פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק הכלאה גנטית של טפיל המלאריה במכרסמים plasmodium yoi במטרה ליצור צאצאים רקומביננטיים. הדבר מושג תחילה על ידי הזרקה לקבוצת עכברים של אינוקולום מעורב המכיל את שני השבטים ההוריים של הטפילים המיועדים להכלאה. עכברים נגועים משמשים לאחר מכן להאכלת פיתוחי יתושים, בתוכם יתאחו הגמטות של כל אחד מהשבטים ההוריים לזיגוטה דיפלואידית; חלוקה מייוטית בשלב זה עשויה להוביל לרקומינציה גנטית, ובכך להפיק צאצאים רקומביננטיים.

לאחר מכן אוספים את הספורוזואיטים שהתקבלו מבלוטות הרוק של היתושים ומזריקים אותם שוב לעכברי מקבל נאיביים, כדי להשיג טפילים בשלב הדם, שביניהם נמצאים קלונים רקומביננטיים בודדים שניתן לבודד באמצעות דילול מוגבל. בניסוי מוצלח, חמישה עד 10% מהשורות המשובטות יהיו רקומביננטיים, אותם ניתן לאפיין על ידי גנוטיפיקציה של סמנים גנטיים מתאימים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום מחקר המלריה, כגון מהם הגורמים הגנטיים לעמידות לתרופות וליכולת ההדבקה במלריה?

טפילים בטמפרטורת החדר עבור שתי בקבוקיות המכילות את שלב הדם הקפוא, טפילי מלריה להכלאה. בדוגמה זו, שני זני טפילי מלריה של מכרסמים שבהם נעשה שימוש הם plasmodium yoi, oi, ו-plasmodium. Yoi Nigerians השתמשו במזרק עם מחט בכישור (gauge) 22 עד 30 ושאבו 400 µL של PBS pH 7.4 באמצעות אותו מזרק.

שאבו 100 µL של דם המודבק ב-Thor, והפכו את המזרק למעלה ולמטה עד שהתוכן יתערבב באופן הומוגני. במהלך הדגמה זו, ייעשה שימוש בבעלי חיים תחת הרדמה כדי לצמצם כאב ומתח. ההרדמה מבוצעת על ידי הזרקה של 50 µL של תערובת תרופות הרדמה המכילה 82.5 mg/kg ketamine ו-7.5 mg/kg xylazine אל תוך חלל הפריטונאום של העכבר.

יש לעקוב אחר העכברים כדי לוודא את עומק ההרדמה ולמנוע תמותה. בשימוש בפרוצדורה זו, העכברים יישארו תחת הרדמה למשך 20 עד 30 דקות. לפני ההתעוררות, יש להזריק 200 µL של תמיסה המכילה טפילים ישירות לתוך הפריטונאום של העכבר.

בסיום הפעולה, השליכו את המזרק לפח פסולת חדה. באמצעות שיטה זו, הדביקו שתי עכברים בכל אחד משני זני הטפילים שביניהם מעוניינים להכליא, שלושה עד חמישה ימים לאחר ההזרקות. טפילים בשלב הדם יתפתחו בעכברים המודבקים.

גזרו את קצה זנב העכבר של עכברי התורם שהודבקו בזני הטפילים השונים באמצעות מספריים סטריליים. אספו טיפה של דם מזנב העכבר על עלית מיקרוסקופ והכינו מריחים דקים. צבעו את מריח הדם הדק בצבע guillem.

צבע Guillem SA לא יצבע תאי דם אדומים שאינם נגועים בשל היעדר גרעין בתאים אלו. צבע SAI יצבע את גרעין הטפיל בתאי דם אדומים נגועים; הטפילים, ותאי הדם האדומים, יופיעו בצורת שלבי טבעת, טרופוזואיטים, שizonts ומריטות נפרצות. ברגע שהאנמיה הנגרמת מהטפילים תגיע ל-1% עד 5% בשני העכברים, ניתן יהיה לאסוף טפילים בשלב הדם עבור זיהום של שיבובים מעורבבים.

גזרו את קצה זנב העכברים של עכברי התורמים שהודבקו בטפילים השונים. השתמשו במספריים סטריליים כפי שמתואר קודם לכן. אספו מיקרוליטר אחד של דם מזנב העכבר באמצעות קפילרה מזכוכית לתוך מיליליטר אחד של PBS סטרילי. השתמשו ב-20 מיקרוליטרים מתרחיף הדם כדי לנתח את צפיפות תאי הדם האדומים באמצעות cell ome.

