Name: ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למד שיטת PCR מהירה באמצעות הסעה תרמית טבעית לשכפול DNA. השיטה משתמשת בדינמיקת זרימה כאוטית לשיפור יעילות התגובה ומאיצה משמעותית את תהליך ההגברה הגנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו בהכרת תודה תודה Ragucci ט, ב ווטקינס, ס &#39;וונג, ו-B Wallek ב Lynntech, Inc לקבלת סיוע טכני דיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני למדע (NSF) תחת מענק CBET-0933688.

1. העיצוב הבסיסי של Thermocycler הסעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו צריכים לבנות מכשיר פשוט thermocycling הסעה המורכב להחלפה פלסטיק קאמרית תגובה "דיו", כי הם דחוקה בין שתי צלחות אלומיניום בטמפרטורות אשר נשלטים באופן עצמאי 7 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות הכור גלילי המוטבעים על ידי מערכי עיבוד של חורים בבלוקים פוליקרבונט, עם שילובים שונים של קוטר חור ואת עובי יריעת פלסטיק המועסקים על מנת להשיג את היבט ratios הרצוי (גובה / קוטר = h / d). שתי הגיאומטריות הכור שונים נחשבים בתוצאות שהוצגו כאן: h / d = 9: h = 15.9 מ"מ, d = 1.75 מ"מ, נפח 38.2 μL; h / d = 3: h = 6.02 מ"מ, d = 1.98 מ"מ, 18.5 μL נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח התחתון של הכור הוא מחומם באמצעות בלוק אלומיניום המכיל תנורי מחסנית interfaced עם בקר טמפרטורה microprocesser מונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמפרטורה על פני השטח העליון של הכור מוסדר באמצעות בלוק אלומיניום המחוברים אמבט מים הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה כולו צמודות זו לזו באמצעות ברגים ניילון להגביל הולכה תרמית בין גושי אלומיניום מנוגדים. </li></ol> 2. הכנה טוען של התגובה התערובת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת אופיינית 100 תגובה μL מכיל 10 μL של פתרון חיץ 10x, 6 μL של 25 מ"מ MgCl 2, 10 μL של dNTPs (2 mM כל אחת), 41.2 μL של די מים, 10 μL של β-אקטין בדיקה, 10 μL של β פריימר-אקטין קדימה, 10 μL של פריימר β-אקטין הפוך, 2 μL של תבנית ה-DNA האנושי גנומית (10 ng / μL) ו 0.8 μL של פולימראז הדנ"א KOD (2.5 יחידות / μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת ריאגנטים, לאטום את המשטח התחתון של החדר PCR באמצעות שכבה דקה של סרט אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבארות הכור עם פתרון / 10 מ"ג למ"ל מימית של אלבומין בסרום שור ואחריו גשם וערפל-X-Anti. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים פיפטה לתוך בארות הכור באמצעות ג'ל טעינה ארוך טיפים פיפטה ו לאטום את השטח העליון עם סרט טפלון FEP. </li></ol> 3. ריצה את התגובה Thermocycler הסעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התגובה, מחממים שתי קוביות אלומיניום עם טמפרטורות פני השטח הרצוי העליון והתחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנדוויץ הכור פלסטיק עמוסות PCR ריאגנטים בין גושי חימום אלומיניום, במהירות מהדק את מכלול יחד באמצעות ברגים ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה יש המשיך בפעם הרצוי, כבה את תנורי ומקום התחתון (חם) משטח של המכשיר על גבי בלוק מתכת צונן במהירות לקרר אותו ולהפסיק את זרימת הסעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכור פלסטיק פיפטה את המוצרים מתוך הבארות (באמצעות טעינת טיפים ארוך ג'ל) לניתוח שלאחר מכן. </li></ol> 4. ביצוע ניתוח ג'ל אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 wt% agarose ג'ל על ידי חימום של 10 גרם agarose עם 500 מ"ל של חיץ 1x על פלטה חשמלית ערבוב עד לפתרון מתבהרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הג'ל agarose למגש הליהוק והכנס את המסרק. תן סט ג'ל למשך 30 דקות ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק ולהוסיף חיץ 1x טה עד ג'ל הוא שקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescently דגימות DNA מוכתם להכיל 2 μL 100x SYBR גרין פתרון אני, 2 דגימת DNA μL, 2 דיי μL 6x אורנג' טוען, ו 4 μL חיץ טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את דגימות ה-DNA לתוך בארות ולהפעיל את ההפרדה V עבור 60 שעות 1 עם סמן 100 נ"ב סולם הדנ"א לשינוי גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג'ל ולצלם אותו תחת אור UV כדי להשיג את התוצאה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: עיצוב אופטימאלי של thermocyclers הסעה כרוך בבחירת הגיאומטריה הכור נכונה כי יפיק זרימת הדם מסוגל להעביר באמצעות ריאגנטים הטמפרטורות מפתח המעורבים בתהליך PCR. פרמטרים גיאומטריים כי יכולים להיות מגוונים של כורים גלילי נחשב כאן הם גובה (ח) ואת קוטר (ד), או שקול את יחס