Name: הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: למדו להכין רשתית מבודדת מעכברים להקלטת תגובות אור מתאי גנגליון מסומנים גנטית. השיטה משלבת פצירת רשתית, טיפול אנזימטי והקלטות patch clamp לניתוח תפקודי ומורפולוגי של תאי עצב רשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. אנו מודים דרווין חכה לקבלת סיוע טכני שלו.

שימוש הצהרת בעלי חיים: בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות שתוארו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, תוך שימוש בפרוטוקולים אושרה על ידי אוניברסיטת מינסוטה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש. 1) הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע הקלטה אלקטרו, פתרונות תאיים, תאית, ואת האנזים צריכים להיות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים: האחד לערבב בבקבוק (8.8g) של המדיום אבקת "איימס (סיגמא) עם l 1 של H 2 O ו - 1.9 גרם של סודיום ביקרבונט (23 mM). בנקודות כל פתרון תאיים רווי 95% O 2 / 5% 2 CO בתערובת הגזים. העברת 200 מ"ל כדי מבחנה לאחסון הרשתית. מניחים את הפתרון הנותרים במיכל זלוף מערכת זלוף הכבידה פעם הוא רכוב הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאיים פתרון: פתרון תאיים צריך נעשו בעבר aliquoted מכן לתוך 500-1000 aliquots μL ומאוחסנים ב -20 ° C. פתרון תאיים משתנה בהתאם הניסוי הצורך, עבור הקלטות מהדק הנוכחי המוצג כאן אנו משתמשים (מ"מ): 125-K-gluconate, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0.5 mM NaGTP עד 7.2 pH עם KOH 5. נותב ניאון כגון 10 מיקרומטר Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) ניתן להוסיף לדמיין דנדריטים במהלך הניסוי, ואת neurobiotin (0.3%) יכול להיכלל גם לניתוח של האנטומיה תא הבאים ההקלטה. כאשר מוכן להקליט, הפשרה פתרון תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון אנזימים: שילוב 10,000 יחידות collagenase (כימיקלים וורטינגטון) עם Hyaluronidase מ"ג 83 (כימיקלים וורטינגטון) לתוך 4.150 מ"ל של תמיסת תאי. חנות ב 50 aliquots μL ב -20 ° C. Aliquots יכול לשמש למשך מספר שבועות. כאשר מוכן לטפל ברשתית, לדלל aliquot לתוך μL 500 של פתרון תאיים מבעבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו פתרון (PBS): ב 800 מ"ל של H 2 O להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.4 גרם של Na 2 HPO 4 ו - 0.24 גרם של KH 2 PO 4. תביאו את ה-pH ל -7.4 עם NaOH. כוון את עוצמת הקול עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר פוספט 0.2 M: ב 800 מ"ל של H 2 O להוסיף 21.8 גרם של Na 2 HPO 4 ו - 6.4 גרם של לאא 2 PO 4. תביאו נפח 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde פתרון 4%: מחממים 50 מ"ל H 2 O עד 60 ° C. הוסף paraformaldehyde 4G, מערבבים במשך כמה דקות. הוסף כמה טיפות של NaOH 1M (כ 5 טיפות), לבחוש עד פתרון ברור. הוסף 50 מ"ל 0.2 M חיץ פוספט לתוך כוס. בדוק pH בעזרת רצועות ה-pH (~ 7.4). סינון מגניב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חסימת (נסיוב עיזים 10%, 0.5% TritonX100): ב 1.8 מ"ל של PBS להוסיף 0.2 מ"ל של סרום עיזים 10 μL טריטון X-100. TritonX-100 משמש permeabilise הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin פתרון (נסיוב עיזים 5%, 0.5% TritonX100, 1:500 streptavidin 594): ב 1.9 מ"ל של PBS להוסיף 0.1 מ"ל של סרום עז, 10 μL טריטון X-100 ו - 4 μL של streptavidin 594. </li></ol> 2) בידוד של הרשתית מן העכבר Dissection הכלים הדרושים: 1 # 2 מלקחיים, 2 # 5 מלקחיים, מספריים ophthalmologic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העכבר על פי פרוטוקולים שאושרו, במקרה זה ה-CO 2 מחנק ועל גלגל העין enucleate בעדינות על ידי החדרת זווית # 2 מלקחיים מאחורי העין והסרת את גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלגל העין לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ עם פתרון תאיים. חותכים את עצב הראייה ואת כל שרירי extraocular המצורפת או רקמת החיבור באמצעות מספריים ophthalmologic. לחתוך את הקרנית עם מספריים ophthalmologic ולשלוף את העדשה באמצעות # 5 מלקחיים. לקרוע את בלובן העין בעזרת זוג מלקחיים # 5 ולהשתמש מלקחיים לנתק את עצב הראייה ברשתית שבו והלחמית נפגשים דיסק אופטי. לקלף בעדינות הרשתית הרחק עיינית. טיפ: האם כל צעד על הרשתית הן לפני המעבר לשלב הבא כדי למזער את הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להסיר הזגוגית מחוברת לרשתית. זה יכול להתבצע על ידי "תופס" את הזגוגית השקופה מעל הרשתית עם מלקחיים. זגוגי, אם הוסר בהצלחה, צריך להיות גלוי כחומר, ברור דביקות על מלקחיים. טיפ: בחותכו הרשתיות ב וחצי לאחר ההסרה של הזגוגית יהיה למקסם את כמות רקמת שמיש ולעשות הרכבה בחדר קלה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הרשתיות בפתרון תאיים מחומצן בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם אור הסביבה מינימלי עד שהם מוכנים להתעכל. הרשתית ניתן לאחסן בצורה זו עבור ~ 6 שעות. </li></ol> 3) טיפול של הרשתית בתערובת האנזים הרכבה בתא הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot של collagenase / hyaluronidase בתמיסה 500 תאיים μL, הפתרון מקום בצלחת פטרי 35 מ"מ ולהעביר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הרשתית, מכיליםing צלחת פטרי, מכוסה בחושך, ב O2 95% / 5% CO 2 בסביבה במשך 15 דקות עם תסיסה עדינה. צעד זה מסייע בעיכול כל זגוגי הנותרים ומאפשר גישה קלה יותר שכבת תא גנגליון. עצה: עבור הרשתיות של בעלי חיים צעירים עם זגוגי פחות או אם הם נצפו תופעות לוואי, זמן יכול להתקצר ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הרשתית ממדיום אנזים המכיל ולשטוף בהרחבה פתרון תאיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך ההקלטה קאמרית 6 עם שכבת photoreceptor כלפי מטה. וויק משם נוזלים הנותרים עם טפטפת או רקמות לרדד הצדדים של הרשתית לשטח רקמות נזהר לגעת רק בשולי הרשתית, במיוחד הימנעות ממגע עם שכבת תא גנגליון. מניחים טבעת פלטינה עם רשת ניילון על הרשתית לעגן את הרקמה מיד למלא את התא עם פתרון תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית הקלטה לבמה מיקרוסקופ, לצרף צינור עבור זלוף הכבידה יניקה ואקום לצרף חוט הקרקע. </li></ol> 4) לוקליזציה של תאים EGFP הגנגליון להביע וגירוי אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הרשתית על ידי כוח הכבידה עם פתרון תאיים על 1 שיעורי mL / min או מהיר יותר. עצה: אם קצב טפטוף איטי מדי, הרקמה לא יהיה מספיק חמצן איתות הסינפטי יכול להיות מופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה הקלטה עם פתרון תאיים והכנס אותו לתוך מחזיק פיפטה. טיפ: pipettes עם התנגדויות בטווח של 3 עד 5MΩ לתת את התוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הרשתית תחת אינפרא אדום התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי 10X, NA 0.3) כדי למקם את פיפטה ההקלטה. אור אינפרא אדום משמש לצמצם את החשיפה הרשתית לאור הנראה ולמזער הסתגלות קלה. מעבר הגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי, NA 0.8) ולהביא אלקטרודה לתוך נוף מעל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי), להאיר את הרשתית עם epifluorescence (480 ננומטר במשך EGFP) ובחר תא גנגליון סימן פלורסנט על צג המחשב באמצעות קלטת (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה DIC אינפרא אדום, מיקום האלקטרודה הקלטה ליד התא גנגליון ממוקד (איור 1A). אזור נקי מיד מכסה תא על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין אלקטרודה הקלטה באמצעות מזרק פלסטיק 12cc קשור לבעל פיפטה עם צינורות פוליאתילן. על המגבר, אפס כל קיזוז מתח. אלקטרודה מקום על תא גנגליון שנבחרו עד גומת חן מופיע על