Name: המערבי סופג: הכנת המדגם איתור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למד את טכניקת Western blotting לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימות רקמה. שיטה זו מדגימה הכנת דגימות, אלקטרופורזה והעברה לממברנה עם חשיפה לנוגדנים לתוצאות אמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. לדוגמא הכנה הצעד הראשון במערב הוא סופג הכנת המדגם. כדי להכין דוגמאות להפעלת תאים ורקמות הג&#39;ל צריך להיות lysed לשחרר את החלבונים של עניין. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוח, מוכן לשימוש מגיב כי הוא תכליתי וקל לשימוש להפקת חלבון מסיס הוא CytoBuster או PhosphoSafe. מאגרים אלה מכילים דטרגנטים מיצוי אופטימיזציה עבור מיצוי יעיל של חלבונים מסיסים מתאי יונקים חרקים. עדין לא יוניים הרכב מגיב הפקת CytoBuster חלבון מאפשר בידוד של אנדוגני פעיל מבחינה תפקודית או חלבונים הביעו ללא צורך לטיפול משני כגון sonication או הקפאה / הפשרה. PhoshoSafe יש יתרון נוסף של ובה ארבע מעכבי phosphatase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (5 דקות למשל XG ב 2500), לרוקן את תא גלולה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חלבון מגיב CytoBuster הפקת באמצעות 150 μL לכל 10 6 תאים (כמות אופטימלית של הפקת מגיב CytoBuster חלבון עשויים להשתנות לפי גודל התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור מתאים ספין דקות 5 ב XG 16,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פינה supernatant (תמצית התא) לצינור טריים להמשיך בניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת חלבונים מתמחים, אנו ממליצים להשתמש ערכות באיכות גבוהה שלנו ProteoExtract. EMD יש יותר מתריסר ערכות עבור בידוד המיטוכונדריה, מיצוי proteome subcellular, חלבון ממוצא הטרנסממברני, ועוד רבים אחרים. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD גם מוכרת מגוון רחב של פרוטאז ו מעכב phosphatase קובע קוקטייל. ברגע תמוגה מתרחשת, proteolysis dephosphorylation ו denaturation להתחיל. אירועים אלה יכולים להיות האטה מאוד אם הדגימות נשמרות על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת ומעכבי המתאימים טרי הוסיף למאגר תמוגה. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. </li></ul> 2. SDS-PAGE הצעד השני במערב סופג הפרדה חלבון. חלבונים מופרדים על בסיס משקל מולקולרי. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול לעשות ג&#39;ל בדף שלך, עם זאת אנחנו נהיה באמצעות מסחרית מראש יצוק ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת המדגם שלך, אתה מוכן לקבוע את ריכוז החלבון. EMD יש שתי ערכות עבור זה למדוד ריכוז, אחד להיות ללא התערבות Assay חלבון קיט השני להיות ערכת Assay BCA חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריכוז חלבון נבחנת אנחנו מוכנים להכין המדגם שלנו לטעינת ג&#39;ל. בדרך כלל נוגדנים להכיר חלק קטן של החלבון של עניין (המכונה epitope) לבין תחום זה עשוי לשכון בתוך קונפורמציה 3D של החלבון. כדי לאפשר גישה של הנוגדן לחלק זה יש צורך לפרוס את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל, להשתמש חיץ העמסה עם סולפט anionic denaturing נתרן dodecyl דטרגנט (SDS), ומרתיחים את התערובת על 95-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מאגר העמסה קלה ונוחה לשימוש היא הצפת לדוגמא 4X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנתיב הראשון של דה מרקר היטב עם שביל לערבב חלבון. סמן זה יש שלוש להקות התייחסות אשר מאפשרים לך לפקח אלקטרופורזה. כאשר הג&#39;ל הוא מוכתם, 10 להקות נראים הנעים 10-225 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את יחידת אלקטרופורזה עם ריצה חיץ. עבור ג&#39;לים PAGE, זה בדרך כלל טריס-1X גליצין. עבור למאגר מתכונים מפורטים, בקר בדף סופג המערבי. EMD מציעה באיכות גבוהה ריאגנטים מאגרים עם הקו שלנו כימיים OmniPur. הרץ את הג&#39;ל על 220V במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלבונים נפרדו, הכתם ג&#39;ל עם Coomassie כחול כדי להבטיח החלבונים היגרו באופן שווה ואחיד. RAPIDstain הוא Ultra-רגיש כתם שהוא מוכן לשימוש. Destaining לא נדרש. </li></ul> 3. חלבון העברה בדיוק כמו חלבונים עם מטען חשמלי יכול להיגרם לעבור דרך ג&#39;ל בשדה חשמלי, ולכן ניתן החלבונים יועברו בשדה חשמלי של הג&#39;ל על גבי קרום, להיות או PVDF או nitrocellulose. