Name: מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למדו שיטת patch clamp סימולטנית מנוירון מוטורי ושריר שלד בזברה פגית. טכניקה זו מאפשרת מדידת תגובות סינפטיות ומחקר מנגנוני העברה נוירומוסקולרית ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שמומן על ידי NIH (NS-18205).

1. הכנת דגים על הקלטות מותאמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התהליך, להכין חמישה פתרונות מרכזיים, הכוללים: פתרון באת, באת עם פתרון Tricaine (MS222), פתרון אמבט עם לפוראמיד, פתרון Neuron פנימית פתרון שריר פנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לאסוף דג הזברה הזחל יחיד בין הגילאים 72-96 שעות במקום בפתרון אמבט עם Tricaine. בתוך דקה אחת של חשיפה לחומר ההרדמה, הדגים לא יגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדג על גבי צלחת פלסטיק, באמצעות stereomicroscope, לערוף עם להב כפול קצה תער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגים אל חדר זכוכית הקלטה מצופה sylgard ומלא פתרון אמבט. הדקו בכל קצה על ידי החדרת סיכות טונגסטן חידד אלקטרוליטים דרך notochord. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור דש העור לקראת סוף מקורי של הדגים בסיכה שיספק אחיזה נאותה בזוג מלקחיים בסדר. הסר את העור המכסה על ידי מרתק זה ליד הסיכה מקורי עם זוג מלקחיים בסדר. פיל באיטיות לכיוון הזנב כדי להסיר את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את הדג עם 3 MLS הפתרון אמבט עם לפוראמיד במשך 3-5 דקות כדי לחסום התכווצויות שרירים שעלולים להפריע הקלטות. לשטוף 5 פעמים עם פתרון אמבטיה רגילה. הסרת חלק של השכבה השטחית של השריר מעל 5-6 פלחי ידי מבטל בעדינות עם הצד של סיכה טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגים מיקרוסקופ זקוף ממוקם בתוך כלוב פאראדיי מגן רעש חשמלי. המיקרוסקופ מצויד במה קבועה, עבודה ארוכות אובייקטיבית המרחק 40X וזום של עד 0.5 4x. המיקרוסקופ הוא רכוב על הבמה תרגום ממונע XY כדי להזיז את ההכנה בין העצב לשריר תחת מתח גבוה. השימוש התערבות אופטיקה ההפרש בניגוד עוזר לדמיין את הנוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת זום x 0.5, השתמש משעמם רחב 15 מיקרון פיפטה להסיר השריר המכסה ולחשוף את חוט השדרה. לחץ שלילי מיושם באמצעות מזרק 3 סמ"ק חד פעמיות לתאי שריר מוסרים אחד אחד. הליך זה חוזר על עצמו במשך 5 עד 6 קטעים הגבי של שרירי השלד. אותו נשא רחב פיפטה משמשת גם להסיר את העליונות שתי שכבות של שריר הגחון כדי להשיג שרירים מהירה היעד השלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה משלים את ההכנות הקלטות לזווג את הזום מיקרוסקופ גדל ל 1.6x כ. </li></ol> 2. הקלטות מותאמים שווי של נוירון מוטורי-שרירים תאים היעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעי לנקות נסרקים לאתר את הנוירונים שווי. כל חמי קטע של חוט השדרה מכיל אחד גדול, בקוטר של 10 מיקרון, שווי מוטורי עצבי. סומה זה בצורת דמעה ממוקם שטחי סמוך לסוף רוב הזנב של הגבול סגמנטלי תחת הדורה השדרה. נוירון כובע נבחר להקלטה השריר היעד הגחון במגזר הזנב סמוך נסרק כדי לבדוק תקינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי אלקטרודות תיקון ממוקמים הקלטה, אחד עבור הנוירון ואת השני עבור השריר. האלקטרודה העליונה יש להתחדד רדוד עבור חדירת קשה בעמוד השדרה הדורה ופתיחת טיפ של כ 2 מיקרון. אלקטרודה נמוכה יש להתחדד תלול יותר עבור מתח נמוך הקלטה מהדק התנגדות של שריר השלד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום האלקטרודה נוירון בזווית של כ 30 מעלות לחדור הדורה השדרה, על אחד חצי קטע מקורי אל הנוירון שווי שנבחר. מראש את האלקטרודה באמצעות מניפולטור כונן צירית תוך החלת לחץ עדין חיובי מתמשך של כ 60 מ"מ כספית. כאשר האלקטרודה פורץ דורה, שווי הנוירון עשוי להיות שנעקרו על ידי זלוף מן האלקטרודה, הדורש הסתגלות של המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר האלקטרודה נוגעת הנוירון יתר לחץ סומה חיובי משתחרר, ובדרך כלל התוצאות במבנה מיידית של חותם gigaohm. עם זאת, בכמה מקרים בהם חותם נכשל הטופס, יהיה צורך להחיל לחץ שלילי עדין. לאחר היווצרות חותם, פוטנציאל אלקטרודה מותאם-80mV ויישום של לחץ שלילי נקרע קרום התא. הנוירון שווי מאופיין בהתנגדות