המערבי סופג: הכנת המדגם איתור
14 באוקטובר 2010
המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הקלות בביצוע כתם מערבי בעת שימוש במוצרים מתאימים. לאחר הכנת הדגימה, חלבונים מופרדים על סמך גודל ולאחר מכן מועברים לשלב מוצק. לאחר מכן החלבונים נבדקים עם נוגדנים ומתגלים השימוש בפרוטוקולים מתאימים וריאגנטים איכותיים וחסכוניים מייצרים תוצאות משופרות של כתמים מערביים.
היי, אני ג'סי לוהן, מדען מומחה, ב-EMD Chemicals בסן דייגו, קליפורניה. EMD היא שלוחה של Merck, KGAA במדינת דהארם גרמניה. היום אנו הולכים להראות לכם נוהל כתמים מערביים.
אז בואו נתחיל. השלב הראשון בכתמים מערביים הוא הכנת דגימה. התחל בהכנת הדגימה על ידי גלולת התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה כגון חמש דקות בכוח הכבידה פי 2, 500
.לאחר צנטריפוגה, מסננים את כדורי התאים. ובכן השעו את התאים במגיב מיצוי חלבון מכסח ציטו באמצעות 150 מיקרוליטר לכל 10 לששת התאים. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לאחר מכן, סובב את הדגימה במשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 16,000 בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה. העבירו את ה-SNA הנקי לצינור טרי והמשיכו בניתוח. לאחר הערכת ריכוז החלבון של הדגימה, הכינו את הדגימה להעמסת הג'ל כדי לנטרל את החלבון.
השתמש במאגר לדוגמה המכיל חומר ניקוי דנטורציה אוניק כגון נתרן דויל סולפט או SDS. מרתיחים את התערובת בחום של 95 עד 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות ג'ל טרומי זמין מסחרית, ניתן להפריד במהירות חלבוני ג'ל על סמך משקל מולקולרי.
מלאו את יחידת האלקטרופורזה במאגר פועל, שניתן לייצר מריאגנטים המוצעים דרך הקו הכימי Omni PU. טען את הנתיב הראשון של הבאר עם סמן חלבון תערובת שבילים. לסמן זה שלוש רצועות ייחוס המאפשרות ניטור במהלך אלקטרופורזה.
לאחר שהג'ל מוכתם, נראות 10 רצועות, הנעות בין 10 ל-225 קילו דלטון. טען את הדגימה המפורקת לבארות הנותרות. הפעל את הג'ל על 220 וולט למשך שעה.
לאחר שהחלבונים נפרדו, צבעו את הג'ל בכחול קומאסי כדי להבטיח שהחלבונים נדדו באופן שווה ואחיד באמצעות כתם מהיר וכתם רגיש במיוחד, שמוכן לשימוש ללא DS. צביעה נדרשת בדיוק כפי שניתן לגרום לחלבונים בעלי מטען חשמלי לעבור דרך ג'ל בשדה חשמלי, כך שהחלבונים יכולים להיות מועברים בשדה חשמלי מהג'ל אל ממברנה כגון ניטרוצלולוז או PVDF. בעת שימוש בממברנות PVDF, יש להשרות את הממברנה במתנול למשך מספר דקות, ולאחר מכן שיווי משקל במאגר העברת קר כקרח למשך חמש דקות. כמו כן, יש להשרות את הג'ל למספר דקות במאגר העברה קר כקרח, שיווי משקל E מונע התכווצות של הג'ל במהלך ההעברה.
להעברה רטובה, הרכיבו כריך של הג'ל והקרום בין ספוג לנייר. לאחר מכן מהדקים את המכלול בחוזקה לאחר שווידאתם שלא נוצרו בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. טבלו את הכריך במאגר ההעברה והפעילו שדה חשמלי.
החלבונים הטעונים שלילית ינועו לעבר האלקטרודה הטעונה חיובית. לאחר מכן הממברנה עוצרת אותם, קושרת אותם ומונעת מהם להמשיך. לאחר השלמת ההעברה, דמיין חלבונים כדי להבטיח העברה אחידה ללא כיסי אוויר.
ניתן לעשות זאת בקלות עם כתם כתם מערבי אדום. כתם זה מוכן לשימוש וניתן לבצע מכתים בקלות עם מים. זהו הג'ל לאחר שנעצר על ידי שטיפה במים לפני שניתן להוכיח את הממברנה עם נוגדן, הממברנה חסומה.
כדי למנוע קשירה לא ספציפית, חסום את הממברנה עם ריאגנטים חוסמים באיכות גבוהה. כדי למנוע רקע מוגבר על ידי דגירה בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה, יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST או PBST לאחר הדגירה. ניתן לייצר את המאגרים הללו בקלות ובנוחות באמצעות טבליות TBS tween וטבליות PBS tween בהתאמה.
לאחר חסימת הממברנה ונשטפתה, ניתן לדגור אותה עם הנוגדן הראשוני. החל את הנוגדן העיקרי באמצעות תמיסה, אחת של הגברת אות, המאפשרת לשפר את האות באופן משמעותי. הכן את הנוגדן הראשוני בתמיסה אחת ודגר את הממברנה למשך שעה.
אין צורך להוסיף חומרי חסימה נוספים לאחר הדגירה. שוטפים את הממברנה עם TBST. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני המדולל בתמיסה שתיים של הגברת האות למשך שעה.
לבסוף, יש לשטוף את הממברנה שוב מספר פעמים עם TBST עבור HRP מצומד. זיהוי נוגדנים משניים על ידי כימילומינסנציה משופרת או ECL משמש כאן באופן מסורתי. נעשה שימוש בצעד המהיר של מגיב ECL מכיוון שהוא אינו דורש ערבוב של לומינול או משפר.