הממדים (ח / ד). אנו בחנו את 3-D שדות זרימה הסעה בתוך כורים PCR על פני טווח של היבט ratios שונים באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית (CFD), ומצאו כי תבניות מורכבות בלתי צפוי יכול להתעורר. יתרה מכך, הניתוח שלנו חשף משנה של שדות אלה זרימה מורכבים להאיץ באופן משמעותי את התגובה 12. תופעות אלה גיאומטריות ניתן לראות בבירור על ידי השוואת שדות זרימה בכורים על היבט ratios גבוה ונמוך. בכל מקרה היבט יחס גבוה (ח / d = 9; צילינדר גבוה ורזה), הם האלמנטים נוזל advected לאורך מסלולי התחקות את השבילים כי הם בעצם לולאות סגורות, והם נעולים, כדי לעקוב אחר נתיבי אותו לתקופות ארוכות זמן (איור 3a). כתוצאה מכך, יש הזדמנות קטנה החליפין בין fמסלולים נמוכים החושפים ריאגנטים רצף אופטימלי של התנאים תרמית PCR (נדנוד בין חישול denaturing הקצוות על משטחים העליון והתחתון של כור) ואת ההרכב הרבה יותר גדול של מסלולים הנותרים שאינם תורמים הגברה (מקומי קרוב למרכז הכור). שדה זרימה שונה בהרבה ביחס היבט קטן (ח / d = 3; קצר, גליל רחב יותר), הופך כאוטי יותר במובן זה מסלולי אלמנט נוזל כבר לא פעל נתיבים סגורים (איור 3 ב). כך, על אף ריאגנטים כפופים פרופיל הטמפרטורה מורכבים יותר, אלמנטים נוזל מסוגלים לבחון מגוון רחב יותר של מסלולים, כך יותר של נפח מגיב יש הזדמנות לחוות פרופילים תרמית אופטימלית. תוצאות אלו counterintuitively מראים כי בעוד מסלולי זרימת הפרט h / d = 9 עשוי להיראות חיובי יותר עבור ה-PCR על ידי ייצור פרופילי טמפרטורה כי "המראה" דומים לאלה המועסקים thermocycler קונבנציונלית, האופי הכאוטי של שדה הזרימה ב h / d = 3 בסופו של דבר שולטת בקנה מידה עולמי על ידי קידום חילופי משופר, כך ריאגנטים לא להיות לכודים מסלולי שלילי למשך זמן רב. כדי לבחון סברה זו ולקבוע אילו הגיאומטריה הכור היה נוח יותר עבור ה-PCR, השתמשנו שניהם לבצע שכפול PCR מטרה 295 נ"ב הקשורים הגן β-אקטין מ תבנית ה-DNA האנושי גנומית. למרבה הפלא, אנו שגרתי להשיג הגברה של המוצר היעד הנכון רק 10 דקות בכל שעה / d = 3 (תרשים 4 א), ואילו את אותה התגובה הנדרשת לפחות 20 דקות לפני מוצרים לזיהוי נצפו ב h / d = 9 (איור 4 ב) . סגוליות התגובה היא גם הרבה יותר על h / d = 3 שם מוצר בודד PCR מתקבל, בעוד מוצרים ספציפיים מרובים נוצרות h / d = 9 שם בשדה זרימה מלכודות אלמנטים נוזל מסלולי תרמית שלילי במשך פרקי זמן ארוכים. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הסעה תרמית בתא גלילי אשר העליון והתחתון משטחים נשמרים בטמפרטורות קבועות שונות. אם הטמפרטורה על פני השטח התחתון גבוה יותר מאשר בחלק העליון, שיפוע צפיפות אנכי הוא הוקם בתוך הנוזל סגורה כי היא מסוגלת לייצר דפוס זרימת הדם. עם הבחירה הימני של פרמטרים גיאומטריים (גובה h ו בקוטר ד), בשדה זרימה הסעה ניתן לרתום להניע thermocycling PCR כאשר משטחים העליון והתחתון הם manintained ליד חישול denaturing בטמפרטורות, בהתאמה (כוח הכבידה פועל אנכית כלפי מטה). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. (א) רכיבי מפתח של זרימה הסעה PCR thermocyler. מחסנית הכור מורכב בלוק פוליקרבונט המכיל מערך של תאים גליליים. הבלוק היא דחוקה בין צלחת העליון נועד להיות מחובר אמבט מים במחזור וצלחת תחתית שילוב תנורי מוטבע. (ב) ריאגנטים PCR נטענים וחתום בתוך המחסנית הכור, שלאחריו ההתקן מורכב כדי לבצע את התגובה. בסיום, procucts ניתן pipetted בקלות החוצה לניתוח שלאחר מכן. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. סימולציות חישוביות של 3-D שדות זרימה הסעה שנוצר בתוך כורים גלילי עם טמפרטורות של 53 ו - 96 ° C הוטל על משטחים עליונים ותחתונים, בהתאמה. תוצאות מוצגים היבט ratios של (א) h / d = 9 (38.2 נפח הכור μL) ו (ב) h / d = 3 (18.5 נפח הכור μL). מסלול נציג ואחריו אלמנט נוזל נסיעה דרך שדה זרימה 3D מוצג בקצה השמאלי יחד עם תחזיות להציג העליונה ואת הצד של הנתיב, את העלילה המקביל הטמפרטורה לעומת פעם הבאה אלמנט נוזל מוצגת בחלק הימני. פרופיל תרמית על h / d = 9 מופיע קרוב לזה של thermocycler קונבנציונלית, אבל בשדה זרימה כאוטית ב h / d = 3 הוא counterintuitively יותר נוחים PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. שכפול הדנ"א התוצאות שהתקבלו ב הגיאומטריות הכור שמוצג באיור 3 (העליון והתחתון משטחים נשמרו על 53 ו - 96 ° C, בהתאמה). (א) PCR מואץ מאוד ב h / d = 3, ברור לפי מוצרים חזק לעין לאחר 10 דקות בלבד של זמן תגובה (מ: 100 סולם bp, 1-4 נתיבים: מוצרים מן התגובות מקביל 4 חדרים גלילי שונים). (ב h / d = 9 דורש לפחות 20 דקות לפני מוצרי לעין הם נצפו, להקות מרובות שכפול המציין ניכר של ה-DNA הלא ספציפית יעד נוסף על המוצר הרצוי (מ: 100 סולם נ"ב, 1-2 נתיבים: מוצרים תגובות מקביל 2 חדרי גלילי שונים).