השתמש במדידות של צפיפות תאי הדם האדומים וה-para כדי לדלל את דגימות הדם בתמיסת סלין-ציטראט פיזיולוגית, כך שיתקבל ריכוז של מיליון תאי דם אדומים נגועים ל-100 µL. ערבב דגימה של דם נגוע משני התורמים ביחס של אחד לאחד כדי לקבל אינוקולום של שיבוט מעורב. לאחר מכן, הזרק 100 µL מהדגימה המעורבת לתוך הפריטוניאום של כל עכבר המיועד להדבקה.

השתמשו בשני עכברים עבור הדבקות של קלון בודד כדי לאפשר אישור של העברה מוצלחת של כל זן הורי. השלבים המיניים של הטפיל, הנקראים גמטוציטים זכריים ונקביים, אמורים להתחיל להופיע בדמם של העכברים כארבעה ימים לאחר ההדבקה בנקודת זמן זו. התחילו לעקוב אחר העכברים מדי יום כדי לזהות הופעת גמטוציטים על ידי איסוף דם מהזנב כפי שתואר קודם לכן והכנת משטחי דם דקים מהזנב.

ניתן לזהות תאי זכר ונקבה הודות לנוכחות של גרנולות או פיגמנטים גדולים. הציטופלזמה של תאי זכר gato היא ורודה, בעוד שהציטופלזמה של תאי נקבה TER היא כחולה. רק תאי gato בוגרים מציגים ואקואולה גדולה.

ברגע שזוהו ציטים בוגרים בשני המינים, ניתן להשתמש בעכברים להאכלת יתושים. הזרקו 50 µL של תמיסת קטמין, קסילזין וחומר הרדמה לתוך הפריטוניאום של כל עכבר נגוע. לאחר הרדמת העכברים, הניחו עכבר אחד כשהוא פונה כלפי מטה על גבי כלוב המכיל 50 עד 100 נשיי יתושי Anis defense enzyme שהורעבו מאספקת סוכר במשך 24 שעות, ואפשרו ליתושים להאכיל במשך 30 דקות ללא הפרעה.

בצעו הרדמה הומנית של העכברים מיד לאחר תקופת ההאכלה. אם ההעברה הצליחה, תשעה ימים לאחר ההאכלה, הגמטוציטים שנספגו על ידי היתושיים יתאחו לזיגוטים דיפלואידים שיבשילו לאוסיסטים, אותם ניתן להבחין במעיกลาง של החרקים. ככל שזוהו אוסיסטים רבים יותר, כך גדלים הסיכויים שנוצרו פרזיטים רקומביננטיים.

השתמשו בשואב כדי לאסוף חמישה עד 10 פשיעות נגועות מהכלוב והעבירו אותן למכל קטן. הרדימו את הפשיעות באמצעות גז פחמן דו-חמצני והעבירו אותן לצלחת פטרי מזכוכית על קרח. יש להסיר את הזכרים, שקרנות המישוש שלהם פשפשייה באופן ניכר מאשר אלו של הנקבות.

מלאו שתי מזרקים ב-PBS והרכיבו עליהם מחטים במידה 26 gauge באורך חצי אינץ'. טפטפו כ-100 microliters של PBS ממזרק אחד על גבי למסליית זכוכית. העבירו חמש עד 10 נקבות של יתוש מורדמות אל טיפת ה-PBS והניחו את הלמסלית תחת מיקרוסקופ דיסקציה בעזרת המחטים.

הסיר את הכנפיים והרגליים של כל יתוש, ולאחר מכן אחז בחרק באזור החזה והחלק האחורי של הבטן. משוך את הגוף עד לשחרור המעי האמצעי (midgut), גוף דמוי שק לבן. נתק את המעי האמצעי והשלך את שאר הגוף במהלך ביצוע הדיסקציה.

יש לוודא כי המעיים האמצעיים נשארים לחים באמצעות ה-PBS ממחטי הניתוח. לאחר סיום הניתוח, הנח זכוכית כיסוי מעל המעיים האמצעיים. בחן את המעיים האמצעיים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 100 פעמים.