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום נעשה טרנספר רטוב. ב העברת רטוב, ג&#39;ל לבין הממברנה הם דחוקה בין ספוג ונייר (ספוג / נייר / ג&#39;ל / קרום / נייר / ספוג) וכולם היו שלובות בכוח לאחר הבטחת אין בועות אוויר נוצרו בין הג&#39;ל לבין הממברנה. כריך הוא שקוע חיץ העברה אשר שדה חשמלי מוחל. החלבונים טעונים שלילית לנסוע לכיוון האלקטרודה חיובי טעון, אבל הממברנה עוצר אותם, נקשר אליהם, ומונע מהם להמשיך הלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של קרומים זמינים: nitrocellulose ו PVDF. שניהם עובדים היטב. היום אנחנו נהיה באמצעות PVDF. ממברנות PVDF דורשים טבילה methanoאני במשך כמה דקות, ואחריו חיץ קרים להעביר במשך 5 דקות. הג&#39;ל גם צריך לאזן לכמה דקות במאגר העברת קרים כקרח. לא שהדבר עלול לכווץ את הג&#39;ל במהלך ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ להעברת רטוב הוא 1X טריס-גליצין עם מתנול 20%. ההכנות חיץ מפורט זמינים באתר האינטרנט שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה תסתיים, זה רעיון טוב כדי להמחיש חלבונים כדי להבטיח אפילו להעביר ללא כיסי אוויר. זה יכול להיעשות בקלות עם כתם המערבי RedAlert הכתם. כתם זה הוא מוכן לשימוש destaining ניתן לעשות זאת בקלות עם מים. </li></ul> 4. נוגדנים ריאגנטים אביזר <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון עושה חיטוט נוגדנים לאנטיגן היא לחסום את הממברנה. חסימת קרום מונע הלא ספציפית מחייב רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או שאינם שומן חלב או BSA יכול לשמש כפתרון חוסם. עם זאת, בעת שימוש phospho נוגדנים ספציפיים, לא מומלץ להשתמש בחלב כמו זה יגרום רקע גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD כמה הצעות באיכות גבוהה ריאגנטים חוסם, ובכלל SeaBlock, שהוא סוכן שאינם יונקים חסימת QuickBlocker כתם, שהוא מוכן, מוכן לשימוש, חסימת סוכן. יש לנו גם באיכות גבוהה BSA (שבר V) זמין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעה 1 הממברנה בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים TBST או PBST לאחר דגירה. דרך קלה ונוחה לעשות TBST או PBST היא להשתמש בטבליות שלנו (PBS טבליות tween / TBS טבליות tween) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קרום נחסם, אתה מוכן דגירה עם הנוגדן הראשוני. EMD כבר מציעה סל מוצרים מקיף של נוגדנים חריגים עם ערבות הנוגדנים הטובים ביותר בתעשייה במשך 30 שנים. זכור כי עם כל הנוגדנים EMD, אנו מציעים מלא 100% ללא סיכון ערובה. רכישה נוגדן ולהשתמש בו עבור הספציפיות לכל מין או יישום שאתה רוצה. אם הנוגדן לא עובד לשביעות רצונך, נספק אשראי מלא כדי לשמש על מוצר אחר. לפרטים נוספים, בקר בדף האינטרנט המערבי שלנו סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום נהיה דוגרים הנוגדן העיקרי שלנו באמצעות פתרון של SignalBoost 1. SignalBoost הוא מוצר נהדר המאפשר את האות להיות משופרת באופן משמעותי. פשוט דגירה הנוגדן העיקרי בפתרון 1 ו דגירה במשך שעה 1 או כרגיל. אין צורך להוסיף סוכני חסימה נוספת. לחלופין, ניתן להשתמש BSA או חלב דל שומן יבש כסוכן חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TBST. אנחנו עושים TBST באמצעות מוכנים להמיס טבליה TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדן המשני שלך באמצעות פתרון של 2 SignalBoost. דגירה נוגדנים משני חסימת חיץ במשך שעה 1. לשטוף את הממברנה שוב מספר פעמים עם TBST. </li></ol></li></ul> 5. איתור עבור נוגדנים HRP משני conjugating, ECL משמש באופן מסורתי. מגיב ECL מעולה שאנו מציעים הוא RapidStep. היתרונות של RapidStep הן כי אין ערבוב של luminal או משפר נדרשת. כל שעליך לעשות הוא לרסס את הממברנה כמה פעמים לפתח באמצעות רנטגן הסרט. RapidStep מציעה רגישות pictogram נמוך כמו גם פולטות אור עד 2 שעות לאחר תוספת של המצע.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