<ol><li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpitzack%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).</li>
<li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+in+a+Rayleigh-B%C3%A9nard+convection+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li>
<li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li>
<li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosiphon-based+PCR+reactor%3A+experiment+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li>
<li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li>
<li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li>
<li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation+%28JALA%29%22%5BJournal%5D)">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li>
<li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micro-Nanolithography+MEMS+and+MOEMS%22%5BJournal%5D)">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li>
<li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li>
<li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems%3A+A+convection-diffusion-reaction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Europhysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li>
<li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li>
<li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יחסי הגומלין בין זרימה תגובה כימית יכול לשנות באופן דרמטי תחת השפעת advection כאוטי. אבל אלה מדינות זרימה מורכבים מאתגרת ללמוד, במיוחד הגיאומטריות מציאותי שבו אפקטים 3D הופכים לחשובים. ריילי, ברנארד הסעה ב h / d&gt; 1 לא רק מספק פלטפורמה נוחה כדי לחקור תופעות אלה, היישום שלהם לבצע PCR גם מאפשרת צימוד בין תגובות כימיות זרימה להיות נחקר. יכולת ייחודית זו מאפשרת לבחור מצבי זרימה אופטימלי שבו לפעול תופעות כאוטיות (counterintuitively) כדי להאיץ את קצב שכפול הדנ&quot;א.