כל שעליך לעשות הוא לרסס את הממברנה כמה פעמים, לדגור במשך שתי דקות ולפתח אותה באמצעות סרט רנטגן. Rapid Step מציע רגישות נמוכה לפיקוגרמה כמו גם משימה קלה יותר עד שעתיים לאחר הוספת המצע. סמני חלבון Trail mix מאפשרים מעקב אחר חלבון במהלך אלקטרופורזה בהשוואה לפרוטוקולי כתמים מערביים סטנדרטיים.
Signal Boost מאפשר טווח דינמי ורגישות גדולים יותר. לבסוף, ניתן להשיג רגישות מעולה על ידי שימוש בצעד מהיר במקום ריאגנטים ECL מסורתיים. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע עיוורון מערבי ביעילות וחסכונית עם מגוון מקיף של מוצרים.
זכור שאיכות התוצאות שלך תלויה באיכות הריאגנטים שלך. זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את טכניקת ה-Western blotting, שיטה חיונית לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימות רקמה. ההליך מדגיש את החשיבות של שימוש בריאגנטים באיכות גבוהה ובפרוטוקולים נאותים להשגת תוצאות אופטימליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביוכימיה
- ניתוח חלבונים
- טכניקות אנליטיות
רקע
- בלוט Western היא טכניקה אנליטית נפוצה.
- הדבר מאפשר זיהוי וכימות של חלבונים ספציפיים.
- הטכניקה כוללת מספר שלבים, הכוללים הכנת דגימות, אלקטרופורזה של ג'ל והעברה לממברנה.
- ריאגנטים ופרוטוקולים מתאימים הם חיוניים להשגת תוצאות מוצלחות.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוצדורת ה-Western blotting.
- להדגשת חשיבות איכות הרכיבים להשגת תוצאות מהימנות.
- לספק מדריך שלב-אחר-שלב עבור חוקרים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת דגימות באמצעות סנטריפוגציה וריאגנטים למיצוי חלבונים.
- דנטורציה של חלבונים באמצעות SDS והעמסה על ג'ל.
- אלקטרופורזה להפרדת חלבונים על בסיס משקל מולקולרי.
- העברת חלבונים לממברנה ולאחר מכן סריקה באמצעות נוגדנים.
תוצאים עיקריים
- הושגה הפרדה והעברה מוצלחות של חלבונים.
- שלבי החסימה והגילוי הודגמו ביעילות.
- נצפתה רגישות גילוי מוגברת באמצעות ריאגנטים ספציפיים.
- הושגה ויזואליזציה ברורה של חלבונים באמצעות שיטות גילוי ECL.
מסקנות
- ניתן לבצע Western blotting ביעילות באמצעות הפרוטוקולים המתאימים.
- איכות הרכיבים משפיעה באופן משמעותי על התוצאות.
- טכניקה זו נותרת כלי בסיסי בניתוח חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בלוט Western היא שיטה בסיסית לזיהוי חלבונים, המהווה תשתית לתיקוף מטרות ולמחקרים מכניסטיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה.&ד. התוצרים הכמותיים והספציפיות מבוססת-הנוגדנים שלו מאפשרים הערכה בטוחה של ביטוי חלבונים, מודולציה של מסלולים ונוכחות של סממנים ביולוגיים לאורך תהליכי גילוי ומחקרים פרה-קליניים. Western blotting מהימן תומך בקבלת החלטות חזויה ובקידום פורטפוליו מותאם-סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה&ד׳
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מטרות חלבון ומרכיבי מסלול בדגימות ביולוגיות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות מועמדות באמצעות זיהוי חלבון כמותי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי אישור מודולציה של נקודות קצה מולקולריות מיועדות.
- מספק ראיות הניתנות לשחזור למעורבות המטרה (target engagement) ולספציפיות של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות מאושרות לגילוי חלבונים לצורך סריקה שלבים מאוחרים יותר (downstream) והערכת תרכובות.
- מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים ובקרות מוגדרים.
- תומך במדידה כמותית של שפע חלבונים לצורך ניתוחים השוואתיים.
- מכין פלטפורמות חסונות לסריקה ניתנת להרחבה ולשילוב נתונים בין מחקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את זיהוי החלבון לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה לצורך המשכיות תרגומית.
- מגשרת בין ממצאי הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אישור מודולציה של חלבונים במודלים רלוונטיים.
- תומכת בהתקדמות מותאמת סיכונים באמצעות אספקת נתוני חלבון כמותיים הניתנים לשחזור.
- מאפשרת תובנה מכניסטית לגבי השפעות התרכובות ומסלולים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-Western blotting משולבת החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מספקת יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות מטרות חלבון ואפקטורים במורד המסלול.
- סריקה: מספק גילוי חלבונים הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה לצורך הערכת תרכובות ואישור פגיעות (hit confirmation).
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות ואישור משקל מולקולרי לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מתאים את גילוי החלבונים למודלים של מחלות ואסטרטגיות של סממנים ביולוגיים כאשר זרימת העבודה תומכת בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה לניתוח חלבונים על פני תוכניות וצוותים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי עבודה לזיהוי חלבונים שהם סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון באמצעות אספקת נתוני חלבון חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיצוי חלבונים, אלקטרופורזה וזיהוי מבוסס נוגדנים.
- דורש גישה למכשור לאלקטרופורזה, העברה (transfer) ודימוי כימילומינצנציה.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולים, ריאגנטים ובקרות בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility).
- עשוי לדרוש התאמה של הפרוטוקולים לסוגי דגימות או למערכות מודל שונות.
- תלוי בספציפיות של הנוגדנים ובאיכות הריאגנטים לקבלת תוצאות אופטימליות.