פני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המגבר במצב מהדק מתח, להחיל על הדופק לבדוק ולנטר את העברת הזרם דרך פיפטה. החל לחץ שלילי כדי ליצור חותם בין האלקטרודה בתא. שחרור לחץ שלילי כאשר התא מתחיל חותם ולהמתין מחזיק הנוכחי מעיד על חותם חשמל GΩ בין הממברנה של התא פיפטה. החל פולסים עדין של לחץ שלילי עד הארעיים קיבולי להופיע ולאחר מכן שחרר כל הפעלת לחץ. טיפ: אם (סדרה) הגישה התנגדות גבוהה (&gt; 30MΩ), זה יכול להיות לעיתים קרובות על ידי להשתפר נוסף, פולסים עדין מאוד של לחץ שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חותם יציבה הושג להחיל הדופק של לחץ שלילי. אחרי מצב התא כולו מתקבל, לאפשר לתא חשוך להסתגל במשך 5 דקות. שיא, במצב הנוכחי בתגובה, מהדק לגירוי, שדה מלא אור לבן (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההקלטה, Alexafluor-594 יהיה מתפזרת על דנדריטים. נותב ניתן דמיינו תחת epifluorescence ב 594 ננומטר משמש כדי לקבוע אם תא הגנגליון הוא on-, Off-או Bi-מרובדת על ידי מעבר בין אופטיקה אינפרא אדום ו epifluorescence DIC 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם neurobiotin נכלל פיפטה ו הרשתית הולך להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה, אז פיפטה חייב להיות חזר בו בעדינות כדי לספק הפרעה מזערית של הממברנה. </li></ol> 5) ניתוח של האנטומיה של תאים הגנגליון מוקלט מילוי עם neurobiotin מאפשר ניתוח מפורט יותר המורפולוגי של תאים הגנגליון הבאים ההקלטה. עצה: אם מתאמים ספציפיים בין תא גנגליון רשמה ומורפולוגיה מפורט הרצוי, זה עשוי להיות הטוב ביותר כדי להקליט למלא רק אחד RGC לכל הכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם neurobiotin נכלל הפתרון תאיים אז במקום הרשתית בפתרון paraformaldehyde ולתקן לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב-PBS, לפחות 2 שעות, לפחות 6 שינויים. מעבירים את הרשתית לצלחת המכילה פתרון חסימה. השאר בחסימת פתרון 2 שעות, בטמפרטורת החדר על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון חוסם את הפתרון streptavidin. דגירה 2 ימים 4 ° C על שייקר. שוטפים את הרשתית של PBS, 6 שטיפות, 20 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתית עם Vectashield בשקופית זכוכית.הרשתית יש להציב עם לתאי הגנגליון למעלה. בצע מיקרוסקופיה confocal (תרשים 1C). </li></ol> נציג תוצאות אם הרשתית בריא לנתיחה בוצעה בהצלחה, בתאי הגנגליון הפרט צריך להיות גלוי תחת DIC בהגדלה גבוהה (איור 1 א). הרשתית לא בריאה יהיה גרעינים גדולים, מגורען ויש מבוטלים. אם התגובה הסינפטי של תא גנגליון נתון שלם, אז התא צריך להגיב בתחילת אור או לקזז עם פוטנציאל פעולה, במקרה של תא גנגליון מהותית, רגישים (איור 1B), שלילת קוטביות מתמשכת. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לוקליזציה, הקלטה, מכתים התא שכותרתו fluorescently הגנגליון ברשתית. (א) RGC GFP חיובית דמיינו תחת תאורה epifluorescent בהגדלה 40X (פאנל משמאל) תחת תאורה DIC (פאנל מימין). (ב) אור בתגובה Synaptic תא רגיש לאור מיסודם M2 הגנגליון ברשתית רשמה במצב כל תא מהדק הנוכחית מ RGC שכותרתו fluorescently. (ג) M1 רגישים מהותית תא גנגליון ברשתית כי זוהה תחת epifluorescence, ממוקד עבור כל הקלטה תאים, מלא neurobiotin, ומעובד לאחר מכן על אימונוהיסטוכימיה.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

טכניקה זו החלה על כל תא גנגליון ברשתית הקלטות של הרשתית מבודד. אמנם בשורה העכבר בשימוש מעל רגישים באופן מהותי, melanopsin-לבטא RGCs מסומנים עם EGFP 2, 5, פרוטוקול זה ניתן להעברה בקלות אחר קווי RGC שכותרתו fluorescently או ניתן להכליל להקליט RGCs שנבחרו באופן אקראי גם כן. טכניקה זו חשוב במיוחד משום סוכת הדנדריטים של כל RGC ונוירונים שלו בהתאמה קלט נותרים שלמים לחלוטין. הקלטות יכול בקלות להתבצע מצבי מהדק הנוכחי או מתח, תאים המצורפת או רופף, תיקון תצורה, או יכול גם לשמש עב...