<table><tbody><tr><td>ערכת KOD DNA Polymerase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan &amp;#946;ערכה לבדיקת ריאגנטים לבקרת $\beta$-actin</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>סרט אלומיניום</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין משרת בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Fog</td><td>מוצרי SOPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טיפים ארוכים לפיפט להטענת ג'ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>סרט Teflon מסוג FEP</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אגרוז</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>בופר הרצה TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינה כתום 6x</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA של 100 bp למדידת גודל</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

ראפיד pcr thermocycling באמצעות הסעה תרמית microscale

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

רבים מבחני ביולוגיה מולקולרית תלויים בדרך כלשהי על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) כדי להגביר את ה-DNA לדלל בתחילה מדגם היעד לרמה ריכוז לזיהוי. אבל העיצוב של חומרה PCR קונבנציונאלי thermocycling, המבוססת בעיקר על חימום מסיבי גושי מתכת אשר הטמפרטורה מווסתת על ידי חימום Thermoelectric, מגביל מאוד את מהירות התגובה השגה 1. חשמל ניכרת נדרש גם שוב ושוב חום לקרר את התערובת מגיב, להגביל את היכולת לפרוס אלה מכשירים בפורמט נייד. הסעה תרמית התפתחה גישה חלופית thermocycling מבטיח כי יש את הפוטנציאל להתגבר על המגבלות האלה 2-9. זורם הסעה הם אירוע יומיומי במערך רחב של הגדרות, החל האטמוספרה של כדור הארץ, האוקיינוסים, פנים, מנורות לבה דקורטיבי וצבעוני. נוזל בתנועה היא יזמה באותה דרך בכל מקרה: אי יציבות הציפה מונע מתעוררת כאשר נפח מוגבל של נוזל נתונה מפל הטמפרטורה מרחבית. אלה תופעות אותו מציעים דרך אטרקטיבית לבצע thermocycling PCR. על ידי יישום הדרגתי בטמפרטורה סטטית לאורך הגיאומטריה הכור תוכנן כראוי, זרימת הדם רציפה ניתן לקבוע כי יהיה שוב ושוב תחבורה ריאגנטים PCR דרך אזורי טמפרטורה הקשורים denaturing, חישול, ובשלבים הרחבה של התגובה (איור 1). Thermocycling ולכן ניתן actuated באופן פסאודו מקורר באופן איזוטרמי פשוט על ידי החזקת שני משטחים מנוגדים בטמפרטורה קבועה, לחלוטין ומבטל את הצורך שוב ושוב חום לקרר את המכשיר. אחד האתגרים המרכזיים הניצבים בפני העיצוב של thermocyclers הסעה הוא הצורך לשלוט במדויק את מהירות מרחבית הפצות הטמפרטורה בתוך הכור על מנת להבטיח כי ריאגנטים ברצף לכבוש את אזורי טמפרטורה נכונה לתקופה מספיק זמן 10,11. כאן אנו מתארים את התוצאות של מאמצינו כדי לבחון את מהירות מלא 3-D ו הפצות הטמפרטורה thermocyclers הסעה microscale 12. במפתיע, גילינו קבוצת משנה של מסלולי זרימת מורכבים הם נוחים מאוד עבור ה-PCR עקב שילוב סינרגיסטי של חילופי (1) רציפה בין שבילי זרימה מספקת הזדמנות משופרת עבור ריאגנטים לטעום מגוון רחב של פרופילים טמפרטורה אופטימלית, ו ( 2) זמן גדל ובילה את הטמפרטורה בתוך אזור הרחבה שיעור הגבלת הצעד של ה-PCR. מאוד מהיר הגברה DNA פעמים (לפי 10 דקות) הם ברי השגה בכורים נועד ליצור זרמים אלה.