ניתן יהיה לזהות OOS כמבנים מעגליים בעלי דפנות עבות הנמצאים על פני השטח החיצוניים של המעי האמצעי. ספרו את מספר ה-OOS בכל מעי אמצעי. 17 ימים לאחר ההאכלה, ספורוזואיטים ששוחררו מה-sys אמורים היו לנדוד לבלוטות ה-SIV של היתושים, ספורוזואיטים של טפילי מלריה.

תאים דקים בצורת כישורים לאיסוף ספורוזואיטים. ראשית, הכין מבחנת איסוף באמצעות מספריים נקיים. גזור את המכסה של מבחנת einor קטנה בנפח 500 microliter.

חממו את קצהו של מחט סטרילית במידה של 19 gauge ונקבו את תחתית הפחית. מלאו שליש מהפחית בעגג זכוכית כדי ליצור מסנן. הכניסו את פחית המסנן לתוך פחית einor גדולה יותר בנפח של 1.5 milliliter.

לאחר שמערכת הסינון מוכנה, אספו והרדימו את היתושים כפי שתואר קודם לכן. בצעו הרכבה באוויר של החרקים לצורך נתיחה כפי שנעשה בעבר, והסירו את ראשי היתושים, הכנפיים, הרגליים והבטנים. רק החזה מכיל את בלוטות הרוק המอดูהות.

בעזרת פינצטה בעלת קצה דק, העבירו את התורקס לתוך הומוגנייזר בנפח 1.5 milliliter המכיל 500 microliters של PBS. בצעו הומוגניזציה לתורקס על קרח כדי לשחרר את הספורוזואיטים מבלוטות הרוק, ובעזרת פיפטת זכוכית, העבירו את ההומוגנאטים למערכת הסינון. סבבו את מבחנת הסינון בצנטריפוגה למשך 10 עד 20 שניות במהירות של 1000 rotations per minute.

לאחר סבב הצנטריפוגה של ההומוגנאטים, אספו את הנוזל העובר (flow through) באמצעות מזרק המצויד במחט בכי মাপ 22 עד 30. הזריקו 100 עד 500 microliters של תרחיף הספורוזואיטים אל תוך חלל הפריטונאום של עכבר. התחילו במעקב אחר צפיפות תאי הדם האדומים והפרסאיטים של העכברים שלושה ימים לאחר ההדבקה.

בחרו עכבר המציג 0.1 עד 1% para ושבו תאי הדם האדומים המודבקים מכילים בעיקר טפילים בודדים, שישמש כתורם להליך השיבוט. השאיבו כמות מתאימה של דם מהזנב של העכבר ב-PBS, לדללו את הדם בפתרון קר ביחס של אחד לאחד של סרום עגל ופתרון רינגר לממלקיים, כך שיתקבל ריכוז של 0.6 עד 1 תא דם אדום מודבק ל-100 µL, ואחסנו את התחליל על קרח. נקו את אתר ההזרקה בזנב באמצעות אתנול להזרקה תוך-ורידית.

הזריקו 100 µL של דם נגוע מהול לכל אחד מ-100 עכברים. באופן זה, כל עכבר בודד אמור לקבל טפיל אחד או אפס טפילים. בניסוי מוצלח, 20 עד 50% מהעכברים יראו רמת פראסיטמיה של 0.1 עד 0.5% ביום השמיני.

חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן, סננו את העכברים לנוכחות של טפילי שלב הדם על ידי בדיקת משלי דם דקים קבועים. ניתן להוציא את הגנוטיפ של צאצאים, טפיליים מההכלאה, באמצעות PCR של DNA שהופק מדגימות דם מהזנב, תוך שימוש במרקרים גנטיים על כרומוזומים שונים, כגון מיקרו-לוHיטים ופולימורפיזם של נוקליאוטיד בודד (SNPs). טפיליים שהלוקוסים הגנטיים העצמאיים שלהם נגזרים משני השיבוטים ההוריים הם שיבוטים רקומביננטיים.

ניתן להקפיא את הדם מהבעלי החיים שהודבקו בטפילים רקומביננטיים לשימוש עתידי. בניסוי מוצלח, לחמישה עד 10% מסך העכברים יהיה צאצא רקומביננטי עצמאי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הפקת תהליכים גנטיים במלריה.

טפיל בתוספת מצע yoi. שיטה זו יכולה להיות ישימה באותה מידה גם למינים אחרים של טפילים.