המחברים אנה אסלאמי וג&#39;סי Lujan מועסקים על ידי EMD כימיקלים Inc המייצרת ריאגנטים ומכשירים השתמשו בסעיף זה.

במצגת וידאו זה, יש לנו הדגיש את השלבים העיקריים במערב סופג אשר הכנת המדגם, SDS-PAGE, קרום חסימת / חיטוט עם נוגדנים, זיהוי. עבור כל שלב של התהליך, פרוטוקולים נאותה ריאגנטים המתאימים יש להשתמש כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Protein Extraction Reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Extraction Reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Non-Interfering Protein Assay&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS Sample Buffer </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Trail Mix&amp;#8482; Protein Markers</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Prote&amp;#8211;xtract&amp;#8482; Protein Extraction Kits</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Products</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X Western Blot Stain</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reagent, Salmon Plasma</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker Reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Tablets</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tablets</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Immunoreaction Enhancer Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL Reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ. היא משתמשת אלקטרופורזה בג&#39;ל להפריד חלבונים יליד מפוגל או לפי אורך של פוליפפטיד (תנאים denaturing) או על ידי מבנה 3-D של חלבון (יליד / לא denaturing תנאים). חלבונים מועברים לאחר מכן קרום (בדרך כלל nitrocellulose או PVDF), שם הם בחנו (זוהה) באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון היעד.