אנו מתארים שיטה חדשה לבצע שכפול הדנ&quot;א באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR). הסעה תרמית היא רתומה ריאגנטים מעבורת ברציפות בין denaturing, חישול, ותנאי הרחבה על ידי שמירה על משטחים מנוגדים של הכור בטמפרטורה קבועה. זהו עיצוב פשוט מטבעו מבטיח לעשות PCR מהיר יותר נגיש.

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

בדיקות ביולוגיה מולקולרית רבות נשענות בדרך זו או אחרת על תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) כדי להגביר דגימה ראשונית מדוללת של DNA מטרה לרמה שניתן לזהותה...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ניתן ליישם את עיקרון ה-PCR Thermocycling באמצעות קונבקציה תרמית להרצת תגובה בפועל. דבר זה מושג תחילה על ידי הצגת הרעיון של אופן הפעולה של thermocycling באמצעות קונבקציה טבעית, יחד עם עקרונות התכנון הבסיסיים. השלב השני של ההליך הוא להראות כיצד להכין את מחסנית הריאקטור ולהטעין לתוכה את הריאגנטים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הרכבת מחסנית הריאקטור ביחידת החימום והרצת התגובה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הוצאת הריאגנטים לאחר התגובה ובדיקת התוצאות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שחזור מהיר של DNA באמצעות מחזורי תרמי של PCR המבוססים על קונבקציה טבעית.שלום, אני Radha OU ממעבדת UGAs באוניברסיטת Texas A&M. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע מחזורי תרמיים (Thermocycling) מהירים של PCR באמצעות קונבקציה טבעית, בדומה למנורת לבה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את התכנון והאופטימיזציה של התקני מחזור תרמי המנצלים עיקרון זה.אם כן, נתחיל. פרוטוקול זה מתחיל בתכנון ובבנייה של התקן פשוט למחזורי תרמו-קונווקטיביים. ההתקן המשמש להדגמה זו מורכב ממחסניות פלסטיק להחלפה של תאי תגובה, אשר מוצבות בין שתי לוחות אלומיניום שטמפרטורתם נשלטת באופן עצמאי.בארות ריאקטור גליליות הוטמעו באמצעות עיבוד שבבי של מערכי חורים בבלוקים מפוליקרבונט, תוך שימוש בשילובים שונים של קוטר כולל ועובי לוח הפלסטיק כדי להשיג את יחסי הגובה-לקוטר הרצויים. תכנון אופטימלי כולל בחירה בגיאומטריה נכונה של הריאקטור, שתייצר זרימה מחזורית המסוגלת להעביר ריאגנטים דרך הטמפרטורות המרכזיות המעורבות בתהליך ה-PCR. הפרמטרים הגיאומטריים שניתן לשנות בריאקטורים הגליליים הנדונים כאן הם הגובה והקוטר, או באופן שקול, יחס הגובה-לקוטר.את המשטח התחתון של הריאקטור מחממים באמצעות בלוק אלומיניום המכיל גופי חימום מסוג cartridge המחוברים לבקר טמפרטורה המונחה על ידי מיקרומעבד. הטמפרטורה במשטח העליון של הריאקטור מבוקרת באמצעות בלוק אלומיניום המחובר לאמבט מים עם סירקולציה. את כל המכלול מהדקים יחד באמצעות ברגי ניילון כדי להגביל את ההולכה התרמית בין בלוקי האלומיניום הנגדיים.הכינו כל תגובת PCR של 100 µL על ידי ערבוב של תמיסת באפר 10x, Magnesium chloride בריכוז 25 mM, שני dNTPs, מים מזוקקים, פרוב beta actin, פריימר קדמי (forward primer) ופריימר אחורי (reverse primer), DNA תבנית גנומית אנושית ו-K-O-D DNA polymerase. לפני טעינת הרכיבים, אטמו את המשטח התחתון של תא ה-PCR באמצעות רצועת דבק אלומיניום דקה, שטפו את בארי הריאקטור עם תמיסה מימית של bovine serum albumin בריכוז 10 mg/mL, ולאחר מכן השתמשו ב-Rain-X anti-fog. לבסוף, העבירו את הרכיבים לבארי הריאקטור באמצעות טיפים לטעינת ג'ל ואטמו את המשטח העליון באמצעות סרט Teflon FEP.