Name: אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: למד אינדוקציה של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות Lewis באמצעות אמולסיית אנטיגן KLH ו-Freund's adjuvant. שיטה זו מאפשרת מדידת תגובה דלקתית באמצעות הערכת נפיחות לאתגר החיסוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת התחליב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחליב הוא תערובת 01:01 של אנטיגן (DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים: ovalbumin, הוסיף טטנוס toxoid, חור המנעול עלוקה hemocyanin ....) בתמיסה מימית כדי להשלים adjuvant של פרוינד. חשוב מאוד להוסיף את אנטיגן כדי adjuvant ולא להיפך! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש הרבה פסולת בעת ביצוע והזרקת אמולסיה, ולכן תמיד להכין 1.5 או פי 2 יותר ממה שאתה צריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אנטיגן מלוחים להכין 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון. לא לסנן, כמו שאתה לא רוצה לאבד המצרפים! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים להשלים adjuvant פרוינד של H37Ra (Difco, קטלוג # 231131) בצינור ואת המערבולת במהירות גבוהה. הוסף את הירידה אנטיגן על ידי ירידה בעוד vortexing. כאשר כל אנטיגן הוא הוסיף, מערבולת במשך 5 דקות נוספות. התערובת צריכה להלבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התחליב של מזרק זכוכית ולקשר אותו מזרק עוד כוס באמצעות גשר 18G (קטלוג פישר # 14-825-17L). שלח את התחליב של מזרק לצד השני עד שהוא הופך קשה (50-10 דקות). מומלץ להשתמש בשני מזרקים 5 מ&quot;ל. אם יותר מ -5 מ&quot;ל תחליב נדרשים, השתמש במספר קבוצות של 5 מ&quot;ל מזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחליב ניתן לאחסן מזרקים ב 4 ° C למשך 3 שבועות. </li></ol> 2. חיסון של החולדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התחליב של מזרקים במשך כמה דקות ומעבירים מזרק המשמש הזריקה. להזריק 200 מ&quot;ל תת עורי ב 1-2 אתרי בבסיס הזנב באמצעות מחטים 23G ו Luer-Lok קצה מזרק 3 מ&quot;ל. </li></ol> 3. האתגר עם אנטיגן בגב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבעה ימים לאחר חיסון, לגלח 2 נקודות על גבם של החולדות ולהזריק intradermally 20 מ&quot;ל של פתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​1 אנטיגן בנקודה אחת מלוחים (או אנטיגן רלוונטי) במקום השני. האם לא לסנן את הפתרון אנטיגן, כפי שאתה עלול לאבד אגרגטים המשפרים את התגובה הדלקתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות צריכות להיות anesthesized כדי למנוע תנועות. להזריק את הפתרון באמצעות intradermally 27G ½ 1 מחטים ומזרקים מ&quot;ל. שנה מחטים בין זריקות. הערה: את האתגר אפשר לעשות פינה של האוזניים במקום האחורי למדידות יותר מדויקות. ראה וידאו <a href="/index/Details.stp?ID=325">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325</a> </li></ol> 4. מדידה של DTH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האתר הזרקת יתחיל מאדימים ונפיחות כסימן של דלקת. מדוד את הקוטר של האזור דלקתי באמצעות סרגל או, עדיף, קליפר. נפיחות המקסימלי אמור להתרחש בין 24 ל 72 שעות. </li></ol>

<ol>
	<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+monitoring+of+adoptive+delayed-type+hypersensitivity+in+rats.">Induction and monitoring of adoptive delayed-type hypersensitivity in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 8, (2007).</li></ol>

המחברים הם מייסדי ויועצים עבור Airmid בע&quot;מ

עבור מדידה מדויקת יותר של תגובת DTH אנו ממליצים תיגר על חולדות עם האנטיגן בתוך פינה של האוזן. התגובה אז יכול להיות, כפי שהיא נמדדת הבדל בין נפיחות באוזן האוזן אנטיגן תיגר רלוונטי האוזן תיגר עם מלוחים לבד או עם האנטיגן רלוונטי. הפגנה של האתגר באוזן מוצג 1.