<table><tbody><tr><td>איימס&amp;rsquo; מצע</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>היאלורונידאז</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>נת renaming נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>נוירוביוטין</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>מספרי עיניים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטאווידין 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>סרום מעז</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>פראפורמאלדהיד</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

הצעדים הראשונים בחזון חוליות להתרחש כאשר אור מגרה את מוט חרוט קולטני האור ברשתית 1. מידע זה הפרדה מכן לתוך במה שמכונה המסלולים לסירוגין. Photoreceptors אות מידע אור על התאים דו קוטבית (BCS), אשר depolarize בתגובה מגדיל (ביום BCS) או יורד (כבוי BCS) בעוצמת האור. הפרדה זו של מידע אור נשמר ברמה של התאים הגנגליון ברשתית (RGCs), אשר יש דנדריטים stratifying ב sublamina או כיבוי של השכבה הפנימית plexiform (IPL), שם הם מעוררים לקבל קלט ישירות כבוי BCS, או stratifying ב sublamina ביום של IPL, שם הם מקבלים קלט מעוררים ישיר ב BCS. הפרדה זו של מידע בנוגע להגדיל או להקטין את התאורה (לסירוגין מסלולים) נשמרת וסימן המוח במקביל. RGCs הם תאים הפלט של הרשתית, ועל כן הם תא חשוב ללמוד כדי להבין כיצד מידע האור הוא אותת גרעינים ויזואלי במוח. ההתקדמות בגנטיקה העכבר מעל בעשורים האחרונים הביאו מגוון של פלורסנט העכבר קווי הכתב שבו אוכלוסיות מסוימות RGC מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי כדי לאפשר זיהוי של תת RGC 2 3 4 וספציפי מיקוד הקלטה אלקטרו. כאן, אנו מציגים שיטה הקלטה התגובות אור מתאי הגנגליון שכותרתו fluorescently בהכנה, פגע ברשתית מבודדים. זו הכנה רשתית מבודד מאפשר הקלטות RGCs בו סוכת הדנדריטים הוא שלם התשומות לרוחב סוכת הדנדריטים כולה RGC נשמרים. שיטה זו ישימה על פני מגוון רחב של תת תא גנגליון, והוא מקובל מגוון רחב של תא בודד טכניקות פיזיולוגיות.

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

השלבים הראשונים בראייה של חולייתנים מתרחשים כאשר אור מעורר את הפוטורצפטורים מסוג פיתול (rod) וקונוס (cone) ברשתית 1. מידע זה עובר לאחר מכן...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט תגובות עוררויות לאור מתאי גנגליוניים מסומנים גנטית ברשתית מבודדת של עכבר. הדבר מבוצע תחילה על ידי דיסקציה של הרשתית מעין העכבר. השלב השני של הפרוצדורה הוא טיפול ברשתית באמצעות אנזים להסרת שאריות הוויטריאום.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קיבוע הרשתית כאשר צד תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה בתא ההקלטה, קיבוע התא על במה המיקרוסקופ, וזיהוי תאי הגנגליון המסומנים גנטית. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע הקלטת תא שלם (whole cell recording) של תא הגנגליון שזוהה והקלטת תגובות המושרות על ידי אור. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התכונות התפקודיות של סוג מוגדר של תא גנגליון ברשתית העכבר, ולהגדיר את האותות שהוא מעביר למוח באמצעות הקלטות patch clamp של תא בודד.