטן. העבר את הדג למיקרוסקופ זקיף הממוקם בתוך כלוב פאראדיי כדי למסך רעשים חשמליים. המיקרוסקופ מצויד בבמה קבועה עם מרחק עבודה ארוך, עדשה אובייקטיבית 40x וזום של 0.5 עד 4x.

המיקרוסקופ מורכב על במה מוטורית להזזה בצירים XY. כדי להזיז את הדגימה בין העצב לשריר תחת הגדלה גבוהה, שימוש באופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) מסייע להדמיות הנוירונים תחת זום של 0.5x. השתמשו בפיפט רחב בקוטר 15 מיקרון כדי להסיר את השריר שמעל ולחשוף את חוט השדרה.

לחץ שלילי מופעל באמצעות מזרק חד-פעמי של 3 cc, ותאי שריר מוסרים אחד אחד. תהליך זה חוזר על עצמו עבור חמישה עד שישה מקטעים גביים של שריר השלד. אותה פיפטה רחבה משמשת גם להסרת שני השכבות העליונות של השריר הבטני כדי להשיג את שריר השלד המהיר המיועד.

בשלב זה הושלאו ההכנות להקלטות זוגיות וזום המיקרוסקופ הוגדל לכ- 1.6 x. מקטעי ה-clean נסרקים כדי לאתר את נוירוני ה-cap. כל מקטע HEMI של חוט השדרה מכיל נוירון מוטורי מסוג cap אחד גדול, בעל קוטר של 10 micron.

סומה זו, בעלת צורה של טיפה, ממוקמת באופן שטחי תחת ה-spinal Jira, קרוב לקצה הקודלי ביותר של הגבול הסגמנטלי. נוירון קאפ נבחר להקלטה, והסגמנט הקודלי המשויך, שדה השריר מטרה הוונטרלי, נסרק כדי לבדוק את השלמות שלו. שתי אלקטרודות patch ממוקמות להקלטה, אחת עבור הנוירון ושנייה עבור השריר.

לאלקטרודה העליונה ישנו קונוס רדוד המיועד לחדירה דרך קרומי העטיפה העמידים של השריד העמודשירה (spinal dura), ופתח קצה של כשני מיקרון. לאלקטרודה התחתונה ישנו קונוס תלול יותר לצורך הקלטת voltage clamp בעלת התנגדות נמוכה של שריר שלד. מקם את אלקטרודת הנוירון בזווית של כ-30 מעלות כדי לחדור את ה-spinal dura.

כחצי מקטע לכיוון הרוסטרלי (קדמי) מהנוירון שנבחר בכיסוי (cap neuron), הקידו את האלקטרודה באמצעות מניפולטור הנעה צירית תוך הפעלת לחץ חיובי עדין ומתמשך של כ-60 millimeters mercury. כאשר האלקטרודה חודרת את הקרומים העוטפים את המוח (dura), נוירון הכיסוי עלול לזוז עקב הפרפוזיה מהאלקטרודה, דבר המצריך כיוון מחדש של המיקוד. כאשר האלקטרודה נוגעת בגוף התא (SOMA) של נוירון הכיסוי, יש לשחרר את הלחץ החיובי, דבר שמוביל בדרך כלל להיווצרות מיידית של giga seal.

עם זאת, במקרים מסוימים שבהם לא נוצר אטם, עולה הצורך להפעיל לחץ שלילי עדין. לאחר היווצרות האטם, פוטנציאל האלקטרודה מכוון למינוס 80 millivolts, והפעלת לחץ שלילי גורמת לקרע של ממברנת התא. נוירון הכובע (cap neuron) מאופיין בהתנגדות קלט של 140 עד 180 mega ohms ובפוטנציאל פעולה שעולה מעל פלוס 40 millivolts.

דבר זה נבדק על ידי הזרקה של שלבים דה-פולריזציה (depolarizing steps) עולים באופן הדרגתי תחת נעילת זרם (current clamp) עד להשגת פוטנציאל פעולה. לאחר מכן, המיקרוסקופ ממוקם מחדש אל השריר הגחוני (ventral muscle) באמצעות המעביר הממונע XY. תחת הגברה גבוהה, נבחר תא שריר מהיר משדה המטרה.

האלקטרודה לשריר מוקדם לעבר תא השריר המטרה תחת לחץ חיובי, אשר בעת שחרורו יוצר חסימה הרמטית (giga seal); פוטנציאל האלקטרודה מכוון למינוס 50 millivolts כדי להשבית את תעלות הנתרן. ותחת שאיבה עדינה, קרום התא נקרע. ירידה בהתנגדות ל-100 עד 200 mega ohms והופעה פתאומית של טרנזיאנט קיבולי גדול מאותתים על כניסה למצב patch.

במהלך ההקלטה, הנוירון המוטורי מדעורר על ידי הזרקות הדרגתיות של זרם בעוצמה עולה עד להשראת פוטנציאל פעולה. בנקודה זו, צריכה להישרא זרימת קצה פלטה (endplate current) בשריר. גירוי מתמשך של הנוירון המוטורי בתדר של 1 hertz מוביל לזרימות קצה פלטה ללא כשל. כאשר תדר הגירוי מועלה ל-100 hertz, זרימות קצה הפלטה משתנות באמפליטודה ועוברות דלטור פונקציונלית בתוך 10 שניות של גירוי.

בדרך כלל, הקלטת הנוירון יציבה למשך עד שעה אחת, אך תאי השריר מידרדרים כפי שבא לידי ביטוי בעלייה בהתנגדות הטורית. כאשר זה קורה, הניסוי מסתיים או שמעבירים patch clamp לתא שריר אחר. יש להשלים את כל ההקלטות בתוך שעה אחת.

ברגע ששולטים בזוג אחד, ניתן להשלים את ההקלטה בתוך שעה עד שעה וחצי. ניתן גם להשיג זוג אחד או שניים נוספים במקטעים הסמוכים. יום הקלטה טיפוסי יניב שניים עד שלושה זוגות.

הקלטות זוגיות של נוירונים מוטוריים ושריר שלד מספקות הזדמנות ייחודית לחקור את תפקודי היסוד של ההעברה הנוירו-שרירית. כאשר הן משמשות בשילוב עם שורות דגים מוטנטיים של Motility, הן יכולות להצביע על מקור התפקוד הלקוי של המערכת הנוירו-שרירית ולספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מחלות אנושיות כגון תסמונת גרורית.