השתמש סטרילי פתרונות ריאגנטים מזרקים. מזרקים הזכוכית וגשרים 18G ניתן autoclaved. קרא את גיליון נתונים חומר לפני הטיפול מגיב לראשונה ללבוש ציוד מגן מתאים.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (dth) בחולדות

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-T לימפוציטים מפעיל זיכרון לחדור את האתר של הזרקה של אנטיגן נגד שבו המערכת החיסונית כבר דרוך. התגובה הדלקתית מאופיין אדמומיות ונפיחות של האתר של אתגר antigenic. זהו מודל נוח על מנת לקבוע את ביעילות vivo של מערכת החיסון. DTH עורית יכול להיגרם גם על ידי העברת המאמצת של אנטיגן ספציפי לערמונית לימפוציטים מסוג T או על ידי חיסון פעיל עם אנטיגן, והאתגר intradermal הבאים עם האנטיגן לעורר תגובה דלקתית באזור העור נתון. התגובות DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים, למשל ovalbumin, טוברקולין, טטנוס toxoid, או חור המנעול עלוקה hemocyanin (KLH). כאן אנו מדגימים כיצד לגרום תגובת DTH פעיל לואיס חולדות. אנחנו יהיה הראשון להכין תחליב מים בתוך שמן של KLH, אנטיגן שלנו של עניין, להשלים adjuvant של פרוינד להזריק תת עורי אמולסיה זו לחולדות. זו תהיה הממשלה את מערכת החיסון לפתח תאים T זיכרון מופנה KLH. שבעה ימים לאחר מכן נוכל לקרוא תיגר על חולדות intradermally על הגב עם KLH בצד אחד עם ovalbumin, אנטיגן רלוונטי, בצד השני. התגובה הדלקתית יהיה גלוי 16-72 שעות לאחר מכן ואזור אדום ונפוח תימדד כאינדיקציה לחומרת DTH.

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל לימפוציטים מסוג T זיכרון. כאן אנו מדגימים כיצד לגרום DTH פעיל חולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

רגישות מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית המתווכת על ידי לימפוציטים T מסוג זיכרון אפקטורי המבטאים CCR7, אשר חודרים לאתר ההזרקה של...

