בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation של E16 עוברים עכברוש

שלום, שמי וויליאם טי. אני ממעבדה של סטיין בארנולד קריק. היום, אני ואחרים נדגים לכם הזרקה תוך-רחמית לעוברים של חולדה ביום העובר E 16. שלום, שמי לורה אליאס.

היום אראה לכם כיצד להכין את פיפטות המיקרו-הזרקה ולמלא אותן לצורך ההזרקות תוך-חדריות והאלקטרפורציה שנבצע היום. כמו כן, אדגים כיצד לבצע את ההזרקות תוך-החדריות ואת האלקטרפורציה בעוברים של חולדה בשלב E 16. הזרקות ואלקטרפורציה תוך-רחמיות בחולדה הן שימושיות במיוחד מכיוון שהחולדה היא מערכת שבה לא ניתן לבצע מניפולציות גנטיות בקלות.

בשלב זה, אנו משתמשים במספר כלי ניתוח לצורך הפרוצדורה. אנו משתמשים במקבץ (freer), במספר פינצטות הרמה (addin forceps) – זוג אחד משונן וזוג נוסף עם שן קטנה בקצה – ובזוג המוסטטים (hemostats).

אלו הם מספריים, ולאחר מכן אנו משתמשים בשני השדכנים הללו. זהו השדכן הגדול יותר שבו אנו משתמשים עבור חולדות. זהו השדכן הקטן יותר שבו אנו משתמשים עבור עכברים, הוא משתמש בסיכה בגודל 7, והשני משתמש בסיכה בגודל 9, ושניהם פועלים באמצעות קפיץ.

כמה מהכלים שבהם אנו משתמשים כאן כדי לסייע בניתוחים הם מקור אור סיב אופטי פשוט עם ראש כפול. אנו משתמשים בפד מחומם שזורם בו מים חמים כדי לשמור על חום. עבור משטח העבודה, אנו משתמשים במערכת אלקטרופורציה זו המיוצרת על ידי BTX.

יש לנו מספר גדלים שונים של משטחי תמיכה (paddles) שבהם אנו משתמשים בהתאם לגודל העובריים. הצד הכחול הוא הצד החיובי. טוב, עכשיו נבצע שיפוע (beveling) לפיפטות ההזרקה שלנו.

וזה חשוב מאוד כדי שהפיפטה שלך תהיה בעלת פתח רחב מספיק כך שתוכל להטעין את ה-DNA, אך גם תהיה חדה מאוד כדי שלא תפגע בעובר בזמן ההזרקה. אם תפגע בעובר בזמן ההזרקה, תהיה לך שיעור תמותה גבוה בהרבה. וזה אינו רצוי.

זהו למעשה תהליך חשוב מאוד בניתוח זה. ראשית, נניח מעט מים על אבן השיוף המסתובבת כאן. לאחר מכן ניקח, בואו נראה, פשוט מקל.

כעת נצמיד את הפ pipette שהוצאנו זה עתה למקל זה באמצעות סרט דביק. נשתמש באחד המיקרו-מניפולטורים כדי להחזיק את ה-pipette בשיפוע ולאפשר לה להישאר בשיפוע זה. נמקם זאת ונשתמש במיקרוסקופ כדי לדמיין את קצה ה-pipette.

כעת נניח אותו ישירות במים על גבי השיוף שביצענו קודם, כדי שתהיה מעט לחץ. ניתן לראות את הקצה לוחץ נגד האבן כאן. יש להמשיך בשיוף למשך זמן מה, לפחות 15 דקות.

אני אוהב להשאיר אותם כך אפילו למשך, אתם יודעים, שעה. לעיתים הן פשוט הופכות להיות ממש חדות, אבל זה בהחלט תלוי בכל אדם כמה זמן הוא משייף את הפיפטות שלו. בסדר, אז כאן יש לנו, אתם יכולים לראות למעלה, פיפטה שנמשכה שטרם שויפה.

לכן, למרות שהיא חדה, אין לה פתח דרכו ניתן להטעין את ה-DNA. כעת, הפתח של הפסלול התחתון נחתך בזווית, וניתן לראות את הפתיחה הזוויתית היפה הזו. פתח זה יאפשר לכם להטעין את ה-DNA, אך הוא עדיין בעל קצה חד כדי שתוכלו להזריק מבלי לגרום לנזק. טוב, כעת נמלא את פסלולי ההזרקה ב-DNA.