קלט של 140-180 מגה אוהם ואת פוטנציאל פעולה overshoots 40 millivolts. זה נבדק על ידי הזרקת הדרגתי הגדלת צעדים depolarizing תחת מהדק הנוכחית עד פוטנציאל פעולה הוא עורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, המיקרוסקופ הוא הועבר אל שריר הגחון באמצעות מתורגמן ממונע XY תחת מתח גבוה. תא שריר מהר נבחר מתחום היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה השריר היא מתקדמת לכיוון תא המטרה שריר בלחץ חיובי, אשר כאשר שוחרר, טפסים חותם gigaohm. פוטנציאל אלקטרודה מותאם -50 millivolts להשבית תעלות נתרן תחת למצוץ עדין של קרום התא הוא מקרע. ירידה בהתנגדות 100-200 מגה אוהם ואת הופעתו הפתאומית של כניסת אותות קיבולי הארעיים גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוקהקלטה לזווג את מנוע נוירון הוא depolarized ידי זריקות באופן הדרגתי יותר של זרם עד פוטנציאל פעולה הוא עורר. בנקודה זו הנוכחית endplate צריך להיות שהושרו בשריר. גירוי המשך motorneuron ב 1 תוצאות הרץ בזרמי endplate ללא כשל. כאשר תדר הגירוי גדל ל 100 הרץ הזרמים endplate להשתנות ב משרעת ועוברים דלדול תפקודית תוך 10 שניות של גירוי. </li></ol> 3. נציג תוצאות בדרך כלל, הקלטה נוירון הוא יציב עד שעה אחת אבל לתאי השריר להתדרדר לידי ביטוי כמו גידול התנגדות הסדרה. כאשר זה קורה הניסוי יסתיים או אחר תא שריר הוא הידק תיקון. כל הקלטות אמור להסתיים בתוך שעה אחת. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הקלטות של פוטנציאל הפעולה motorneuron (AP, למעלה) ואת endplate שרירים הקשורים הנוכחי (EPC, למטה). פוטנציאל פעולה של נוירון כובע 40 mV להחטיא את המטרה ואת EPC צריך צריך לעלות בתוך μsec 300 וריקבון בתוואי זמן מעריכי עם זמן קבוע תחת 1 msec. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> מתכון </td></tr><tr><td> הפתרון Bath (מ"מ) </td><td> 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 גלוקוז, 10 Na-HEPES, pH 7.8 </td></tr><tr><td> אמבט עם פתרון Tricaine </td><td> אמבט פתרון המכיל tricaine 0.02% </td></tr><tr><td> אמבט עם פתרון לפוראמיד </td><td> אמבט פתרון המכיל 2M לפוראמיד </td></tr><tr><td> Neuron פתרון פנימי (מ"מ) </td><td> 115 K-gluconate, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, ה-pH 7.2 </td></tr><tr><td> שרירים פתרון פנימי (מ"מ) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7.4 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Solutions.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו משתמשים הקלטות לזווג דג הזברה (וון Brehm, 2005) בעיקר כדי ללמוד את תהליכי השחרור של שלפוחית ​​ומיחזור במהלך גירוי בתדירות גבוהה. תהליך זה משתבש מוטנטים תנועתיות שבו בשידור סינפטי רגיל נפגעת עקב מוטציות נקודה רכיבים סינפטיים מפתח. כך, למשל, מוטציות לשבש אגרגטים קולטן postsynaptic (אונו et al. 2001, 2002, 2004) וסינתזה של משדר presynaptic (וואנג et al. 2008) לגרום שחייה בלתי מתואמת. הקלטות מותאמים מספקים את המידע שניתן לאתר את מקור הליקוי פונקציונלי, ובכך מקשרים, התנהגות בגנטיקה ופיזיולוגיה. עכשיו הוא צריך להיות אפשרי כדי להמשיך לנתח את התהליכים שבבסיס בשידור סינפטי באמצעות ביטוי חולף על שווי מנוע הנוירונים באמצעות מקדמי נבון. בדרך זו הגנים שלילי או מוטציה דומיננטית יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בנוירונים אלו הן השלכות התנהגותיות אלקטרו נקבע. יתרון נוסף שמציע תצורת התא כולו מאפשר דיאליזה של סומה שווי עם גורמים שעלולים לשנות מיחזור שלפוחית, כגון רעלים קלוסטרידיאל ו buffers סידן. בשל המרחק הקצר בין סומה ואת השרירים, דיפוזיה אמור להתרחש גם בתוך מסגרת הזמן של הקלטות. הפוטנציאל של הכנה זו החלה רק כדי להיות טפח. השקיפות של הדג במיקום גיל שטחית זו של סינפסות גם מקלה על השימוש בכלים אופטי (Fetcho ו אומאלי, 1997; Fetcho ו Higashijima, 2004). אנחנו כבר מאוד מוצלח מדידה של אנדו exocytosis בדגים החיים באמצעות צבעים FM ואינדיקטורים גנטי כגון Synaptophluorin (Li et al., 2003). בנוסף, רעלים פלורסנט מצומדות ניתן להשתמש בתווית חלבונים סינפטיים עבור הדמיה של דגים חיים (איבנז, טאלון et al. 2004). לאור פשטות ההכנה זה טומן בחובו הבטחה גדולה במחקר עתידי.