לפני תחילת התגובה, חממו מראש את שני בלוקי האלומיניום לטמפרטורות הרצויות של המשטח העליון והתחתון. מקמו את הכור הפלסטי, שטעון בריאגנטים ל-PCR, בין בלוקי חימום האלומיניום והדקו במהירות את המכלול באמצעות ברגי ניילון. לאחר שהתגובה התקדמה למשך הזמן הרצוי, כבו את המחממים והניחו את המשטח התחתון המחומם של המכשיר על גבי בלוק מתכת מקורר כדי לקירור מהיר ולעצירת הזרימה הקונבקטיבית.הסר את הכור הפלסטי ושאב בעזרת פיפטה את התוצרים מהבארות לצורך אנליזה בהמשך. הכן ג'ל agarose בריכוז 2% על ידי חימום של 10 גרם agarose עם 500 מיליליטר של באפר בריכוז 1x על פלטת חימום עם בוחש, עד שהתמיסה תהפוך לשקופה. מזוג את ג'ל ה-agarose לתבנית היציקה והכנס את המסרק.הניחו לג'ל להת굳ד למשך כ-30 דקות. הוציאו את המסרק והוסיפו באפר TAE בריכוז 1x עד שהג'ל יהיה שקוע. הכינו דגימות DNA צבועות פלואורסצנטית עם 2 µL של Cyber Green בריכוז 100x.ערבב שני מיקרוליטרים של דגימת DNA, שני מיקרוליטרים של צבע טעינה כתום בריכוז פי 6 וארבעה מיקרוליטרים של באפר TAE. טען את סולם DNA בעל 100 base pair לשם קביעת גודל ואת דגימות ה-DNA לתוך בארי הג'ל. הפרד את ה-DNA על ידי הרצת הג'ל במתח של 60 volts למשך שעה אחת.הוצא את הג'ל וצלם אותו תחת אור UV כדי לקבל את התוצאה. שדות זרימה בתלת-ממד בתוך ריאקטורי PCR קונבקטיביים נבחנו על פני טווח של יחסי גובה-רוחב שונים באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית או CFD. נתונים אלו חשפו כי עלולים להיווצר תבניות מורכבות, וכי תת-קבוצה של שדות זרימה מורכבים אלו יכולה להאיץ את התגובה באופן משמעותי.ניתן לראות בבירור השפעות גיאומטריות אלו על ידי השוואת שדות הזרימה בריאקטורים בעלי יחס גובה-רוחב נמוך לעומת ריאקטורים בעלי יחס גובה-רוחב גבוה. אלמנטים של נוזל מושפעים לאורך מסלולים, המשרטטים נתיבים שהם למעשה לולאות סגורות ונשארים כלואים בהם לאורך פרקי זמן ממושכים. כתוצאה מכך, ישנן מעט הזדמנויות לחליפין בין מסלולי זרימה החושפים את הריאגנטים לרצף האופטימלי של תנאים תרמיים עבור PCR לבין המכלול הגדול בהרבה של שאר המסלולים שאינם תורמים להגברה.שדה הזרימה שונה בהרבה ביחס היבט קטן יותר. שדה הזרימה כאוטי יותר, בכך שמסלולי אלמנטי הנוזל אינם עוקבים עוד אחר נתיבים סגורים. למרות שהתגובות כפופות לפרופיל טמפרטורה מורכב יותר, אלמנטי הנוזל מסוגלים לחקור טווח רחב בהרבה של מסלולים, כך שלנפח גדול יותר של הריאגנט יש הזדמנות לחוות פרופילים תרמיים אופטימליים.תוצאות אלו מרמזות כי בעוד שמסלולי זרימה בודדים ב-H over D השווה ל-9 עשויים להיראות נוחים יותר עבור PCR, בכך שהם מייצרים פרופילים טמפרטורתיים הדומים לאלו המשמשים בתרמוסייקלר קונבנציונלי, אופי הזרימה הכאוטי ב-HOD השווה ל-3 שולט בסופו של דבר בקנה מידה גלובלי על ידי קידום חילוף מוגבר, כך שהריאגנטים אינם נלכדים במסלולים לא נוחים למשך זמן רב. כדי לבחון השערה זו ולקבוע איזו גאומטריית ריאקטור הייתה נוחה יותר עבור PCR, שני הגלילים שימשו לביצוע שכפול PCR של רצף מטרה בן 295 base pair הקשור לגן beta actin מתוך תבנית DNA גנומי אנושי; הגברה של תוצר המטרה הנכון הושגה שוב ושוב בתוך 10 דקות בלבד ב-H over D השווה ל-3.לעומת זאת, אותה תגובה דרשה לפחות 20 דקות לפני שנצפו תוצרים ניתנים לגילוי ב-H over D השווה לתשעה. סגוליות התגובה גבוהה הרבה יותר גם ב-H over D השווה לשלוש, שבו מתקבל תוצר PCR בודד. זאת בניגוד למצב שבו נוצרים מספר תוצרים לא ספציפיים ב-H over D השווה לתשעה, שבו שדה הזרימה לוכד אלמנטים של נוזל במסלולים תרמיים לא מיטביים למשך פרקי זמן ממושכים.הראינו לכם כיצד להריץ תגובת PCR באמצעות Thermocycler בעל זרימה קונבקטיבית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאטום את הריאגנטים בתוך תא הריאקטור ללא השארת בועות אוויר. בועות אלו יפריעו לשדה הזרימה בפנים ויעכבו את התגובה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

