Name: Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו לבודד בלוטות משי מבטן עכבישי אלמנה שחורים באמצעות מיקרו-ניתוח מדויק. שיטה זו מאפשרת חקירה מולקולרית של ייצור סיבי משי ויישומים בביוטכנולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אפיון רוי NSF MCB-0950372 גרנט מולקולרית זכאי של משי עכביש האלמנה השחורה.

1. הרדמה העכביש ובידוד של הבטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכביש מתוך צנצנת זכוכית לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק (איור 1 א). בדרך כלל אנו אוספים עכבישים מ גזעים, מוסכים או שיחים הבית אותם במעבדה בצנצנות זכוכית. בגלל העכביש לא יכול לטפס את יריעת הניילון, הוא מספק שיטה יעילה להעביר את העכביש מתוך צנצנת זכוכית או קפה יכולים לתוך בקבוקון קטן לצורכי הרדמה. בעוד הטיפול עכביש בשלב זה, אתה צריך ללבוש שני זוגות של כפפות גומי, או כפפות גינון למטרות בטיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עכביש הוא בתיבה מצופה פלסטיק, הגישה עכביש מהישבן שלה ולתת את השקופית עכביש לתוך הבקבוקון תרבות הפלסטיק. לאחר שהעכביש נכנס הבקבוקון, מיד במקום תקע מעל (איור 1B). אנו ממליצים להשתמש בקבוקון כי הוא כ 101.6 מ"מ x 31.75 מ"מ (אורך x D). זו מקטינה את כמות הגז פחמן דו חמצני הדרוש לשלב הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכביש על ידי החדרת גז דו תחמוצת הפחמן ב 5-10 פאונד לאינץ' מרובע דקות 10 (תרשים 1C). זו כמות הגז רק לדפוק את העכביש החוצה סביב 5 דקות, אז לאחר הרדמה אתה חייב להמשיך מיד צעדים 1.4-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכביש מרדים לתוך צלחת לנתיחה קטנים להשתמש במלקחיים כדי למקם את הצד הגבי עכביש מעלה (שעון חול אדום פונה כלפי מטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ (גבעול צר המחבר את cephalothorax ואת הבטן) pedicel לשחרר את הבטן משאר העכביש (1D איור). חנות cephalothorax במקפיא לילה בצלחת פטרי וזורקים לאחר קפוא למחרת. היזהר בעת הזזת cephalothorax כמו ניבים של העכביש נמצאים על מגזר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדקו את הבטן לחומר Sylgard בצלחת לנתיחה קטנים באמצעות סיכה חרק אחד. הכנס את הסיכה חרקים דרך החור עשוי לקצץ את pedicel (איור 1E). זה יכול בקלות להיות מזוהה כאתר שבו הנוזל הוא העולה מתוך גזיר של pedicel. ודא spinneret (סוף היפוכו של pedicel) מכוונת כלפי מטה (קרוב אליך). </li></ol> 2. הסרת שלד חיצוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשון באמצעות שלד באמצעות זוג microscissors, החל החור מגזיר pedicel. גזור רוחבית עד הצד הגבי הוא הגיע משני הצדדים (איור 1F). בעזרת זוג מלקחיים, לקלף קטע האחורי שלד הקדמי והכנס סיכה השני במיקום זה. בעקבות הכניסה של סיכה השנייה, להפוך את מגש לנתח caudally (90 ° זווית) של חתכים לרוחב הראשוני ולהמשיך חיתוך עד spinnerets הם הגיעו (איור 1G). חתך זה יהיה מאונך או אנכי לחתוך לרוחב הראשונית. אין לחתוך את spinnerets כאשר חתך אנכי מורכב (יחסית האחורי אל שעון החול ויש לה מראה עגולה). אי להכניס את הסיכה השני יהיה תוצאה בבטן ספינינג כאשר חתכים אנכיים מבוצעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן טבול לנתח פתרון חיץ (0.1 מ כלוריד נתרן, 0.015 ציטראט M נתרן, 0.1% Diethyl Pyrocarbonate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל שלד הנותרים בחזרה החל החתך, הראשונית לרוחב. כאשר זו תושלם, רקמת שומן צריך להיות נראה בבירור (איור 1H). </li></ol> 3. בידוד של משי לייצור בלוטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש להתחיל מתגרה ממנו את שכבת השומן (איור 1H). השומן יהיה לבנבן