שלום, שמי טיפאני שמידט ואני סטודנטית לתואר שני במדעי העצבים במעבדתו של ד"ר פאולו קה פוג'י באוניברסיטת מינסוטה. טכניקה זו מאפשרת זיהוי והקלטה מאוכלוסייה מוגדרת ומסומנת גנטית של תאי גנגליון, וביצוע אנליזה מורפולוגית לאחר מכן. טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום השדה הוויזואלי, כגון האופן שבו תתי-סוגים שונים של תאי גנגליון מעבדים מאפיינים מרכזיים של גירויים חזותיים לפני ביצוע הניתוח.כדי להוציא את הרשתית, המשימה הראשונה היא להכין שמונה תמיסות הדרושות לניסוי. הרכיבים לכל התמיסות המשמשות בניסוי זה מופיעים בטקסט הנלווה. העבירו 200 milliliters של התמיסה החוץ-תאית לכלי חלה (beaker) בנפח של 250 milliliters לאחסון הרשתית.העבר את תמיסת החוץ שנותרה למשפך הפרדה לצורך perfusion בכוח הכבידה במהלך ההקלטה. יש לשמור על שתי תמיסות אלו רוויות ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide בכל עת. כדי להדגים את הדנדריטים במהלך הניסוי, הוסף סמן פלואורסצנטי כגון LOR 5 94 לתמיסת הפנים.אם אתם מתכננים לבצע אימונוהיסטוכימיה לאחר הקלטת תא שלם, הוסיפו 0.3% neuro biotin לתמיסה התוך-תאית. לאחר הכנת התמיסות הדרושות, בצעו המתנסה לעכבר באמצעות חנק בבידוד פחמי dióxido, הוציאו את גלגל העין על ידי הכנסה עדינה של פינצטה זוויתית מספר 2 מאחורי העין והרמה של גלגל העין. השתמשו במספרי עיניים כדי להסיר את השרירים החוץ-עיניים ולחתוך את העצב האופטי.הניחו את גלגל העין בצלחת פטרי של 35 מילימטר הממולאת בתמיסה חוץ-תאית. גזרו את הקרנית באמצעות מספריים Oftalmologic ושלפו את העדשה בעזרת פינצטה מספר 5. השתמשו בפינצטה מספר 5 כדי לקרוע את הסקלרה ולנתק את שארית העצב האופטי בנקודת המפגש בין הרשתית לסקלרה.משכו בעדינות את הרשתית הרחק מכוס העין על ידי העברת הפינצטה במרווח שבין הרשתית לסקלרה. כדי לחסוך בזמן, בצעו כל שלב בשתי הרשתיות. לפני המעבר לשלב הבא, שלב קריטי הוא הסרת הוויטריאום הדבוק לרשתית. התחילו בשימוש בפינצטה לתפיסת הוויטריאום השקוף שמעל הרשתית.אם הזגוגית הוסרה בהצלחה, תראו חומר ג'לטיני שקוף וקטן על קצה הפינצטה. חתכו כל רשתית לשניים כדי למקסם את כמות הרקמה השמישה ולסייע בהצבת הרשתית בתא ההקלטה. הניחו את הרשתית בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת בטמפרטורת החדר; אם תמזערו את החשיפה לאור ותאפשרו רק אור סביבתי מינימלי, כגון אור ממסכי מחשב, הרשתית תישאר חיונית למשך כשש שעות.לאחר הנתיחה, קחו 500 µL של התמיסה החוץ-תאית מהתמיסה שבה הרשתיות נמצאות בבעבוע. דללו לתוכה אליקוט של תמיסת האנזימים קולגנאז היאלורונידאז.העבירו את תמיסת האנזים לצלוחית פטרי בקוטר 35 מילימטר והעבירו אחת מהרשתיות שבוצעו בהן דיסקציה אל תוך הצלוחית. סובבו את צלוחית הפטרי במשך 15 דקות תוך כדי הזרמה עדינה ומתמדת של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide אל תוך התמיסה. תמיסת האנזים מסירה שאריות של גוף הזכוכית ומאפשרת גישה קלה יותר לשכבת תאי הגנגליון. עבור רשתיות מבעלי חיים צעירים יותר עם פחות גוף זכוכית, או אם נצפו השפעות לוואי, ניתן לקצר את זמן העיכול לחמש דקות.השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק שקצהה גזור. הוציאו את הרשתית מהתווך המכיל את האנזים. שטפו את הרשתית ביסודיות בתמיסה חוץ-תאית.העבירו את הרשתית לתא ההקלטה. כאשר שכבת הפוטורצפטורים פונה כלפי מטה, ספגו כל נוזל שנותר באמצעות פיפטה או נייר סופג, וגלגלו את דפנות הרשתית כדי לשטח את הרקמה. היזהרו לגעת רק בקצוות הרשתית ולא בשכבת תאי הגנגליון.