PCR התפתחה טכניקה נפוצה הרבה מעבדות ביולוגיה מולקולרית. בתנאי הנה מדריך מהיר קונבנציונאלי פרוטוקולים מספר ה-PCR. כי כל תגובה היא ניסוי ייחודי, תנאים אופטימליים הנדרשים כדי לייצר מוצר להשתנות. הבנת המשתנים התגובה יהיה מאוד לשפר את יעילות לפתרון בעיות, ובכך להגדיל את הסיכוי להשיג את התוצאה הרצויה.

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

ההגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) היא assay במבחנה לחקר גיור פריון ומחסומי מתח ומינים. זה גם יכול לשמש כבדיקת גילוי פריונים.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Pyrosequencing הוא טכניקה תכליתית המאפשרת רצף הגנום של חיידקים שיכולים לשמש לזיהוי מיני חיידקים, להפלות זני חיידקים, וכדי לזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאלי. בסרטון הזה, ההליך לייצור חיידקי amplicon, pyrosequencing amplicon, וניתוח רצף ה-DNA יהיה הפגין.

Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.

הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית

Genotyping המלא של מדגם זנב עכבר, כולל עיכול רקמות readout PCR, נעשה באחת וחצי שעות באמצעות SYBR Sigma גרין חלץ-N-Amp רקמות PCR הערכה.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

QPCR הביטוי Solaris מבחני ג'ין הם הרומן תוכנן מראש פריימר / בדיקה qPCR שילובים שנועדו לפשט את תהליך qPCR מבלי להקריב את הספציפיות וחוסנם של assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

למד שיטת PCR מהירה באמצעות הסעה תרמית טבעית לשכפול DNA. השיטה משתמשת בדינמיקת זרימה כאוטית לשיפור יעילות התגובה ומאיצה משמעותית את תהליך ההגברה הגנטית.

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

גלה סרטונים נוספים