<table><tbody><tr><td>בודק למתמר פנאומטי</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>מוט טונגסטן בגודל 0.002 x 3 inch</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>אלסטומר Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>עובי היישום ישפיע על אופטיקת ה-DIC</td></tr></tbody></table>

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה. זוהי תוצאה ישירה של הנגישות לשני סוגי התאים ויכולת ראייה להבחין בין שווי סגמנטלי יחיד מוטורי עצבי על בסיס מורפולוגיה ומיקום. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא. זיהוי סוג שווי מנוע נוירון הוא אושר על ידי מילוי או צבע או על ידי תכונות biophysical כגון waveform פעולה פוטנציאליים קלט התנגדות התא. Motor-נוירון הקלטות האחרון שגרתי עבור שעה אחת המתיר לטווח ארוך הקלטות ממספר בתאי שריר שונים היעד. שליטה על דפוס מנוע הנוירון יורה מאפשרת מדידות של תלות בתדר השידור הסינפטי בצומת neuromuscular. בשל גודל quantal גדול ואת רעש נמוך מסופק על ידי מהדק מתח התא כולו, את כל האירועים יחידתי ניתן לפתור בשריר. תכונה זו מאפשרת לימוד של נכסים הסינפטי בסיסיים כגון תכונות שחרור, מיחזור שלפוחית, כמו גם דיכאון סיוע הסינפטי ו. היתרונות המוצעים על ידי זה in vivo הכנה ליקוי במערכות קודמות מודל neuromuscular למד שבהן מנוע הנוירונים מגורה בדרך כלל על ידי אלקטרודות תאי השרירים הם גדולים מדי עבור מהדק תא כל תיקון. הכנת דג הזברה ניתנת בשילוב ניתוח אלקטרו עם מגוון רחב של גישות כולל קווי מהונדס, מציאה morpholino, התערבות פרמקולוגית ו in vivo הדמיה. גישות אלה, יחד עם מספר גדל והולך של דגמים מחלה התוקפת מסופק על ידי קווי מוטציה של דג הזברה, לפתוח את הדלת הבנה חדשה של הפרעות neuromuscular האדם.