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

Western blotting היא טכניקה אנליטית המשמשת לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימה נתונה של הומוגנאט או תמצית רקמה. היא עושה שימוש בג'ל...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את הקלות שבה ניתן לבצע Western blot בעת שימוש במוצרים מתאימים. לאחר הכנת הדגימות, החלבונים מופרדים על בסיס גודלם ומועברים לאחר מכן לשלב מוצק. לאחר מכן, החלבונים נסרקים באמצעות נוגדנים ומזוהים; שימוש בפרוטוקולים נכונים ובריאגנטים איכותיים וכלכליים מבטיח תוצאות משופרות של western blotting.שלום, אני ג'סי לוהאן, מדען מחקר ופיתוח ב-EMD Chemicals בסן דייגו, קליפורניה. EMD היא חברה בת של Merck, KGAA בדארמשטט, גרמניה. היום נראה לכם הליך של western blotting.אם כך, נתחיל. השלב הראשון ב-western blotting הוא הכנת הדגימה. התחילו את הכנת הדגימה על ידי שקיעת התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה, כגון חמש דקות ב-2,500 ×g.לאחר הצנטריפוגציה, רוקנו את משקעי התאים. השעיקו היטב את התאים בריאגנט להפקת חלבונים מסוג cyto buster, תוך שימוש ב-150 µL ל-10⁶ תאים. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.בשלב הבא, סובב את הדגימה במשך חמש דקות ב-16,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר הצנטריפוגה. העבר את ה-SNA המרוקח למבחנה נקייה והמשך בניתוח. לאחר הערכת ריכוז החלבון בדגימה, הכן את הדגימה לטעינה אל הג'ל כדי לדנטור את החלבון.השתמשו בבופר דגימה המכיל דטרגנט דנטורציה אניוני כגון sodium dodecyl sulfate או SDS. הרתיחו את התערובת בטמפרטורה של 95 עד 100 °C למשך חמש דקות. באמצעות ג'ל יצוק (precast gel) זמין מסחרית, ניתן להפריד חלבונים במהירות על בסיס משקל מולקולרי.מלאו את יחידת האלקטרופורזה בתמיסת ריצה (running buffer), שניתן להכין מרכיבים המוצעים בקו הכימיים של Omni PU. טענו לבאר בנתיב הראשון את סמן החלבון trail mix. לסמן זה יש שלושה פסי ייחוס המאפשרים ניטור במהלך האלקטרופורזה.לאחר צביעת הג'ל, נראים 10 פסים, הנעים בין 10 ל-225 kilo Daltons. טענו את הדגימה הדנטורית לבארות שנותרו. הריצו את הג'ל במתח של 220 volts למשך שעה אחת.לאחר הפרדת החלבונים, צבע את הג'ל ב-kumasi blue כדי לוודא שהחלבונים נדדו באופן שווה ואחיד באמצעות צבע מהיר וצבע אולטרה-רגיש, שמוכן לשימוש ללא DS. הצביעה נחוצה כיוון שחלבונים בעלי מטען חשמלי יכולים להיות מונחים לנוע דרך ג'ל בשדה חשמלי, כך שניתן להעביר את החלבונים בשדה חשמלי מהג'ל אל ממбраנה כגון NITROCELLULOSE או PVDF. בעת שימוש בממברנות PVDF, השרה את הממбраנה במתנול למשך מספר דקות, ולאחר מכן בצע הרגלה בבופר העברה קר במי קרח למשך חמש דקות. השרה גם את הג'ל למשך מספר דקות בבופר העברה קר במי קרח; הרגלה זו מונעת התכווצות של הג'ל במהלך ההעברה.עבור העברה רטובה, הרכיבו "סנדוויץ'" של הג'ל והממברנה בין ספוג לנייר. לאחר מכן, הדקו את המבנה יחד בחוזקה, לאחר שווידאתם שלא נוצרו בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. טבלו את הסנדוויץ' במבuffer העברה והפעילו שדה חשמלי.החלבונים בעלי המטען השלילי ינועו לעבר האלקטרודה בעלת המטען החיובי. לאחר מכן, הממברנה תעצור אותם, תקשור אותם ותמנע מהם להמשיך הלאה. עם השלמת ההעברה, יש לבצע ויזואליזציה של החלבונים כדי לוודא שההעברה הייתה אחידה וללא בועות אוויר.ניתן לבצע זאת בקלות באמצעות צבע red alert ל-Western blot. צבע זה מוכן לשימוש וניתן להסיר אותו בקלות בעזרת מים. זהו הג'ל לאחר הסרת הצבע על ידי שטיפה במים, לפני שניתן יהיה לזהות את הממברנה באמצעות נוגדן; הממברנה נחסמת.כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את הממברנה באמצעות ריאגנטים חסמיים באיכות גבוהה. כדי למנוע רקע מוגבר, הדגירו אותה בתמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין, ולאחר ההדגרה שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-TBST או PBST. ניתן להכין באקלות ובנוחות באפרים אלו באמצעות טבליות TBS tween וטבליות PBS tween, בהתאמה.לאחר חסימת הממברנה ושטיפתה, ניתן להדגיר אותה עם הנוגדן הראשוני. יש להשתמש בנוגדן הראשוני בתמיסה אחת של signal boost, המאפשרת הגברה משמעותית של האות. הכין את הנוגדן הראשוני בתמיסה אחת והדגר את הממברנה למשך שעה אחת.אין צורך להוסיף חומרי חסימה נוספים לאחר האינקובציה. שטפו את הממברנה ב-TBST. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני, המדולל בתמיסה שתיים של signal boost, למשך שעה אחת.לבסוף, שטפו שוב את הממברנה מספר פעמים עם TBST עבור הצמדת HRP. לזיהוי נוגדנים משניים נעשה כאן באופן מסורתי שימוש בפליט אור כימי מוגבר או ECL. נעשה שימוש בערכה המהירה של ECL, שכן היא אינה דורשת ערבוב של לומינול או של מחזק (enhancer).יש להרסס את הממברנה מספר פעמים, להדגיר למשך שתי דקות, ולפתח אותה באמצעות סרט רנטגן. Rapid Step מספק רגישות נמוכה לסדר גודל של פיקוגרמים, וכן פליטה חלשה למשך עד שעתיים לאחר הוספת הסובסטרט. סממני חלבון מסוג Trail mix מאפשרים מעקב אחר חלבונים במהלך אלקטרופורזה בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים של Western blot.הגברת אות (Signal Boost) מאפשרת טווח דינמי ורגישות גבוהים יותר. לבסוף, ניתן להשיג רגישות מעולה על ידי שימוש בשלב מהיר (Rapid step) במקום ריאגנטים מסוג ECL מסורתיים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע חסימה ב-Western באופן יעיל וחסכוני באמצעות מגוון מקיף של מוצרים.זכרו כי איכות התוצאות שלכם תלויה באיכות הרכיבים שבהם תשתמשו. זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Immunoblotting (המערבי סופג) הוא assay מהיר ורגיש לגילוי ואפיון של חלבונים אשר עובד על ידי ניצול סגוליות הטמון בזיהוי אנטיגן נוגדן. וידאו זה מספק פרוטוקולים להפרדת חלבון, חלבונים סופג על ממברנות, immunoprobing, להדמיה באמצעות מצעים chromogenic או chemiluminescent.