כדי לקבע את הרשתית, הניחו טבעת פלטינה עם רשת ניילון מעל הרשתית, ולאחר מכן מלאו מיד את התא בתמיסה חוץ-תאית. התקינו את תא ההקלטה על במה המיקרוסקופ ולאחר מכן חברו את הצינור לביצוע פרפוזיה בכבידה של התמיסה החוץ-תאית, את צינור השאיבה בואקום ואת חוט ההארקה. כווןו את הגובה כך שהנוזל יטפטף בקצב של 1 mL לדקה או מהר יותר.אם קצב הפרפוזיה איטי מדי, הרקמה לא תחבלס בחמצן מספיק ואיתות סינפטי עלול להיפגע. השלב הבא הוא הכנת האלקטרודה להקלטת patch של תא שלם (whole cell patch recording). בחרו פיפט עם התנגדות בטווח של שלושה עד חמישה מגה-אוהם.מלאו את פיפט ההקלטה עם מנה שהופשרה של תמיסה תוך-תאית והכניסו אותה למחזיק הפיפטות באמצעות תאורת אינפרה-אדום ואופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) תחת עדשה של 10x. הדמיעו את הרשתית ואת פיפט ההקלטה. אור האינפרה-אדום משמש כדי למזער את חשיפת הרשתית לאור נראה ולמזער את ההסתגלות לאור; עברו לעדשה של 40x והביאו את האלקטרודה למצב שבו היא נראית ממש מעל הרקמה.קו העכברים ששימש במחקר זה מבטא EGFP בתאי הגנגליון שלו, ולכן תאי הגנגליון נראים תחת פלואורסצנציית epi. המיקרוסקופ מאיר את הרשתית באמצעות פלואורסצנציית epi באורך גל של 480 nanometers. אם הרשתית בריאה, תאי גנגליון בודדים אמורים להיות נראים.רשתיות שאינן בריאות יציגו גרעינים גרנולריים גדולים ויש להשליכן. בחרו את אחד התאים העצביים הגנגליוניים הפלואורסצנטיים להקלטה, והשתמשו בסרט הדבקה של המעבדה כדי לסמן את התא שנבחר על מסך המחשב. עברו לאופטיקה באינפרא-אדום כך שגוף התא הגנגליוני שנבחר יהיה גלוי.מקמו את אלקטרודת ההקלטה בסמוך לתא הגנגליוני המיועד. נקו את האזור המכסה את התא באופן מיידי על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין לאלקטרודת ההקלטה. הלחץ מופעל באמצעות מזרק פלסטיק בנפח 12 cc המחובר למחזיק הפפילה באמצעות צינור פוליאתילן בערך אפס של המגבר.כל היסט מתח. הניחו את האלקטרודה על תא עצבי גנגליוני שנבחר עד להופעת שקע על פני התא. כאשר המגבר נמצא במצב clamp של מתח, השלימו פולס בדיקה ועקבו אחר הזרם העובר דרך הפיפטה.יש להפעיל לחץ שלילי כדי ליצור אטימה בין האלקטרודה לתא. שחררו את הלחץ השלילי כאשר האטימה מתחילה להיווצר, והמתינו עד שזרם ההחזקה (holding current) יעיד על קיומה של אטימה חשמלית מסוג giga בין ממברנת התא לפיפט. הפעילו פולסים עדינים של לחץ שלילי עד להופעת תגובות קיבליות (capacitive transients) המעידות על הגעה למצב של רישום מתא שלם (whole cell recording), ולאחר מכן שחררו כל הפעלת לחץ.אם התנגדות הגישה גבוהה מ-30 mega ohms, ניתן לעיתים קרובות לשפר זאת באמצעות פולסים נוספים ועדינים מאוד של לחץ שלילי. לאחר השגת מצב תא שלם (whole cell mode), כבה את אור האינפרה-אדום וכסה את המיקרוסקופ בבד שחור. אפשר לתא להסתגל לחושך במשך חמש דקות.לאחר חמש דקות, הדגימה מוכנה להקלטה. במצב current clamp, הפעל גירוי של אור לבן בשטח מלא והקלט את תגובת תא הגנגליון. אם יש לגורות את תא הגנגליון מספר פעמים, יש לאפשר לרשתית להסתגל לחושך בהתאם בין הגירויים.