לכן חשוב להכין את ה-DNA באופן נקי מאנדוטוקסינים, כדי שלא תזריקו ליפופוליסכרידים יחד עם הזרקת ה-DNA. כעת ניקח את ה-DNA שלנו, ובשלב זה נכין את הפראפורם (paraform). עליכם להכין את הפראפורם כאן, ואז לאסוף את ה-DNA שלכם ולהניח אותו כנקודה קטנה על הפראפורם.

לאחר מכן נקח, בדרך כלל אני לוקח עבור כל 10 µL מה-DNA שלי, שבו אני משתמש בדרך כלל בריכוז של כ-1.5 עד 1.7 µg ל-µL, כ-1 µL מצבע ה-fast green. וזה נועד רק כדי לעזור לנו למקם את ההזרקה ולוודא שהזרקנו בהצלחה לתוך הventricle.

כעת אני פשוט אערבב את צבע ה-fast green עם ה-DNA שלי. לאחר מכן, קחו את אלקטרודת ההזרקה ונמלא את הפיפטה על ידי משיכה של הבוכנה לאחור. ניתן לראות כאן שאם הפיפטה תקינה ויש לה פתח רחב מספיק, ה-DNA אמור להיטען בקלות רבה.

לעיתים יש להזיז את הבוכנה קדימה ואחורה כדי לסייע בטעינה נכונה. לאחר מכן ניתן לטעון את הפפיטה באופן זה. כעת ה-DNA טעון במלואו לתוך הפפיטה והוא מוכן להזרקה.

בסדר, כעת אאלחש את בעל החיים. אנו משתמשים במכסי דק-קפי (dec capi cones). אני פשוט מקפלת מעט את השפה שלו כדי להקל על האחיזה.

אם כן, בואו נתחיל. בדרך כלל אני פשוט מניחה זאת על קצה הכלוב כדי ליצור מעין מנהרה קטנה ונעימה שהוא יוכל להיכנס אליה כך. אוקיי, נראה שהחיה הזו רגועה.

נבצע כעת צביטה בבוהן כדי לאשר זאת; יש לתפוס את הבוהן וללחוץ עליה בחוזקה. לא חזק מדי, כדי לא לפגוע בבעל החיים, אלא רק כדי לוודא שהוא במצב של הרדמה.

והחיה הזו בהחלט מורדמת. לכן אני אגש כעת לגילוח הבטן שלה. אני רק רוצה להימנע מบริเวณ הפטמות כדי שלא תגזרו את קצותיהן.

אני סבור שזה עלול להיות מאוד כואב עבור בעל החיים. לכן, בעל החיים נגלח. כעת אני אכניס אותו למנדף.

אנחנו ננקה אותה ונתחיל בפרוצדורה. אוקיי, אישרנו שהבעל חיים הזה שוב במצב של הרדמה ואנחנו מוכנים קודם כל לנקות אותה. מה שאני רוצה לעשות זה למרוח מעט משחה לעיניים, וזאת רק כדי למנוע מהעיניים שלה להתייבש, בכל עין.

לאחר מכן, נבצע שטיפה לסירוגין באמצעות פדי אלכוהול ופדי יוד. נחזור על הפעולה שלוש פעמים, בשלושה ניגובים לסירוגין. עלינו לפעול בעדינות רבה כדי לא לפגוע בעוברים בזמן ביצוע הפעולה.

אם כך, עליכם פשוט להחליק ישירות למטה, להמשיך ישר אחורה. זהו השלב הראשון. אני פשוט צריכה להרטיב אותה היטב תחילה כדי שאוכל לבצע את הניגובים. טוב.

אלה שניים ואלו שלושה. אוקיי, הנחנו את הכיסוי הזה כדי לסייע בסטריליזציה וכעת אני אגש לפתיחת בעל החיים. בואו נחתוך.

בסדר, הדבר הראשון שעלי לעשות הוא להנחית את הסטריליזציה. נלבש כפפות סטריליות ואנחנו מוכנים לפתוח כאן. תמיד יש לוודא שהבעל חיים עדיין תחת הרדמה.

לכן אבצע צביטה נוספת של בהו, ונמשיך לבצע זאת לאורך הפרוצדורה. בדרך כלל אני פשוט צובט מעט מהרקמה, מבצע חתך מהיר, תופס אותה מלמעלה וחותך כלפי מטה, תופס את זוג הפינצטות השני ומחזיק את הרקמה מופרדת.

לאחר מכן תפסו את השריר הרצוי, וגזרו בדיוק בקו האמצע כדי לא לפגוע בכלי דם או בעצבים. היזהרו לא לתפוס. נראה שיש לנו כאן תנובת טובה.