למראה צהבהב. המשך עד שרוב השומן הוא להסיר את בלוטות משי גלויים לעין. בלוטת tubuliform מורכב משלושה זוגות, צינורות גליליים ארוכים מאוד, כי הם בשפע בחלל הבטן. Ampullate הגדולות, אשר נמצא בזוגות, הוא ampulla גדול, בצורת חצי סהר עם זנב ארוך דיסטלי מפותלים צינור הפרוקסימלי כי ירידה רוחב כפי גישות spinnerets של עכביש. Ampullate קטין דומה מאוד מורפולוגיה כדי ampullate העיקרי, אבל הוא קטן יותר באופן משמעותי. בלוטת flagelliform, גם המתרחשים בזוגות, הוא עגול multilobular עם גלילי קטן זיג זג צינור המשתרע לעבר spinnerets. בלוטת המצרפי (נמצא בזוגות) הוא גדול מאוד, בלוטת multilobular כי יש צינור ההפרשה גדול מאוד אשר גדול, אונות סדיר על זה. בלוטות aciniform להתרחש במספרים גדולים ומזכירים קצר, תחזיות אצבע קטנה. בלוטת pyriform היא בלוטה קטנה בבטן יש הרבה נדחס, צינורות גליליים המזכירים מאוורר עם הרבה צינורות הפרשה קטנה להאריך עד spinnerets. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים על הסרת בלוטות לפי הסדר הבא: tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, צבירה, aciniform, ואז pyriform (איור 2A-B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל tubuliform, להקניט את בלוטות אלה של שאר הבלוטות דואר - הם צריכים להיות יושב על גבי בלוטות אחרות (איור 2 א). ישנם שלושה זוגות של בלוטות tubuliform עכביש בודד. לאפשר להם לצוף חופשי אבל להישאר מחובר spinnerets שלהם על ידי צינורות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להקניט משם בלוטות ampullate הגדולות. ישנן שתי בלוטות ampullate העיקריים נוכח עכביש אחד. במהלך הליך ההסרה, לוודא הצינורות נשארים מחוברים בלוטות (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להקניט את שאר הבלוטות אחד מהשני, עובדים בזהירות כדי למנוע ניקוב של כל הבלוטות, בעיקר המצרפי בלוטות flagelliform. בלוטת כל צריך להיות חופשי צף כל הדרך אל נקודת היציאה שלה שלד ועד spinnerets. בלוטות אלה מצויים גם בזוגות. הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה. Ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, ובלוטות המצרפי נמצאים בזוגות. בלוטות aciniform ו pyriform להתרחש זוגות רבים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה על ידי spinneret. אנחנו בדרך כלל לאחסן בלוטות הרטובה, עם זאת, אנחנו לא להוסיף למאגר נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בלוטות יוסרו, למקם אותם לתוך סטרילי מראש שכותרתו 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. בלוטות הפרט מוצגים באיור 3A-G. זכור את בלוטות על הקרח ואז פלאש להקפיא אותם בחנקן נוזלי. בעקבות הקפאת פלאש בחנקן נוזלי, למקם אותם בבית -80 ° C לאחסון. </li></ol> 4. נציג תוצאות לאחר הסרת בלוטות שונות, זהירות קיצוניים צריך לקחת בזמן הטיפול flagelliform ובלוטות צבירה, כמו אלה שני מבנים ניתן ניקב בקלות פגום עם מלקחיים. יתר על כן, ראוי לציין כי מורפולוגית בלוטות flagelliform ו המצרפי נראים דומים מאוד לפני הסרת שלהם והם שזורים זה בזה לעתים קרובות אחד עם השני. כדי למנוע זיהום צולבות של רקמות אלו על ההסרה, מבתר צריך בזהירות להקניט את המבנים האלה בנפרד. בנוסף, על החשיפה הראשונית של משי לייצור בלוטות, הבלוטות aciniform ו pyriform יהיה הקשה ביותר מיד לדמיין בשל גודל קטן שלהם ואת המיקום האנטומי. לעתים קרובות יש נוכחות של ביצים רבות. יתר על כן, טיפול נוסף צריך להילקח בעת הסרת בלוטת pyriform, כמו רקמת זה דביק מאוד בדרך כלל לדבוק מלקחיים שלך. כאשר תהליך זה נעשה כראוי, ניתן להשיג את כל שבעת משי לייצור בלוטות מן עכביש בודד באופן מטוהרים. בדרך כלל, אפשר לשחזר את הכמויות מיקרוגרם של רנ"א הכולל חלבון מן לנתיחה עכביש בודד. דוגמה באמצעות RNA סך qPCR לבחון את רמות ה-mRNA של גן מוגבלת fibroin tubuliform, TuSp1, מוצג (איור 4). ניסויים נציג שכוללות חלבון lysates שנאספו הבלוטות למשל, פתרון העיכול tryptic ואחריו MS ניתוח (יכול לשמש גם לניתוח MS / MS) או ניתוח הרכב חומצות אמינו מוצג (איור 5-6, בהתאמה). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="איור 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="איור 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1e"> באיור 1. טיפול, הרדמה, והסרה של שלד חיצוני מהבטן של עכביש אלמנה שחורה נקבה. א) העברת העכביש לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק כדי להקל על העברת עכביש לתוך בקבוקון פלסטיק קטן. ב) Spider להציב לתוך בקבוקון פלסטיק עם תקע. ג) הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן. ד) הפרדת cephalothorax מן הבטן באמצעות microscissors. E) Immobilization של הבטן במגש לנתח באמצעות סיכות חרקים. F) צפו לאחר חתך לרוחב הוא עשה עם מספריים חלק שלד הוא התגלגל חזרה עם מלקחיים. G) חתכים נעשים בניצב לחתוך לרוחב הראשונית. ג) הסרת שלד חיצוני וחשיפה של שכבת שומן. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ויזואליזציה של שבע משי לייצור בלוטות שונות תוך פגע בבטנו של העכביש כמו גם הרקמות הסובבות. א) תמונות של tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, במצטבר, רקמות ampullate קטין בהגדלה של 12X. ב) תמונה של בלוטות aciniform ו pyriform בהגדלה של 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="איור 3א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="איור 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3E"> איור 3. תצלומים של שבעת משי לייצור בלוטות לאחר הוצאתם מן הבטן. כל התמונות שנתפסו בהגדלה 20X למעט aciniform ו pyriform בלוטות, אשר נעשו ב 40X. א) גדולampullate בלוטת; B) ampullate ראשיות ומשניות (צד ימין) לשם השוואה גודל: C) tubuliform: D) flagelliform; E) במצטבר; F) aciniform: G) pyriform. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הנציג תוצאות דפוס הביטוי של הגן משי, TuSp1, לאחר מדידות TuSp1 רמות ה-mRNA של משי לייצור בלוטות שונות (למעט בלוטת pyriform) באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) בידוד הבאים של רנ"א הכולל בלוטות. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. דוגמה של ניתוח MS של תמציות חלבון המתקבל בלוטת pyriform הבאים עיכול, פתרון tryptic. הערה: x2 מייצג 2 פי הגדלה של עוצמת הספקטרום. ספקטרום מסות פפטיד יון שמתאימים אזורי fibroin PySp1 מוצגים עם סמל #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. תוצאה אופיינית של פרופיל הרכב חומצות האמינו של חלבונים המופקים בלוטת tubuliform. הערה: ASX = ASP ו ASN; GLX = Glu ו Gln. צבע כחול משקף חומצות אמינו עם קבוצות שרשרת קוטבי צד ואילו צבע אדום מייצג את שאריות חומצת אמינו עם אי - קוטבי קבוצות שרשרת בצד.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המתודולוגיה שלנו microdissection של משי לייצור בלוטות מן עכביש האלמנה השחורה מציעה אמצעי יעיל להשגת מטוהרים לייצור משי בלוטות. והניתוחים ניתן להשלים 1.5-3 שעות, מניב סט שלם של שבע נפרדות לייצור משי בלוטות מ cobweavers. קבלת מטוהרים משי בלוטת דגימות מאפשרת לחוקרים את היכולת לבצע מגוון רחב של מחקרים ביוכימיים, כולל זיהוי של משי חדשים או חלבונים המלווה מאוחסן בתוך תוכן luminal הבלוטות באמצעות ספקטרומטריית מסה, ניתוח של רמות ה-mRNA של הגנים מתבטאת באופן סלקטיבי בבלוטות שונות ו culturi...