Immunoblot ניתוח

סרטון זה מדגים טכניקת כתם נקודה כמותי, או QDB, לכימות מוחלט של חלבונים בעלי עניין בדגימת רקמה. החלבונים בדגימה משותקים על קרום הניטרוצלולוז בתוך הבארות של צלחת QDB. באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון מטרה המסומנים באנזים פרוקסידאז, מצע כימילומינסנטי מחומצן כדי לייצר אור, אשר נמדד כדי לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימה.

כתם נקודה כמותי להערכת חלבוני מטרה בליזט רקמה

הסרטון מדגים טכניקת קרישה מערבית מבוססת נורמליזציה כוללת של חלבונים לכימות ביטוי חלבון המטרה בדגימה. על ידי ניצול צביעת החלבון הכוללת של הדגימה, מבוצע ניתוח יחסימטרי כדי לקבוע את רמת הביטוי היחסי של חלבון היעד.

כתם מערבי כמותי להערכת רמות ביטוי חלבונים

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

התקדמות הכתם המערבי באמצעות פלואורסצנטיות אפשרה זיהוי של שינויים עדינים בביטוי החלבון המאפשר ניתוחים כמותיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חזקה לזיהוי מגוון חלבונים על פני מגוון מינים וסוגי רקמות. ניתנת גם אסטרטגיה להתגברות על בעיות טכניות נפוצות.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

קבוע פורמלין תצלום ופרפין המוטבע (FFPE) דגימות קליניות הם חומר רב ערך לחקירה של מחלות. כאן אנו מדגימים מדגם זרימת עבודה הכנה המאפשרת ניתוח מעמיק בproteomic של רקמת FFPE microdissected.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

למד את טכניקת Western blotting לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימות רקמה. שיטה זו מדגימה הכנת דגימות, אלקטרופורזה והעברה לממברנה עם חשיפה לנוגדנים לתוצאות אמינות.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

גלה סרטונים נוספים