אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עובדת במעבדה של ג'ורג' צ'נדי במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-UCI. היום אראה לכם כיצד להשרות DTH פעיל בחולדות.

לשם כך, אכין אמולסיה של KLH, המשמש כאנטיגן שלי, בתוך אדג'ובנט Freund. לאחר מכן, אזריק את האמולסיה לבסיס הזנב של חולדות Lewis. פעולה זו תגרום לחסינות של החולדות נגד KLH. לאחר שבוע, אבצע חשיפה חוזרת (challenge) של החולדות ל-KLH ואמדוד את תגובת ה-DTH על ידי מדידת הנפיחות.

זהו אתר האתגר, ואנו משתמשים בו במעבדה כדי לבחון את ההשפעה של חוסמי תעלות PO על תגובות דלקתיות כגון DTH. כאן נמצא העזר למערכת החיסון (adjuvant) הבלתי שלם שאשתמש בו כדי להכין את האמולסיה. ניתן להשתמש גם בעזר למערכת החיסון השלם.

כאן נמצא ה-KLH, שהוא האנטיגן שלי היום, ויש לי כאן תמיסה בריכוז של 2 mg/ml ב-PBS. אני אשתמש במזרק של 5 ml כדי להוציא את ה-incomplete trans adjuvant ולהעבירו למבחנה של 15 ml. לאחר מכן, אני אניח את המבחנה על הוורטקס ובזמן הערבוב, אוסיף את האנטיגן שלי טיפה אחר טיפה אל תוך ה-adjuvant.

לאחר מכן, אבצע ערבוב במערבל Vortex למשך חמש דקות נוספות. בסיום הפעולה, אמלא מזרק זכוכית של 5 mL בתערובת; יש להשתמש במזרק זכוכית מכיוון שהעזר (adjuvant) נוטה להמיס פלסטיק. מצאנו כי מזרקים של 5 mL הם האידיאליים ביותר ליצירת האמולסיה.

קטן יותר או גדול יותר אינם טובים באותה מידה. וברגע שמילאתי את המזרק בתערובת, אשתמש בגשר מתכתי זה כדי לחבר את מזרק הזכוכית הזה למזרק זכוכית אחר של 5 ml. לאחר מכן, אפעיל לחץ על המזרקים כדי שהתערובת תעבור ממזרק אחד לשני במהירות המקסימלית, עד שהיא תהפוך לקשיחה מאוד, כלומר עד שהאמולסיה תהפוך לקשיחה מאוד, ואז היא תהיה מוכנה להזרקה.

כעת אני אוסיף 2.5 mils של העזר (adjuvant). אני מזריק אוויר כדי להוציא את העזר בקלות רבה יותר, ולאחר מכן מעביר את כל העזר אל המבחנה שלי. כעת, אקח 2.5 mls מהם ואוסיף אותם פנימה בעזרת וורטקס (vortex).

מכיוון שהשתמשתי ב-2.5 mils מהעזר, אשתמש ב-2.5 mils מה-KLH שלי. כך, בעוד אני מוסיפה טיפה אחר טיפה, תראו שהתערובת תשנה את צבעה ותהפוך ללבנה. כעת הוספתי את כל האנטיגן אל העזר.

כעת אערבב את התערובת במכשיר הוורטקס למשך חמש דקות נוספות. מכיוון שאיני מעוניין להחזיק את המבחנה ביד במשך חמש דקות, אצמיד אותה למכשיר הוורטקס בעזרת סרט דביק. יש ליצור מערבולת בתוך המבחנה במהירות המקסימלית האפשרית, אך מבלי שהנוזל יגלוש החוצה. אשאיר את המבחנה כך למשך חמש דקות.

כך, חלפו חמש הדקות. אני הולך להפסיק כעת את הערבוב ב-vortex והתערובת שלי לבנה. לכן אני מוציא את המבחנה. אופס.

התערובת לבנה לחלוטין כעת, אך היא עדיין נוזלית למדי. מכיוון שרציתי מרקם סמיך יותר להזרקה, אני מעביר את כל התערובת למזרק זכוכית של 5 M.

המזרקים הללו עברו עיקור באוטוקלאב. אני מחבר מזרק שלם לגשר שלי, ומהמזרק השני אני מחבר רק את גוף המזרק.

אני משאיר את הבוכנה בחוץ ואז אני הולך למזוג את התערובת למזרק העליון. אני אעביר את הכל למזרק התחתון. לאחר מכן, עלי להוציא את בועת האוויר שנמצאת כאן.

אני הולך לנתק את המזרק העליון ולהוציא את בועת האוויר. קשה לראות את הבועה, אבל היא נמצאת ממש כאן. לכן, אני מוציא את בועת האוויר.

אני גם דוחף את החומר החוצה מהגשר, ואז מחבר מחדש את המזרק העליון. אני מוודא שהכל מחובר היטב, ולאחר מכן אעביר את התערובת ממזרק אחד לשני. בהתחלה זה קל, אך במהרה התערובת תהפוך לקשיחה.

לכן, הלילה זה הופך לקשה יותר ואני לא רוצה לשבור את הגשר, אז אני פשוט מסובב את המזרקים שלי. לפעמים זה לוקח יותר זמן. זה משתנה מאמולסיה לאמולסיה.

זה כנראה תלוי גם בטמפרטורה וברמת הלחות. אך אני חושב שהאמולסיה שלי מוכנה. היא סמיכה הרבה יותר ממה שהייתה כששפכתי אותה.