<table><tbody><tr><td>סודיום כלוריד</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0.1 M במים</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונאט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>סודיום ציטראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0.015 M במים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה מיקרוסקופית דיגיטלית</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>תוכנה - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>מספרי Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מפלדת אל-חלד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>סיכות לחרקים</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>סיכות לחרקים #2</td></tr><tr><td>צלוחיות דיסקציה קטנות או גדולות</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S or DD-90-S</td><td>קוטר 52 mm x גובה 18 mm (עומק Sylgard כ-6mm) או 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>מבחנות גידול של &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>גודל: קוטר 31.75 mm x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

עכבישים מודרנית ספין ביצועים גבוהים סיבי משי עם מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ללכוד, טרף תנועה והגנה על פיתוח 1,2 צאצאים. עכבישים לבצע משימות אלה על ידי ספינינג כמה סוגי סיבים שונים שיש להם תכונות מכניות שונות. התמחות כזו של סוגי סיבים אירעה דרך באבולוציה של משי בלוטות ייצור שונות, אשר לתפקד biofactories קטן. אלה מייצרים biofactories ולאחסן כמויות גדולות של חלבונים משי לייצור סיבים. באמצעות סדרה מורכבת של אירועים ביוכימיים, חלבונים אלה משי מומרים מנוזל לחומר מוצק על שחול. מחקרים הוכיחו כי מכונות משי עכביש חזקים יותר מפלדה גבוהה מתיחה 3. ניתוח להבין את הקשר בין המבנה והתפקוד של הנושאים עכביש המשי חשפו כי קורי עכביש מורכב בעיקרו של חלבונים, או fibroins, כי יש לחסום חוזר בתוך רצפי חלבונים שלהם 4. חתימות מולקולרית נפוצים התורמים לחוזק מתיחה מדהימה הרחבה של משי עכביש נמצאים פרומים דרך ניתוח cDNAs משי המתורגם. בהינתן מאפייני החומר יוצא דופן של עכביש המשי, מעבדות מחקר ברחבי העולם מתחרים להבין לחקות את תהליך ספינינג לייצר סיבי משי סינתטי עבור יישומים מסחריים, צבאיים ותעשייתיים. אחד האתגרים העיקריים ספינינג קורי עכביש מלאכותיים במעבדה מחקר כרוך הבנה מלאה של התהליכים הביוכימיים המתרחשים במהלך שחול של סיבי המשי לייצור בלוטות. כאן אנו מציגים שיטה הבידוד של שבע משי לייצור שונים מן הבלוטות cobweaving עכביש האלמנה השחורה, הכוללת את בלוטות ampullate ראשיות ומשניות [מייצרת גרר ופיגומים משי] 5,6, tubuliform [במקרה מסנתז משי ביצה] 7 , 8, flagelliform [פונקציה ידוע קלח-אורגים], במצטבר [עושה משי דבק], aciniform [מסנתז גלישת טרף במקרה האשכולות ביצה] 9 ו pyriform [מייצרת משי מצורף דיסק] 10. גישה זו מבוססת על הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן, ההפרדה הבאות של cephalothorax מן הבטן, והוא microdissection של הבטן כדי להשיג את משי לייצור בלוטות. בעקבות ההפרדה של משי לייצור בלוטות שונות, רקמות אלה ניתן להשתמש כדי לאחזר מקרומולקולות ביוכימיים שונים עבור ניתוחים שונים, כולל כמותי בזמן אמת PCR, הצפוני והמערבי סופג, ספקטרומטריית מסה (MS או MS / MS) מנתח לזהות חדש רצפי חלבון משי, לחפש חלבונים להשתתף במסלול הרכבה משי, או להשתמש רקמות שלמות על תרבית תאים או ניסויים היסטולוגית.

