הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית
26 בינואר 2011
מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט תגובות עוררויות לאור מתאי גנגליוניים מסומנים גנטית ברשתית מבודדת של עכבר. הדבר מבוצע תחילה על ידי דיסקציה של הרשתית מעין העכבר. השלב השני של הפרוצדורה הוא טיפול ברשתית באמצעות אנזים להסרת שאריות הוויטריאום.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קיבוע הרשתית כאשר צד תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה בתא ההקלטה, קיבוע התא על במה המיקרוסקופ, וזיהוי תאי הגנגליון המסומנים גנטית. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע הקלטת תא שלם (whole cell recording) של תא הגנגליון שזוהה והקלטת תגובות המושרות על ידי אור. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התכונות התפקודיות של סוג מוגדר של תא גנגליון ברשתית העכבר, ולהגדיר את האותות שהוא מעביר למוח באמצעות הקלטות patch clamp של תא בודד.
שלום, שמי טיפאני שמידט ואני סטודנטית לתואר שני במדעי העצבים במעבדתו של ד"ר פאולו קה פוג'י באוניברסיטת מינסוטה. טכניקה זו מאפשרת זיהוי והקלטה מאוכלוסייה מוגדרת ומסומנת גנטית של תאי גנגליון, וביצוע אנליזה מורפולוגית לאחר מכן. טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום השדה הוויזואלי, כגון האופן שבו תתי-סוגים שונים של תאי גנגליון מעבדים מאפיינים מרכזיים של גירויים חזותיים לפני ביצוע הניתוח.
כדי להוציא את הרשתית, המשימה הראשונה היא להכין שמונה תמיסות הדרושות לניסוי. הרכיבים לכל התמיסות המשמשות בניסוי זה מופיעים בטקסט הנלווה. העבירו 200 milliliters של התמיסה החוץ-תאית לכלי חלה (beaker) בנפח של 250 milliliters לאחסון הרשתית.
העבר את תמיסת החוץ שנותרה למשפך הפרדה לצורך perfusion בכוח הכבידה במהלך ההקלטה. יש לשמור על שתי תמיסות אלו רוויות ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide בכל עת. כדי להדגים את הדנדריטים במהלך הניסוי, הוסף סמן פלואורסצנטי כגון LOR 5 94 לתמיסת הפנים.
אם אתם מתכננים לבצע אימונוהיסטוכימיה לאחר הקלטת תא שלם, הוסיפו 0.3% neuro biotin לתמיסה התוך-תאית. לאחר הכנת התמיסות הדרושות, בצעו המתנסה לעכבר באמצעות חנק בבידוד פחמי dióxido, הוציאו את גלגל העין על ידי הכנסה עדינה של פינצטה זוויתית מספר 2 מאחורי העין והרמה של גלגל העין. השתמשו במספרי עיניים כדי להסיר את השרירים החוץ-עיניים ולחתוך את העצב האופטי.
הניחו את גלגל העין בצלחת פטרי של 35 מילימטר הממולאת בתמיסה חוץ-תאית. גזרו את הקרנית באמצעות מספריים Oftalmologic ושלפו את העדשה בעזרת פינצטה מספר 5. השתמשו בפינצטה מספר 5 כדי לקרוע את הסקלרה ולנתק את שארית העצב האופטי בנקודת המפגש בין הרשתית לסקלרה.
משכו בעדינות את הרשתית הרחק מכוס העין על ידי העברת הפינצטה במרווח שבין הרשתית לסקלרה. כדי לחסוך בזמן, בצעו כל שלב בשתי הרשתיות. לפני המעבר לשלב הבא, שלב קריטי הוא הסרת הוויטריאום הדבוק לרשתית. התחילו בשימוש בפינצטה לתפיסת הוויטריאום השקוף שמעל הרשתית.
אם הזגוגית הוסרה בהצלחה, תראו חומר ג'לטיני שקוף וקטן על קצה הפינצטה. חתכו כל רשתית לשניים כדי למקסם את כמות הרקמה השמישה ולסייע בהצבת הרשתית בתא ההקלטה. הניחו את הרשתית בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת בטמפרטורת החדר; אם תמזערו את החשיפה לאור ותאפשרו רק אור סביבתי מינימלי, כגון אור ממסכי מחשב, הרשתית תישאר חיונית למשך כשש שעות.
לאחר הנתיחה, קחו 500 µL של התמיסה החוץ-תאית מהתמיסה שבה הרשתיות נמצאות בבעבוע. דללו לתוכה אליקוט של תמיסת האנזימים קולגנאז היאלורונידאז.