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עובדת במעבדה של ג'ורג' צ'נדי במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-UCI. היום אראה לכם כיצד להשרות DTH פעיל בחולדות.לשם כך, אכין אמולסיה של KLH, המשמש כאנטיגן שלי, בתוך אדג'ובנט Freund. לאחר מכן, אזריק את האמולסיה לבסיס הזנב של חולדות Lewis. פעולה זו תגרום לחסינות של החולדות נגד KLH. לאחר שבוע, אבצע חשיפה חוזרת (challenge) של החולדות ל-KLH ואמדוד את תגובת ה-DTH על ידי מדידת הנפיחות.זהו אתר האתגר, ואנו משתמשים בו במעבדה כדי לבחון את ההשפעה של חוסמי תעלות PO על תגובות דלקתיות כגון DTH. כאן נמצא העזר למערכת החיסון (adjuvant) הבלתי שלם שאשתמש בו כדי להכין את האמולסיה. ניתן להשתמש גם בעזר למערכת החיסון השלם.כאן נמצא ה-KLH, שהוא האנטיגן שלי היום, ויש לי כאן תמיסה בריכוז של 2 mg/ml ב-PBS. אני אשתמש במזרק של 5 ml כדי להוציא את ה-incomplete trans adjuvant ולהעבירו למבחנה של 15 ml. לאחר מכן, אני אניח את המבחנה על הוורטקס ובזמן הערבוב, אוסיף את האנטיגן שלי טיפה אחר טיפה אל תוך ה-adjuvant.לאחר מכן, אבצע ערבוב במערבל Vortex למשך חמש דקות נוספות. בסיום הפעולה, אמלא מזרק זכוכית של 5 mL בתערובת; יש להשתמש במזרק זכוכית מכיוון שהעזר (adjuvant) נוטה להמיס פלסטיק. מצאנו כי מזרקים של 5 mL הם האידיאליים ביותר ליצירת האמולסיה.קטן יותר או גדול יותר אינם טובים באותה מידה. וברגע שמילאתי את המזרק בתערובת, אשתמש בגשר מתכתי זה כדי לחבר את מזרק הזכוכית הזה למזרק זכוכית אחר של 5 ml. לאחר מכן, אפעיל לחץ על המזרקים כדי שהתערובת תעבור ממזרק אחד לשני במהירות המקסימלית, עד שהיא תהפוך לקשיחה מאוד, כלומר עד שהאמולסיה תהפוך לקשיחה מאוד, ואז היא תהיה מוכנה להזרקה.כעת אני אוסיף 2.5 mils של העזר (adjuvant). אני מזריק אוויר כדי להוציא את העזר בקלות רבה יותר, ולאחר מכן מעביר את כל העזר אל המבחנה שלי. כעת, אקח 2.5 mls מהם ואוסיף אותם פנימה בעזרת וורטקס (vortex).מכיוון שהשתמשתי ב-2.5 mils מהעזר, אשתמש ב-2.5 mils מה-KLH שלי. כך, בעוד אני מוסיפה טיפה אחר טיפה, תראו שהתערובת תשנה את צבעה ותהפוך ללבנה. כעת הוספתי את כל האנטיגן אל העזר.כעת אערבב את התערובת במכשיר הוורטקס למשך חמש דקות נוספות. מכיוון שאיני מעוניין להחזיק את המבחנה ביד במשך חמש דקות, אצמיד אותה למכשיר הוורטקס בעזרת סרט דביק. יש ליצור מערבולת בתוך המבחנה במהירות המקסימלית האפשרית, אך מבלי שהנוזל יגלוש החוצה. אשאיר את המבחנה כך למשך חמש דקות.כך, חלפו חמש הדקות. אני הולך להפסיק כעת את הערבוב ב-vortex והתערובת שלי לבנה. לכן אני מוציא את המבחנה. אופס.התערובת לבנה לחלוטין כעת, אך היא עדיין נוזלית למדי. מכיוון שרציתי מרקם סמיך יותר להזרקה, אני מעביר את כל התערובת למזרק זכוכית של 5 M.המזרקים הללו עברו עיקור באוטוקלאב. אני מחבר מזרק שלם לגשר שלי, ומהמזרק השני אני מחבר רק את גוף המזרק.אני משאיר את הבוכנה בחוץ ואז אני הולך למזוג את התערובת למזרק העליון. אני אעביר את הכל למזרק התחתון. לאחר מכן, עלי להוציא את בועת האוויר שנמצאת כאן.אני הולך לנתק את המזרק העליון ולהוציא את בועת האוויר. קשה לראות את הבועה, אבל היא נמצאת ממש כאן. לכן, אני מוציא את בועת האוויר.אני גם דוחף את החומר החוצה מהגשר, ואז מחבר מחדש את המזרק העליון. אני מוודא שהכל מחובר היטב, ולאחר מכן אעביר את התערובת ממזרק אחד לשני. בהתחלה זה קל, אך במהרה התערובת תהפוך לקשיחה.לכן, הלילה זה הופך לקשה יותר ואני לא רוצה לשבור את הגשר, אז אני פשוט מסובב את המזרקים שלי. לפעמים זה לוקח יותר זמן. זה משתנה מאמולסיה לאמולסיה.זה כנראה תלוי גם בטמפרטורה וברמת הלחות. אך אני חושב שהאמולסיה שלי מוכנה. היא סמיכה הרבה יותר ממה שהייתה כששפכתי אותה.זה לבן לגמרי. ויש רק פאזה אחת. לעולם לא אמורה להיות הפרדה של פאזת ה-ACO מהשמן.כעת התמיסון מוכן להזרקה. כדי להזריק אותו, אשתמש בנפח של 200 µL לכל חיה.ולשם כך אשתמש במזרקים של 3 mL. אני משתמש במזרקי Luer-lock כדי להבטיח שהמחט לא תצא ממקומה, כיוון שהתחליב עלול להיות סמיך מאוד וקשה להזרקה. לגבי המחטים שבהן אני משתמש, אני מנסה להשתמש במחטים הקטנות ביותר שעדיין מאפשרות לתחליב לעבור.ומצאתי ש-20 3G מספיקים עבור אמולסיה זו. עבור אמולסיות סמיכות יותר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במזרקים גדולים יותר. כעת, הדרך שבה אנו מבצעים זאת היא שאדם אחד מחזיק את החולדה והאדם השני מזריק.ולמען בטיחות מרבית, האדם המחזיק את החולדות, למרות שהחולדות הללו רגועות מאוד והורגלו לטיפול, משתמש בכפפות מגן עמידות לנשיכת מכרסמים; זאת כדי להבטיח בטיחות מקסימלית ולמנוע נשיכות. לאחר מכן, אני מעביר את כל האמולסיה למזרק זכוכית אחד ומנתק את מזרק הזכוכית הריק מהגשר. ובמקומו אני מחבר מזרק פלסטיק של 3 mL עם Locking Luer.כעת אני מעבירה יותר ממה שדרוש עבור תעלת אמולסיה אחת. אני דוחפת את בועת האוויר החוצה. מכיוון שאזריק 200 µL לכל תעלה, אני משאיר במזרק 300 µL.אני מנתק את הגשר, מחבר את המחט למזרק הפלסטיק שלי, ממלא את המחט ומוריד את הבוכנה ל-200 µL. כך אני מוודא שאין בועות אוויר. וכעת אנו מוכנים להזרקה.אנו רוצים לוודא שהחולדה אינה זזה. לכן, אנו תופסים את החולדה, אני מניח אצבע אחת מעל הכתף ואצבע אחת מתחתיה, וביד השנייה אני מחזיק את הרגליים האחוריות ואת הזנב. נבצע הזרקה באזור השוקיים (flanks) כאן, microliters בצד אחד ו-microliters בצד השני. בשבוע שעבר חיסנתי את החולדות עם אמולסיה המכילה KLH כאנטיגן.והיום אני עומד לבצע להם אתגר תוך-עורי בגב עם KLH, שהוא האנטיגן שלי, ועם o albumin, שהוא אנטיגן רלוונטי, אך כדי להיות מסוגל להזריק להם לגב באופן תוך-עורי, עלי לגזוז להם את הפרווה תחילה. לשם כך אני משתמש במסרק חשמלי פשוט. כן, אני מחליף מחטים בין חולדה לחולדה כדי לוודא שהמחט אינה קהה.זה מקל מאוד על ההזרקה התוך-עורית, במיוחד כאשר אני מזריקה נפחים קטנים של 20 µL מכל אנטיגן. כך שהזרקתי את שני האנטיגנים לכל החולדות, ואני אשאיר אותן בכלובים עד מחר. ומחר נוכל לראות דלקת.לכן, אתר ההזרקה יהיה אדום ונפוח, ונוכל למדוד את קוטר אתר הדלקת כמדד לדלקת. אתמול ביצעתי אתגר לחולדות בהזרקה תוך-עורית לגב עם האנטיגן הרלוונטי, KLH, ועם אנטיגן לא רלוונטי, שהוא אלבומין. כעת, 24 שעות לאחר מכן, אבחן את החולדות ואבדוק אם קיימת דלקת.לכן אני מצפה לדלקת רק באתר הזרקת ה-KLH, והדלקת תתבטא באדמומיות ובנפיחות. לאחר שאראה דלקת, אני אמדוד את האזור הדלקתי פשוט על ידי מדידת קוטר השטח. זהו אתר ההזרקה של ה-KH, וניתן לראות ללא קושי שיש כאן דלקת משמעותית.זה אדום מאוד בהשוואה לעור רגיל וזה נפוח. אם נסתכל כעת על האתר השני שקיבל אלבומין, ניתן לראות את נקודת ההזרקה ממש כאן, אך אין אדמומיות או נפיחות משמעותית. לפיכך, הביקורת השלילית עבדה.כעת אני אמדוד את גודל אתר הדלקת. לשם כך אשתמש בסרט מידה רגיל ואבצע מדידה במילימטרים. מידה זו היא 6 mm, ואני מבצע מדידה שנייה.זה שוקל חמישה מילימטרים. יש מעט מאוד אדמומיות, אבצע מדידה, אך היא בקושי מגיעה למילמטר אחד. אם כן, מה שהראיתי לכם כאן הוא כיצד להכין אמולסיה עם אנטיגן, כיצד לחסן חולדות באמצעות אמולסיה זו, ולאחר מכן להעבירהן אתגר שבוע לאחר מכן עם האנטיגן ששימש לחיסון וגם עם אנטיגן רלוונטי, וכיצד להוות ולהמדוד את מידת הדלקת בשימוש ובמעבדה של Chan.אנו משתמשים בטכניקה זו באופן שגרתי כבדיקה פשוטה למדידת ההשפעה של חוסמי תעלות אשלגן על דלקת בחולדות.