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

עכבישים מודרניים טווים סיבי משי בעלי ביצועים גבוהים עם מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, הכוללים תנועה, לכידת טרף והגנה על...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את שבע בלוטות המשי השונות מבטנו של העכביש, ולהשתמש ברקמות אלו למחקרים מולקולריים וביוכימיים. זאת מושג תחילה על ידי הרדמתו של העכביש. השלב השני של הפרוצדורה הוא הפרדת הראש, החזה והבטן, וקיבוע הבטן באמצעות סיכות לחרקים בתוך צלחת ניתוח קטנה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע חתכים בשלד החיצוני כדי לחשוף את בלוטות ייצור המשי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הסרת בלוטות ייצור המשי השונות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות שבלוטות ייצור המשי השונות מבטאות mRNA או חלבוני משי נבדלים באמצעות גישות מולקולריות וביוכימיות, כגון quantitative real-time PCR או ספקטרומטריית מסות, בהתאמה.שיטה זו תספק תובנה חשובה למחקר הביולוגיה של העכבישים על ידי חשיפת חלבונים המאוחסנים בתוך בלוטות ייצור המשי. לחלבונים אלו יש יישומים המשפיעים על התחומי הצבאי והרפואי, כמו גם יישומים מסחריים ותעשייתיים רבים. הרעיון לביצוע מחקר ספציפי זה עלה תחילה כאשר היה לנו צורך ללמוד יותר על החלבונים המאוחסנים בתוך בלוטות ייצור המשי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שלנקבאי האלמנה השחורה יש בטן גדולה מאוד, דבר המקל מאוד על בידוד בלוטות ייצור המשי. אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, כיוון שבלוטות אלו נקרעות לעיתים קרובות במהלך הנתיחה. כמו כן, ישנם מבנים אנטומיים מסוימים שקשה לבודד.הדגמה חזותית היא קריטית עבור נתיחה טובה. את הפרוצדורה ידגימו Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame ו-Y Shaw. לפני תחילת הנתיחה, הכינו 500 milliliters של תמיסת בופר לנתיחה המורכבת מ-0.1 molar sodium chloride, 0.015 molar sodium citrate ו-0.1% ethyl bicarbonate.לאחר מכן, הכינו קופסת קרטון עם ריפוד פלסטיק להכלה של העכביש כדי למנוע ממנו לזחול החוצה. בדרך כלל אנו משיגים עכבישי אלמנה שחורה מערימות עצים, שrubs או ממוסכים, ומשתמשים בצנצנות זכוכית כדי לשכן אותם במעבדה. לאחר ההשגה, העבירו את העכביש מצנצנת הזכוכית אל הקופסה תוך כדי טיפול בעכביש.לבשו שני זוגות של כפפות לטקס או כפפות גינון למען הבטיחות. לאחר מכן, בעזרת מבחנה קטנה מפלסטיק, התקרבו לעכביש מאחור, החליקו את העכביש לתוך המבחנה ואטמו אותה מיד. הכניסו גז פחמן דו-חמצני למבחנה בלחץ של 5 עד 10 PSI למשך 10 דקות כדי להרדימ את העכביש; את הניתוח הראשוני של הבטן מה-cephalic thorax יש לבצע בתוך חמש דקות, בעוד העכביש עדיין תחת הרדמה.הנח את העכביש המורדם בתוך צלחת ניתוח קטנה. גזור את הפדסטל (pedestal), הגבעול הצר המחבר בין ראש-חזה לבטן, כדי לשחרר את הבטן. ראש-חזה מכיל את ניבי העכביש ויש להשליכו באופן הולם.הוצא בזהירות את הראש והחזה (cephalic thorax) שהונחו בצלחת פטרי והקפא למשך לילה. לפני ההשלכה, אתר את החור בבטנו של העכביש שנוצר מהגזירה של תא ה-pedes, על ידי זיהוי האתר ממנו נוזלים יוצאים מהבטן. באמצעות סיכה אחת לדיסקציה, הכנס את הסיכה דרך החור אל תוך הבטן כדי לקבע את הבטן למגש הדיסקציה, תוך הכוונת העכביש כך שה-pedestal יהיה רחוק ככל האפשר מהמבצע, וה-spint יהיה קרוב ביותר אליו.באמצעות זוג מיקרו-מספריים, התחילו בחור מתאי הרגליים (pedes cell) וגזרו לצדדים בכל צד דרך השלד החיצוני עד להגעה לצד הגבי. באמצעות פינצטה, קלפו לאחור את מקטע השלד החיצוני הקדמי והחדירו סיכה שנייה במיקום זה. לאחר מכן, סובבו את מגש הניתוח בזווית של 90 מעלות ביחס לחיתוכים הצדיים הראשוניים.המשיכו בחיתוך עד להגעה לספינטים (spints). החתך יהיה בניצב או בצורה אנכית לחתך הצדי הראשוני. הספינטים נמצאים מתחת לצורת שעון החול ונראים כמעגלים.אין לחתוך דרך ה-spints בעת ביצוע החתך האנכי. טבול את הבטן בתמיסת בופר לדיסקציה. קלף את שלד החוץ שנותר, החל מהחתך הצדי הראשוני.