ניתן להסuaikan בנקודה זו גם את גירוי האור כך שיכלול גירויים כרומטיים או בעלי תבנית כדי להעריך את תכונות התגובה של תאי הגנגליון לאחר ההקלטה; הסמן הפלואורסצנטי בתמיסה התוך-תאית כבר הפיץ עצמו אל הדנדריטים. ניתן להמשיך בבדיקה על ידי מעבר בין אופטיקת epi fluorescence לאופטיקה של DIC infrared. ניתן להדמות את הסמן תחת epi fluorescence באורך גל של 594 nanometers, ובכך לבחון את הדנדריטים כדי לקבוע אם תא הגנגליון הוא on off או bi-stratified. הנוירו-ביוטין שהוסף לתמיסה התוך-תאית הפיץ עצמו אל תוך תא הגנגליון, ולכן השלב הבא הוא הכנת הרשתית להיסטוכימיה אימונומרכזית.הנסי את הפ pipette בעדינות כדי למזער את הפגיעה בממברנת התא. שימי לב שאם את מקליטה וממלאת תא גנגליוני רטינלי אחד בלבד לכל דגימה, תוכלי לאחר מכן לבצע קורלציות ספציפיות בין התא הגנגליוני שהוקלט לבין המורפולוגיה המפורטת שלו. לאחר מכן, הניחי את הרטינה בתמיסת Paraform aldehyde וקבעי אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לאחר הקיבוע למשך לילה.שטפו את הרשתית המקובעת ב-PBS, תוך ביצוע לפחות שישה החלפות של תמיסת ה-PBS במהלך שעתיים או יותר. לאחר השטיפה, העבירו את הרשתית לצלחת המכילה תמיסת חסימה, הניחו את הצלחת על שייקר והמתינו שעתיים. בטמפרטורת החדר, החליפו את תמיסת החסימה בתמיסת זיהוי הסטריפטוקוקים, החזירו את הרשתית לשייקר והדגירו אותה למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר יומיים, שטפו את הרשתית ב-PBS באמצעות שישה שטיפות של 20 דקות כל אחת לצורך קיבוע הרשתית. הניחו אותה כאשר צד תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה על גבי למסת זכוכית באמצעות vector shield. כסו את מדיום הקיבוע בכיסוי זכוכית ואטמו בעזרת לק; כעת ניתן לבחון את תאי הגנגליון המסומנים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.איור זה מציג תאי גנגליון רטינליים חיוביים ל-GFP כפי שנראים תחת תאורה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית בהגדלה של 40 פעמים משמאל, ותחת תאורת DIC מימין. אם הרשתית בריאה וההפרדה הצליחה, תאי גנגליון בודדים יהיו גלויים תחת DIC בהגדלה גבוהה. רשתית שאינה בריאה תציג גרעינים גרנולריים גדולים ויש להשליכה.איור זה מציג את סוג התגובה לאור האופיינית לתא גנגליוני רשתית מסוג M2 המגיב באופן טבעי לאור (intrinsically photosensitive retinal ganglion cell) בשכבה של סיבים. בהתאם לסוג תאי הגנגליון ברשתית שסומנו גנטית בדגימה נתונה, תכונות התגובה ישתנו. אם התגובה הסינפטית של תא גנגליוני נתון תקינה, התא אמור להגיב עם תחילת החשיפה לאור או עם סיומה באמצעות פוטנציאלי פעולה.ובמקרה של תא גנגליוני רגיש לאור באופן עצמאי, דפולריזציה מתמשכת; איור זה של תא גנגליוני מלא בביוטין נוירולוגי מראה את המורפולוגיה של תא גנגליוני רשתית M1-off stratifying, הרגיש לאור באופן עצמאי. בעקבות הקלטה של התא השלם (whole cell recording), אימונוהיסטוכימיה מאפשרת קורלציה בין המורפולוגיה הדנדריטית לבין התגובה האלקטרופיזיולוגית של תא הגנגליון ברשתית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחמצן את באר הרשתית ולהזרים את הנוזלים לרקמה במהירות כדי לשמר תגובות סינפטיות.תודה שצפיתם בהדגמה זו.

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למדו להכין רשתית מבודדת מעכברים להקלטת תגובות אור מתאי גנגליון מסומנים גנטית. השיטה משלבת פצירת רשתית, טיפול אנזימטי והקלטות patch clamp לניתוח תפקודי ומורפולוגי של תאי עצב רשתית.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

גלה סרטונים נוספים