העבירו את תמיסת האנזים לצלוחית פטרי בקוטר 35 מילימטר והעבירו אחת מהרשתיות שבוצעו בהן דיסקציה אל תוך הצלוחית. סובבו את צלוחית הפטרי במשך 15 דקות תוך כדי הזרמה עדינה ומתמדת של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide אל תוך התמיסה. תמיסת האנזים מסירה שאריות של גוף הזכוכית ומאפשרת גישה קלה יותר לשכבת תאי הגנגליון. עבור רשתיות מבעלי חיים צעירים יותר עם פחות גוף זכוכית, או אם נצפו השפעות לוואי, ניתן לקצר את זמן העיכול לחמש דקות.
השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק שקצהה גזור. הוציאו את הרשתית מהתווך המכיל את האנזים. שטפו את הרשתית ביסודיות בתמיסה חוץ-תאית.
העבירו את הרשתית לתא ההקלטה. כאשר שכבת הפוטורצפטורים פונה כלפי מטה, ספגו כל נוזל שנותר באמצעות פיפטה או נייר סופג, וגלגלו את דפנות הרשתית כדי לשטח את הרקמה. היזהרו לגעת רק בקצוות הרשתית ולא בשכבת תאי הגנגליון.
כדי לקבע את הרשתית, הניחו טבעת פלטינה עם רשת ניילון מעל הרשתית, ולאחר מכן מלאו מיד את התא בתמיסה חוץ-תאית. התקינו את תא ההקלטה על במה המיקרוסקופ ולאחר מכן חברו את הצינור לביצוע פרפוזיה בכבידה של התמיסה החוץ-תאית, את צינור השאיבה בואקום ואת חוט ההארקה. כווןו את הגובה כך שהנוזל יטפטף בקצב של 1 mL לדקה או מהר יותר.
אם קצב הפרפוזיה איטי מדי, הרקמה לא תחבלס בחמצן מספיק ואיתות סינפטי עלול להיפגע. השלב הבא הוא הכנת האלקטרודה להקלטת patch של תא שלם (whole cell patch recording). בחרו פיפט עם התנגדות בטווח של שלושה עד חמישה מגה-אוהם.
מלאו את פיפט ההקלטה עם מנה שהופשרה של תמיסה תוך-תאית והכניסו אותה למחזיק הפיפטות באמצעות תאורת אינפרה-אדום ואופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) תחת עדשה של 10x. הדמיעו את הרשתית ואת פיפט ההקלטה. אור האינפרה-אדום משמש כדי למזער את חשיפת הרשתית לאור נראה ולמזער את ההסתגלות לאור; עברו לעדשה של 40x והביאו את האלקטרודה למצב שבו היא נראית ממש מעל הרקמה.
קו העכברים ששימש במחקר זה מבטא EGFP בתאי הגנגליון שלו, ולכן תאי הגנגליון נראים תחת פלואורסצנציית epi. המיקרוסקופ מאיר את הרשתית באמצעות פלואורסצנציית epi באורך גל של 480 nanometers. אם הרשתית בריאה, תאי גנגליון בודדים אמורים להיות נראים.
רשתיות שאינן בריאות יציגו גרעינים גרנולריים גדולים ויש להשליכן. בחרו את אחד התאים העצביים הגנגליוניים הפלואורסצנטיים להקלטה, והשתמשו בסרט הדבקה של המעבדה כדי לסמן את התא שנבחר על מסך המחשב. עברו לאופטיקה באינפרא-אדום כך שגוף התא הגנגליוני שנבחר יהיה גלוי.
מקמו את אלקטרודת ההקלטה בסמוך לתא הגנגליוני המיועד. נקו את האזור המכסה את התא באופן מיידי על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין לאלקטרודת ההקלטה. הלחץ מופעל באמצעות מזרק פלסטיק בנפח 12 cc המחובר למחזיק הפפילה באמצעות צינור פוליאתילן בערך אפס של המגבר.
כל היסט מתח. הניחו את האלקטרודה על תא עצבי גנגליוני שנבחר עד להופעת שקע על פני התא. כאשר המגבר נמצא במצב clamp של מתח, השלימו פולס בדיקה ועקבו אחר הזרם העובר דרך הפיפטה.
יש להפעיל לחץ שלילי כדי ליצור אטימה בין האלקטרודה לתא. שחררו את הלחץ השלילי כאשר האטימה מתחילה להיווצר, והמתינו עד שזרם ההחזקה (holding current) יעיד על קיומה של אטימה חשמלית מסוג giga בין ממברנת התא לפיפט. הפעילו פולסים עדינים של לחץ שלילי עד להופעת תגובות קיבליות (capacitive transients) המעידות על הגעה למצב של רישום מתא שלם (whole cell recording), ולאחר מכן שחררו כל הפעלת לחץ.