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא.

זבובים של דגי זברפיש בשלב הזחלה מהווים את מערכת המודל הראשונה בחולייתים המאפשרת הקלטת פאטץ'-קלאמפ (patch clamp) סימולטנית מנוירון מוטורי בעמוד השדרה ומשריר המטרה.

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג רישומים אלקטרופיזיולוגיים סימולטניים של פוטנציאל פעולה של נוירון מוטורי ושל התגובה הסינפטית הנלווית בשריר המטרה. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת העור מהצד העליון של הדג. השלב השני של הפרוצדורה הוא חשיפת חוט השדרה על ידי הסרת כל תאי השריר הגביים המכסים אותו.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא חשיפת שריר המהיר שהיא המטרה על ידי הסרת השכבה העליונה של השריר האיטי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע current clamp לנוירון הראשוני או לנוירון ה-cap וביצוע voltage clamp לשריר השלד המטרה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התגובות הסינפטיות בשריר הקשורות להפעלת פוטנציאלי פעולה של נוירון מוטורי, וזאת באמצעות current clamp סימולטני של הנוירון המוטורי ו-voltage clamp של השריר המטרה.דגי LaVar Super Fish הציעו שילוב של יתרונות, המאפשרים הקלטה של צומת מוטורון-שריר שלד, גודלו הקטן של השריר מאפשר קיבוע מתח (voltage clamp) יעיל, והמאפיינים הסטריאוטייפיים של המוטורון בקצה מאפשרים זיהוי וגישה קלה. כעת, אעבור על הפרוצדורות הנדרשות להקמת patch clamp הן של הנוירון והן של השריר. לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו חמישה תמיסות מפתח, הכוללות: תמיסת רחצה (Bath solution), תמיסת רחצה עם Trica, תמיסת רחצה עם IDE, תמיסות פנימיות לנוירון ותמיסות פנימיות לשריר.לאחר מכן, אספו זבוב דג זברה (zebra fish) בודד בגיל שבין 72 ל-96 שעות והניחו אותו בתמיסת רחצה עם trica. תוך דקה אחת של חשיפה לחומר ההרדמה, הדג יפסיק להגיב. כדי לבדוק את רמת ההרדמה, הניחו את הדג על גבי צלחת פלסטיק ובאמצעות מיקרוסקופ סטריאו בצעו עריפת ראש בעזרת להב תער בעל שני קצוות חדים.העבירו את הדג לתא הקלטה מזכוכית מצופה ב-sard ומלא בתמיסת bass. צרו פתח בעור סביב הקצה הרוסטרלי של הדג באמצעות סיכה, כדי לאפשר אחיזה הולמת עבור פינצטה עדינה. הסירו את העור העליון על ידי תפיסתו בפינצטה עדינה סמוך לסיכה הרוסטרלית.קלפו באיטיות בכיוון הזנב כדי להסיר את העור. טפלו בדג באמצעות 3 mL של תמיסת אמבט עם form IDE למשך שלוש עד חמש דקות כדי לחסום התכווצויות שרירים שעלולות להפריע להקלטות. שטפו חמש פעמים עם תמיסת אמבט רגילה.הסירה חלק מהשכבה השטחית של השריר מעל חמישה עד שישה סגמנטים על ידי גירוד עדין עם צדו של סיכת טונגסטן. העבר את הדג למיקרוסקופ זקיף הממוקם בתוך כלוב פאראדיי כדי למסך רעשים חשמליים. המיקרוסקופ מצויד בבמה קבועה עם מרחק עבודה ארוך, עדשה אובייקטיבית 40x וזום של 0.5 עד 4x.