induction-monitoring-active-delayed-type-hypersensitivity-dth

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל זיכרון T (TEM) לימפוציטים. כאן אנו מדגימים כיצד להפעיל את אנטיגן ספציפי לערמונית תאים TEM, לגרום DTH המאמצת בחולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

כאן אנו להדגים שיטה גרימת הקלטה ההתקדמות של הצתה מאוחרת (DTH) סוג רגישות יתר באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של התגובה מפעיל T / תא זיכרון.

הדמיה מפעיל T זיכרון תאים באוזן לאחר אינדוקציה של DTH המאמצת

מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי...

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

כאן אנו מציגים שיטה חדשה כדי למדוד במדויק את הבדלי טמפרטורה גוף פסיבי אנפילקסיס מערכתית (PSA), מזון אלרגיה העכבר מודלים באמצעות מד חום אינפרא אדום... הליך זה שוכפל במדויק בתוצאות ה-PSA הקודמת.

מדידה טמפרטורת גוף העכבר באמצעות מד חום אינפרא אדום במהלך אנפילקסיס מערכתית פסיבי והערכה אלרגיה למזון

אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט...

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

למד אינדוקציה של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות Lewis באמצעות אמולסיית אנטיגן KLH ו-Freund's adjuvant. שיטה זו מאפשרת מדידת תגובה דלקתית באמצעות הערכת נפיחות לאתגר החיסוני.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

גלה סרטונים נוספים