זה לבן לגמרי. ויש רק פאזה אחת. לעולם לא אמורה להיות הפרדה של פאזת ה-ACO מהשמן.

כעת התמיסון מוכן להזרקה. כדי להזריק אותו, אשתמש בנפח של 200 µL לכל חיה.

ולשם כך אשתמש במזרקים של 3 mL. אני משתמש במזרקי Luer-lock כדי להבטיח שהמחט לא תצא ממקומה, כיוון שהתחליב עלול להיות סמיך מאוד וקשה להזרקה. לגבי המחטים שבהן אני משתמש, אני מנסה להשתמש במחטים הקטנות ביותר שעדיין מאפשרות לתחליב לעבור.

ומצאתי ש-20 3G מספיקים עבור אמולסיה זו. עבור אמולסיות סמיכות יותר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במזרקים גדולים יותר. כעת, הדרך שבה אנו מבצעים זאת היא שאדם אחד מחזיק את החולדה והאדם השני מזריק.

ולמען בטיחות מרבית, האדם המחזיק את החולדות, למרות שהחולדות הללו רגועות מאוד והורגלו לטיפול, משתמש בכפפות מגן עמידות לנשיכת מכרסמים; זאת כדי להבטיח בטיחות מקסימלית ולמנוע נשיכות. לאחר מכן, אני מעביר את כל האמולסיה למזרק זכוכית אחד ומנתק את מזרק הזכוכית הריק מהגשר. ובמקומו אני מחבר מזרק פלסטיק של 3 mL עם Locking Luer.

כעת אני מעבירה יותר ממה שדרוש עבור תעלת אמולסיה אחת. אני דוחפת את בועת האוויר החוצה. מכיוון שאזריק 200 µL לכל תעלה, אני משאיר במזרק 300 µL.

אני מנתק את הגשר, מחבר את המחט למזרק הפלסטיק שלי, ממלא את המחט ומוריד את הבוכנה ל-200 µL. כך אני מוודא שאין בועות אוויר. וכעת אנו מוכנים להזרקה.

אנו רוצים לוודא שהחולדה אינה זזה. לכן, אנו תופסים את החולדה, אני מניח אצבע אחת מעל הכתף ואצבע אחת מתחתיה, וביד השנייה אני מחזיק את הרגליים האחוריות ואת הזנב. נבצע הזרקה באזור השוקיים (flanks) כאן, microliters בצד אחד ו-microliters בצד השני. בשבוע שעבר חיסנתי את החולדות עם אמולסיה המכילה KLH כאנטיגן.

והיום אני עומד לבצע להם אתגר תוך-עורי בגב עם KLH, שהוא האנטיגן שלי, ועם o albumin, שהוא אנטיגן רלוונטי, אך כדי להיות מסוגל להזריק להם לגב באופן תוך-עורי, עלי לגזוז להם את הפרווה תחילה. לשם כך אני משתמש במסרק חשמלי פשוט. כן, אני מחליף מחטים בין חולדה לחולדה כדי לוודא שהמחט אינה קהה.

זה מקל מאוד על ההזרקה התוך-עורית, במיוחד כאשר אני מזריקה נפחים קטנים של 20 µL מכל אנטיגן. כך שהזרקתי את שני האנטיגנים לכל החולדות, ואני אשאיר אותן בכלובים עד מחר. ומחר נוכל לראות דלקת.

לכן, אתר ההזרקה יהיה אדום ונפוח, ונוכל למדוד את קוטר אתר הדלקת כמדד לדלקת. אתמול ביצעתי אתגר לחולדות בהזרקה תוך-עורית לגב עם האנטיגן הרלוונטי, KLH, ועם אנטיגן לא רלוונטי, שהוא אלבומין. כעת, 24 שעות לאחר מכן, אבחן את החולדות ואבדוק אם קיימת דלקת.

לכן אני מצפה לדלקת רק באתר הזרקת ה-KLH, והדלקת תתבטא באדמומיות ובנפיחות. לאחר שאראה דלקת, אני אמדוד את האזור הדלקתי פשוט על ידי מדידת קוטר השטח. זהו אתר ההזרקה של ה-KH, וניתן לראות ללא קושי שיש כאן דלקת משמעותית.

זה אדום מאוד בהשוואה לעור רגיל וזה נפוח. אם נסתכל כעת על האתר השני שקיבל אלבומין, ניתן לראות את נקודת ההזרקה ממש כאן, אך אין אדמומיות או נפיחות משמעותית. לפיכך, הביקורת השלילית עבדה.

כעת אני אמדוד את גודל אתר הדלקת. לשם כך אשתמש בסרט מידה רגיל ואבצע מדידה במילימטרים. מידה זו היא 6 mm, ואני מבצע מדידה שנייה.

זה שוקל חמישה מילימטרים. יש מעט מאוד אדמומיות, אבצע מדידה, אך היא בקושי מגיעה למילמטר אחד. אם כן, מה שהראיתי לכם כאן הוא כיצד להכין אמולסיה עם אנטיגן, כיצד לחסן חולדות באמצעות אמולסיה זו, ולאחר מכן להעבירהן אתגר שבוע לאחר מכן עם האנטיגן ששימש לחיסון וגם עם אנטיגן רלוונטי, וכיצד להוות ולהמדוד את מידת הדלקת בשימוש ובמעבדה של Chan.

אנו משתמשים בטכניקה זו באופן שגרתי כבדיקה פשוטה למדידת ההשפעה של חוסמי תעלות אשלגן על דלקת בחולדות.