המיקרוסקופ מורכב על במה מוטורית להזזה בצירים XY. כדי להזיז את הדגימה בין העצב לשריר תחת הגדלה גבוהה, שימוש באופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) מסייע להדמיות הנוירונים תחת זום של 0.5x. השתמשו בפיפט רחב בקוטר 15 מיקרון כדי להסיר את השריר שמעל ולחשוף את חוט השדרה.לחץ שלילי מופעל באמצעות מזרק חד-פעמי של 3 cc, ותאי שריר מוסרים אחד אחד. תהליך זה חוזר על עצמו עבור חמישה עד שישה מקטעים גביים של שריר השלד. אותה פיפטה רחבה משמשת גם להסרת שני השכבות העליונות של השריר הבטני כדי להשיג את שריר השלד המהיר המיועד.בשלב זה הושלאו ההכנות להקלטות זוגיות וזום המיקרוסקופ הוגדל לכ- 1.6 x. מקטעי ה-clean נסרקים כדי לאתר את נוירוני ה-cap. כל מקטע HEMI של חוט השדרה מכיל נוירון מוטורי מסוג cap אחד גדול, בעל קוטר של 10 micron.סומה זו, בעלת צורה של טיפה, ממוקמת באופן שטחי תחת ה-spinal Jira, קרוב לקצה הקודלי ביותר של הגבול הסגמנטלי. נוירון קאפ נבחר להקלטה, והסגמנט הקודלי המשויך, שדה השריר מטרה הוונטרלי, נסרק כדי לבדוק את השלמות שלו. שתי אלקטרודות patch ממוקמות להקלטה, אחת עבור הנוירון ושנייה עבור השריר.לאלקטרודה העליונה ישנו קונוס רדוד המיועד לחדירה דרך קרומי העטיפה העמידים של השריד העמודשירה (spinal dura), ופתח קצה של כשני מיקרון. לאלקטרודה התחתונה ישנו קונוס תלול יותר לצורך הקלטת voltage clamp בעלת התנגדות נמוכה של שריר שלד. מקם את אלקטרודת הנוירון בזווית של כ-30 מעלות כדי לחדור את ה-spinal dura.כחצי מקטע לכיוון הרוסטרלי (קדמי) מהנוירון שנבחר בכיסוי (cap neuron), הקידו את האלקטרודה באמצעות מניפולטור הנעה צירית תוך הפעלת לחץ חיובי עדין ומתמשך של כ-60 millimeters mercury. כאשר האלקטרודה חודרת את הקרומים העוטפים את המוח (dura), נוירון הכיסוי עלול לזוז עקב הפרפוזיה מהאלקטרודה, דבר המצריך כיוון מחדש של המיקוד. כאשר האלקטרודה נוגעת בגוף התא (SOMA) של נוירון הכיסוי, יש לשחרר את הלחץ החיובי, דבר שמוביל בדרך כלל להיווצרות מיידית של giga seal.עם זאת, במקרים מסוימים שבהם לא נוצר אטם, עולה הצורך להפעיל לחץ שלילי עדין. לאחר היווצרות האטם, פוטנציאל האלקטרודה מכוון למינוס 80 millivolts, והפעלת לחץ שלילי גורמת לקרע של ממברנת התא. נוירון הכובע (cap neuron) מאופיין בהתנגדות קלט של 140 עד 180 mega ohms ובפוטנציאל פעולה שעולה מעל פלוס 40 millivolts.דבר זה נבדק על ידי הזרקה של שלבים דה-פולריזציה (depolarizing steps) עולים באופן הדרגתי תחת נעילת זרם (current clamp) עד להשגת פוטנציאל פעולה. לאחר מכן, המיקרוסקופ ממוקם מחדש אל השריר הגחוני (ventral muscle) באמצעות המעביר הממונע XY. תחת הגברה גבוהה, נבחר תא שריר מהיר משדה המטרה.האלקטרודה לשריר מוקדם לעבר תא השריר המטרה תחת לחץ חיובי, אשר בעת שחרורו יוצר חסימה הרמטית (giga seal); פוטנציאל האלקטרודה מכוון למינוס 50 millivolts כדי להשבית את תעלות הנתרן. ותחת שאיבה עדינה, קרום התא נקרע. ירידה בהתנגדות ל-100 עד 200 mega ohms והופעה פתאומית של טרנזיאנט קיבולי גדול מאותתים על כניסה למצב patch.