אם התנגדות הגישה גבוהה מ-30 mega ohms, ניתן לעיתים קרובות לשפר זאת באמצעות פולסים נוספים ועדינים מאוד של לחץ שלילי. לאחר השגת מצב תא שלם (whole cell mode), כבה את אור האינפרה-אדום וכסה את המיקרוסקופ בבד שחור. אפשר לתא להסתגל לחושך במשך חמש דקות.
לאחר חמש דקות, הדגימה מוכנה להקלטה. במצב current clamp, הפעל גירוי של אור לבן בשטח מלא והקלט את תגובת תא הגנגליון. אם יש לגורות את תא הגנגליון מספר פעמים, יש לאפשר לרשתית להסתגל לחושך בהתאם בין הגירויים.
ניתן להסuaikan בנקודה זו גם את גירוי האור כך שיכלול גירויים כרומטיים או בעלי תבנית כדי להעריך את תכונות התגובה של תאי הגנגליון לאחר ההקלטה; הסמן הפלואורסצנטי בתמיסה התוך-תאית כבר הפיץ עצמו אל הדנדריטים. ניתן להמשיך בבדיקה על ידי מעבר בין אופטיקת epi fluorescence לאופטיקה של DIC infrared. ניתן להדמות את הסמן תחת epi fluorescence באורך גל של 594 nanometers, ובכך לבחון את הדנדריטים כדי לקבוע אם תא הגנגליון הוא on off או bi-stratified. הנוירו-ביוטין שהוסף לתמיסה התוך-תאית הפיץ עצמו אל תוך תא הגנגליון, ולכן השלב הבא הוא הכנת הרשתית להיסטוכימיה אימונומרכזית.
הנסי את הפ pipette בעדינות כדי למזער את הפגיעה בממברנת התא. שימי לב שאם את מקליטה וממלאת תא גנגליוני רטינלי אחד בלבד לכל דגימה, תוכלי לאחר מכן לבצע קורלציות ספציפיות בין התא הגנגליוני שהוקלט לבין המורפולוגיה המפורטת שלו. לאחר מכן, הניחי את הרטינה בתמיסת Paraform aldehyde וקבעי אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לאחר הקיבוע למשך לילה.
שטפו את הרשתית המקובעת ב-PBS, תוך ביצוע לפחות שישה החלפות של תמיסת ה-PBS במהלך שעתיים או יותר. לאחר השטיפה, העבירו את הרשתית לצלחת המכילה תמיסת חסימה, הניחו את הצלחת על שייקר והמתינו שעתיים. בטמפרטורת החדר, החליפו את תמיסת החסימה בתמיסת זיהוי הסטריפטוקוקים, החזירו את הרשתית לשייקר והדגירו אותה למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר יומיים, שטפו את הרשתית ב-PBS באמצעות שישה שטיפות של 20 דקות כל אחת לצורך קיבוע הרשתית. הניחו אותה כאשר צד תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה על גבי למסת זכוכית באמצעות vector shield. כסו את מדיום הקיבוע בכיסוי זכוכית ואטמו בעזרת לק; כעת ניתן לבחון את תאי הגנגליון המסומנים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
איור זה מציג תאי גנגליון רטינליים חיוביים ל-GFP כפי שנראים תחת תאורה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית בהגדלה של 40 פעמים משמאל, ותחת תאורת DIC מימין. אם הרשתית בריאה וההפרדה הצליחה, תאי גנגליון בודדים יהיו גלויים תחת DIC בהגדלה גבוהה. רשתית שאינה בריאה תציג גרעינים גרנולריים גדולים ויש להשליכה.
איור זה מציג את סוג התגובה לאור האופיינית לתא גנגליוני רשתית מסוג M2 המגיב באופן טבעי לאור (intrinsically photosensitive retinal ganglion cell) בשכבה של סיבים. בהתאם לסוג תאי הגנגליון ברשתית שסומנו גנטית בדגימה נתונה, תכונות התגובה ישתנו. אם התגובה הסינפטית של תא גנגליוני נתון תקינה, התא אמור להגיב עם תחילת החשיפה לאור או עם סיומה באמצעות פוטנציאלי פעולה.
ובמקרה של תא גנגליוני רגיש לאור באופן עצמאי, דפולריזציה מתמשכת; איור זה של תא גנגליוני מלא בביוטין נוירולוגי מראה את המורפולוגיה של תא גנגליוני רשתית M1-off stratifying, הרגיש לאור באופן עצמאי. בעקבות הקלטה של התא השלם (whole cell recording), אימונוהיסטוכימיה מאפשרת קורלציה בין המורפולוגיה הדנדריטית לבין התגובה האלקטרופיזיולוגית של תא הגנגליון ברשתית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחמצן את באר הרשתית ולהזרים את הנוזלים לרקמה במהירות כדי לשמר תגובות סינפטיות.