עם השלמת שלב זה, הרקמה השומנית, בעלת מראה לבנבן עד צהבהב, צריכה להיות גלויה בבירור באמצעות פינצטה. התחילו בהפרדה עדינה של שכבת השומן עד להסרה של מרבית השומן, כך שבלוטות המשי יהיו גלויות בבירור. אם קיימות ביצים, יש להסירן.בשלב זה, נתחו את הבלוטות בסדר הבא: הצורה הצינורית (Tubular form), הצורה של השוטים הראשיים (major ate flagella formm), צורת המקבץ של השוטים המשניים (aggregate minor ate assif, formm), ולאחר מכן הצורה האגסית (piriform). נתאר כל בלוטה לפי סדר הניתוח.הבלוטות בעלות הצורה הצינורית ממוקמות מעל כל שאר הבלוטות ובעלות שלושה זוגות של צינורות גליליים ארוכים מאוד השכיחים בחלל הבטן. הפר את הבלוטות הללו בזהירות משאר הבלוטות. אפשר להן לצוף בחופשיות, אך השאר אותן מחוברות ל-spinner reds באמצעות התעלות שלהן.בשלב הבא, הפרידו בעדינות את שתי בלוטות ה-ampule העיקריות הנמצאות גם הן באגזי פירות. בלוטות אלו הן גדולות ובעלות צורה של חרב עם זנבות דיסטליים ארוכים ומפותלים ופתחים פרוקסימליים שהולכים ומיצרים. כאשר מגיעים לספינטים של העכביש, הסירו את בלוטות ה-ampule העיקריות והעבירו אותן למבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות בנפח 1.5 milliliter.הנח את הגביות על קרח לאחר הוצאתן. לאחר מכן, הסר את בלוטת ה-flagella formm. בלוטת ה-flagella formm קיימת גם באגס.מדובר במבנה רב-סעילי עם צינור זיג-זג גלילי קטן הנמתח כלפי מטה לעבר ה-spints לאחר הסרתם והנחתם על קרח. בעקבות זאת, נמצא כי ה-minor alet דומה מאוד במורפולוגיה ל-major alet, אך קטן ממנו באופן משמעותי. בלוטת האגרגציה (aggregate gland), הנמצאת בזוגות, היא גדולה ורב-סעילית, ויש לה צינור הפרשה גדול מאוד עם אונות גדולות ולא סדירות.בלוטות ה-sino formm מופיעות במספר רב ודומות לבליטות קצרות וקטנות דמויות אצבע. בלוטת ה-piriform היא הבלוטה הקטנה ביותר בבטן, ובها תעלות גליליות דחוסות רבות הדומות למניפה עם תעלות הפרשה קטנות רבות הנמתחות מטה אל ה-spints. כעת, כאשר בלוטת ה-tubular formm היא הבלוטה היחידה שנותרה צפה באופן חופשי, הסר אותה על ידי צביטה של התעלה עם פינצטה ומשיכה זהירה עד שהיא ניתקת מנקודת היציאה ליד ה-spint. לאחר הניתוח, בצע הקפאה מהירה (flash freeze) לכל הבלוטות שנוצלו על ידי הנחת המבחנה בתוך חנקן נוזלי עד להקפאה, ושמור בטמפרטורה של 80°C- לאחסון.לחלופין, ניתן להקפיא את הבלוטות מיד לאחר הסרתן באופן נפרד במהלך הליך הניתוח. איור זה מציג את בידוד רמות ה-mRNA של הגן של המשי, TUSP one, בבלוטות השונות המייצרות משי, למעט בלוטת ה-piriform, באמצעות אנליזת quantitative real-time PCR לאחר בידוד RNA כולל מהבלוטות. בלוטות ה-tubular formm מכילות את השפע הרב ביותר של TUSP one mRNA.איור זה מציג תוצאה טיפוסית של פרופיל הרכב חומצות האמינו של החלבונים שחולצו מבלוטת ה-tubular formm. צבע כחול משקף חומצות אמינו עם קבוצות שרשרת צד פולריות, בעוד שצבע אדום מייצג שאריות של חומצות אמינו עם קבוצות שרשרת צד לא פולריות. איור זה מציג ניתוח ספקטרומטריית מסות של תמציות חלבון שהתקבלו מבלוטת ה-piriform לאחר insolution triptych.במקרה זה, הכפל בשניים מייצג הגדלה פי שניים של עוצמת הספקטרום. מסות של יוני פפטידים בספקטרום המסומנות בסימן הסולמית מעידות על פפטידים שנגזרו מ-silk fibroin PYSP one לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בקהילת ה-soak biology.היא שימשה לחקר תהליכים כימיים ומולקולריים המעורבים בייצור סיבי השריה, הרכבת סיבי משי ואקסטרוזיה. אם טכניקה זו מבוצעת נכון, ניתן להשלימה תוך שעה וחצי עד שלוש שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב ללבוש שני זוגות של כפפות עד להסרת ניבי העכביש.בסיום שיטה זו, ניתן להשתמש בבלוטות המייצרות משי כדי להפיק RNA וחלבון. חומרים אלו יכולים לשמש ליישומים המשכיים כגון quantitative real-time PCR, וכן לספקטרומטריית מסות. המידע שניתן יהיה לאסוף ממחקרים אלו יעזור לנו להבין טוב יותר את תהליך הרכבת המשי ואת מסלול פליטת המשי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים את שבע בלוטות ייצור המשי השונות מנקבת העכביש האלמנה השחורה.