במהלך ההקלטה, הנוירון המוטורי מדעורר על ידי הזרקות הדרגתיות של זרם בעוצמה עולה עד להשראת פוטנציאל פעולה. בנקודה זו, צריכה להישרא זרימת קצה פלטה (endplate current) בשריר. גירוי מתמשך של הנוירון המוטורי בתדר של 1 hertz מוביל לזרימות קצה פלטה ללא כשל. כאשר תדר הגירוי מועלה ל-100 hertz, זרימות קצה הפלטה משתנות באמפליטודה ועוברות דלטור פונקציונלית בתוך 10 שניות של גירוי.בדרך כלל, הקלטת הנוירון יציבה למשך עד שעה אחת, אך תאי השריר מידרדרים כפי שבא לידי ביטוי בעלייה בהתנגדות הטורית. כאשר זה קורה, הניסוי מסתיים או שמעבירים patch clamp לתא שריר אחר. יש להשלים את כל ההקלטות בתוך שעה אחת.ברגע ששולטים בזוג אחד, ניתן להשלים את ההקלטה בתוך שעה עד שעה וחצי. ניתן גם להשיג זוג אחד או שניים נוספים במקטעים הסמוכים. יום הקלטה טיפוסי יניב שניים עד שלושה זוגות.הקלטות זוגיות של נוירונים מוטוריים ושריר שלד מספקות הזדמנות ייחודית לחקור את תפקודי היסוד של ההעברה הנוירו-שרירית. כאשר הן משמשות בשילוב עם שורות דגים מוטנטיים של Motility, הן יכולות להצביע על מקור התפקוד הלקוי של המערכת הנוירו-שרירית ולספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מחלות אנושיות כגון תסמונת גרורית.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מטרת סרטון זה היא להדגים הליכים לקבלת תאי שיער בריאים, ללא פגע מהאיברים הפנימיים של דג זברת האוזן בוגר ולאחר מכן להשתמש בם ללימודים מהדקים תיקון שנועדו לאפיין את מאפייני biophysical של ערוציהם מתח המגודרים.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

סרטון זה מדגים בדיקה לא פולשנית לחקר אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה. עם מדידת סליל הזנב בעוברים כתוצאה מדפולריזציה ספונטנית של הנוירונים המוטוריים של חוט השדרה, מוחל חוסם תעלות נתרן כדי להפחית את תדירות הסליל. לאחר מכן, העוברים משותקים באגרוז ומונחים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנוירונים המוטוריים המהונדסים גנטית מבטאים ביו-חיישן חישת מתח עם תורם ופלואורופור מקבל. ירידה בפליטה פלואורופורית מקבלת מצביעה על ירידה בדפולריזציה הספונטנית של נוירונים מוטוריים עקב חוסם תעלות...

גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

הצומת העצבי-שרירי של זחל דג הזברה הוא מודל אטרקטיבי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית. הוא מתאים לטכניקות ניסיוניות רבות, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה אופטית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיית שידור סינפטי באמצעות בדיקה מבוססת pHluorin תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

למדו שיטת patch clamp סימולטנית מנוירון מוטורי ושריר שלד בזברה פגית. טכניקה זו מאפשרת מדידת תגובות סינפטיות ומחקר מנגנוני העברה נוירומוסקולרית ב-Danio rerio.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

גלה סרטונים נוספים