אני רוצה לוודא שהמקום נשאר משומן היטב כדי למנוע התייבשות. ואבצע סימון נוסף רק כדי להיות בטוח שהכל תקין, ונראה שהכל בסדר. אני תמיד ממקם אותם עבור לורה, ומה שאני עושה בדרך כלל, או מה שאני תמיד עושה, זה להניח את הראש כך שראש העובר נמצא בצדה הימני של החולדה האם, רק לצורך אחידות.

ואני אתחיל כעת. כאן אנו יכולים לראות את העובר. אנו יכולים לראות את הזנב ואת הגפיים האחוריות כאן, ואת הראש גבוה יותר כאן.

כאן אנו מתבוננים בראשו של עובר זה. ניתן לראות את קו האמצע כאן בקו הכהה הזה. ניתן לראות את ההמיספרה השמאלית ואת ההמיספרה הימנית, וכן את המוח האחורי.

כעת אתמקד בהזרקה להמיספירה השמאלית. אכניס את הפ pipette, אמשוך מעט ואז אזריק את הצבע. כעת ניתן לראות שהצבע מתפשט אל תוך המערה הצדית השמאלית.

וזה נראה כהזרקה מוצלחת. טוב, כעת אנו רואים שהחדרים התמלאו היטב. הצבע למעשה עבר מהחדר השמאלי לימני.

כעת יש לנו D ו-DNA בשני החדרים. בנקודה זו, אקח את אלקטרודות האלקטרופורציה ואמקם אותן לרוחב המוח, כאשר אלקטרודה חיובית תמוקם בצד שמאל. כך, ה-DNA יחדור אל התאים הפרוגניטורים ואל הדופן הקורטיקלית של ההמיספרה השמאלית.

כעת אני מעביר את הזרם. כאשר אנו מתחילים להעביר את הזרם החשמלי, ניתן לראות קצף בקצה השלילי של האלקטרודה. הדבר מעניק ביטחון ומעיד על כך שהמגעים בוצעו כראוי.

בסדר, עכשיו לאחר שביצענו אלקטרופורציה לעוברים אלו, אני אחזיר אותם פנימה ואתפר את הפצע. אני אתן לה כעת 10 mils של אנטיביוטיקה לתפרים כירורגיים. אני מעדיף להשתמש בתפרי בלוקים.

לאחר מכן, נסגור את העור באמצעות מהדק עור. בסדר? בסדר. נתתי לה מנה של buprenorphine כדי להבטיח שהיא לא תחוש בכאב כשתתעורר. וכעת אני פשוט אכניס אותה לאינקובטור שישמור על חום גופה בזמן שהיא מתעוררת, רק כדי לוודא שהיא לא תסבול מהיפותרמיה.

ובכן, הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הזרקות תוך-חדריות בעובר (in utero) ואלקטרופורציה. בחולדה ניתן להזריק מספר דברים שונים. ניתן להזריק פשוט וירוס, כולל lentivirus או retrovirus, ישירות לתוך החדר.

ובמקרה זה, לא תצטרכו לבצע אלקטרופורציה כיוון שהנגיף ישתלב בתוך התאים. אם תזריקו פלסמידים של DNA, כפי שעשינו היום, תצטרכו לבצע אלקטרופורציה כדי להחדיר את הפלסמידים לתאים המבטנים את הפרונטריקל. לפיכך, ניתן להשתמש בווקטורים אלו למספר אפשרויות.

ניתן להשתמש בהם פשוט כדי לעקוב אחר התאים ולהביע GFP, ואז ניתן לצפות בתאי פרוגניטור אלו מתחלקים ונודדים. ניתן להשתמש בווקטורים אלו גם כדי לבצע מניפולציה בתאים. כך ניתן להביע סיכות S-H-R-N-A, ובכך לבצע knockdown של גנים ספציפיים.

ניתן גם לבצע ביטוי יתר של גנים ספציפיים, ובדרך זו ניתן לתמרן את התאים שעברו אלקטרופורציה או הודבקו בנגיף. זו יכולה להיות טכניקה עוצמתית מאוד לחקר תפקידן של חלבונים ספציפיים בתהליך שבו אתם מעוניינים. הדבר חשוב במיוחד עבור מחקרים בחולדה, כיוון שלא ניתן לבצע מניפולציות גנטיות בחולדה בקלות כפי שניתן לבצע בעכבר.