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

בלוטות צמחים הן מבנים מיוחדים האחראים על ביוסינתזה והפרשה של תרכובות רבות המעורבות באינטראקציות עם הסביבה הביוטית. כדי לאפשר מחקרים על תכונותיהם המולקולריות והביוכימיות, הוקמה טכניקת מיקרו-הכנה מכנית על מנת לבודד בלוטות בודדות פעילות מטבולית, כאן מהצמח הטורף Nepenthes.

בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, Nepenthes

מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים.

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

פרוטוקול microfluidic ספינינג, מיקרו אפיון מחדש fibroin משי monofilament מוצג.

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

למרות חרקים רבים, המאפיין פשפשים (Insecta: פשפשאים) הם ארסיים, קומפוזיציה הארס שלהם, הפונקציות של רעלים הארס שלהם ידועות בעיקר. פרוטוקול זה מתאר שיטות למסוק heteropteran venoms עבור נוספות אפיון, באמצעות electrostimulation, הטרדה, ניתוח בלוטת.

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Hypopharyngeal בלוטת acinus גודל הוא מדד חזקים של אחות דבש דבורים תזונה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לנתח, מכתים, הדמיה של מדידת האחות דבורה hypopharyngeal בלוטת acini.

מדידת Hypopharyngeal בלוטת Acinus בגודל דבורת הדבש (בומבוס) עובדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מסיסים במים רקומביננטי עכביש משי פתרונות חלבון וצורות חומרים שניתן ליצור מאותם פתרונות.

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

למדו לבודד בלוטות משי מבטן עכבישי אלמנה שחורים באמצעות מיקרו-ניתוח מדויק. שיטה זו מאפשרת חקירה מולקולרית של ייצור סיבי משי ויישומים בביוטכנולוגיה.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

גלה סרטונים נוספים