תודה שצפיתם בהדגמה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח והקלטה מהכנה מבודדת של רשתית בעכברים. הוא מתמקד בהקלטת תגובות לאור מתאי גנגליון המסומנים גנטית ובניתוח המורפולוגיה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- הרשתית חיונית לעיבוד חזותי.
- תאי גנגליון מעבירים מידע חזותי למוח.
- סימון גנטי מאפשר זיהוי ספציפי של סוגי תאים.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מספקות תובנות לגבי תפקוד התא.
מטרת המחקר
- להקלטת תגובות המעוררות על ידי אור מתאי גנגליון.
- לניתוח המורפולוגיה של תאי גנגליון שזוהו.
- להבנת התכונות התפקודיות של סוגים ספציפיים של תאי גנגליון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאה של הרשתית מעין העכבר.
- טיפול אנזימטי להסרת הנוזל הזגוגית.
- הצבת הרשתית בתא הקלטה.
- הקלטות patch clamp של תא שלם מתאי גנגליים מזוהים.
תוצאות עיקריות
- הקלטה מוצלחת של תגובות המופעלות על ידי אור מתאי גנגליון.
- זיהוי סוגים ספציפיים של תאי גנגליון על בסיס סימון גנטי.
- ניתוח התכונות התפקודיות של התאים שהוקלטו.
- תובנות לגבי האותים המועברים למוח על ידי תאים אלו.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר מפורט של תפקוד תאי הגנגליון.
- סימון גנטי משפר את הספציפיות בזיהוי סוגי תאים.
- רישומים אלקטרופיזיולוגיים מספקים נתונים בעלי ערך על עיבוד רטינלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הקלטה ישירה של תגובות המעוררות על ידי אור מתאי גנגליונים ברשתית (RGCs) המסומנים גנטית מאפשרת אפיון תפקודי מדויק של תת-סוגים נוירונליים מוגדרים ברקמה שלמה. גישה זו מחזקת את שלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור הזהות הגנטית לפלט פיזיולוגי, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מנגנונית ובתיקוף יעדים במחקר נוירו-אופתלמולוגי. יכולתה של השיטה לשמר את המבנה הדנדריטי ואת הקלטים הסינפטיים מגבירה את רמת הביטחון הניבוئيه עבור מחקרים טרנסלציונליים ופרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תתי-סוגים ספציפיים של RGC לצורך תיקוף תפקודי של מטרות במחקר ראייה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי קורלציה בין סימון גנטי לבין פרופילי תגובה אלקטרופיזיולוגיים.
- מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין גיוון תפקודי בקרב אוכלוסיות של תאי גנגליון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות רשתית שלמות ומאומתות לסריקה אלקטרופיזיולוגית ופרמקולוגית בהמשך התהליך.
- מבטיח שחזור ומדידה כמותית של תגובות המעוררות על ידי אור על פני סוגי תאים המוגדרים גנטית.
- מאפשר פיתוח בדיקות ניתנות להרחבה (scalable), ספציפיות לסוג-משנה, לצורך הערכת תרכובות המכוונות למסלולים ברשתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדים תפקודיים למעגלים רטינליים הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- שומר על רצף מהמניפולציה הגנטית ועד לתיקוף פיזיולוגי במודלים פרה-קליניים.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לאוכלוסיות ספציפיות של תאי רשתית.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני במסלולי פיתוח נוירו-אופתלמיים.
- ביולוגיה של גילוי: מקשרת בין זהות גנטית לתפוקה פונקציונלית, ובכך תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת נתונים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציית תא בודד להשוואת תכונות תגובה לאור בתנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שימור המעגלים המקוריים ונאמנות התגובה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך אנליזה של סוגי תאי RGC מגוונים וסטנדרטיזציה בין תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות ברשתית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההכנה וההקלטה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח הממוקדים בראייה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של מטרות ואסטרטגיות טיפוליות בנורו-אופתלמולוגיה, מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של הרשתית, אלקטרופיזיולוגיה וטכניקות של סימון גנטי.
- דורש מיקרוסקופיה מיוחדת ומכשור patch clamp להקלטות של תא בודד.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הרקמה ותנאי ההקלטה.
- ייתכן וידרש ביצוע התאמות עבור קווי עכברים שונים או מודלים של מחלות רשתית.
- החיוניות והשלמות הסינפטית מוגבלות על ידי אילוצי טיפול ברקמה וחמצון.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
1:01
Introduction
1:33
Preparation of Solutions
2:29
Isolation of Retina from Mouse Eye
11:21
Response of Retinal Ganglion Cell to Light Stimulation and Correlation with Morphology
4:08
Treatment of Retina with Enzyme MIxture and Mounting in Recording Chamber
6:10
Localization of EGFP Expressing Ganglion Cells and Light Stimulation
9:51
Analysis of Anatomy of Recorded Ganglion Cells
12:45
Conclusion
0:05
Title
