Name: Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו פרוטוקול יעיל להקפאת בלוקים של רקמת קליפת המוח לשימור ארוך טווח בחנקן נוזלי. השיטה מאפשרת ייצור תרביות עצביות איכותיות מרובות סוגי תאים לחקר נוירוביולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר הזדמנויות לתואר ראשון ב UCI (AR ו-SP) ומענקים ממדינת קליפורניה יוזמת מחלת אלצהיימר לבין המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב להעניק אין. HD38466, מחקר מחלת האלצהיימר מרכז המענק לא. AG16573 (JB)

1. Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים חומר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שנאגרו 1X של האנק תמיסת מלח (HBSS) על ידי דילול לפתרון מניות 10X במים סטריליים (01:09). חנות HBSS ב 4oC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% בינוני DMSO הקפאת ידי דילול DMSO ב HBSS (01:09). המדיום הקפאת צריכה להיעשות טרי לפני cryopreservation ומאוחסן על 4oC עד צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין גילוח פלדה משמשת קיצוץ שיטתי של הרקמה. לפני השימוש, סכין הגילוח הוא מעוקר ידי והשקיעה אתנול 70% עבור שעות 2. מיד לפני עיבוד רקמות, יש לשטוף את הסכין עם מים סטריליים 3 פעמים. הימנע עוזבים את הסכין במים סטריליים בסכום מופרז של זמן, כפי שהוא נוטה חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל הקפאה Nalgene טעון cryovials (2.5 מ"ל) ולאחר מכן הביא לתוך ארון ביולוגי סטרילי. 1 מ"ל של מדיום הקפאת צונן מתווסף בקבוקון אחד. מיכל הקפאה ממוקם אז לפחות 2 שעות בשעה 4oC. </li></ol> ניקוי, קיצוץ, ועל הקפאת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת המוח להיות קפוא הוא ניקה של קרום קרום המוח וכלי הדם. השתמש טיפים מחט סטרילית כדי להסיר בזהירות פסולת הרקמה תוך כדי עבודה על גבי שקית קוביות קרח. רקמה נוקה יש לשטוף קלות HBSS קר הועבר בצלחת פטרי חדש קיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על גבי שקית קוביות קרח, השתמש סכין גילוח לעקר במהירות כדי לקצוץ את הרקמה לתוך כ 1 3 בלוקים מ"מ. עבודה עם מנות קטנות של רקמה לנקות את תוצאות זמן שליטה טובה יותר על הליך החיתוך, וכתוצאה מכך גדלים גוש אחיד יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף רקמה קצוץ לתוך 50 מ"ל של HBSS בצינור חרוטי 50 מ"ל. בעדינות ולשטוף את צלחת פטרי עם HBSS כדי לאסוף כל גושי רקמה הנותרים. אפשר גושי רקמה לרדת לחלק התחתון של הצינור, יצירת רקמה ארוזים בצורה רופפת לחסום גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הרקמה שיקוע, להביא את מיכל הקפאה מקורר בעבר cryovials לתוך ארון הבטיחות הביולוגית. פותח את הפקק כל cryovials כדי לזרז את התהליך של הוספת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל את גושי רקמה התיישבו, לשאוב בעדינות HBSS עודף, משאיר שכבה דקה מאוד של המדיה מעל גלולה. צנטריפוגה אינה מומלצת, מכיוון שהדבר יגרום גושי רקמה לדבוק זה בזה, הולכת ופוחתת באופן משמעותי את יעילות מקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לאסוף 200 μL מהחלק התחתון של הרקמה רפויה לחסום גלולה באמצעות קצה פיפטה עם פתחים רחבים (לחתוך קצה במספריים סטריליות). העברת את החומר cryovial אחד לעבור הרקמה, הבא שוב איסוף מהחלק התחתון של גלולה. זה חיוני כי ההליך כולו הקצאת רקמה לא לוקח יותר מ 3-4 דקות לכל מיכל ההקפאה. הדבר מבטיח כי רקמות חשוף DMSO לתקופה רק זמן קצר לפני ההקפאה. לאחר העברת רקמה על צלוחיות, במקום מיכל הקפאה במקפיא-80oC במשך לפחות 4 שעות. לחלופין, מיכל הקפאת ניתן להשאיר ולינה -80 מעלות. חזור על תהליך זה עבור כל מיכלי הקפאה הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את cryovials ממיכל ההקפאה (ים) cryobox ובמקום במיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 2. הפשרה ו culturing של בלוקים קפואים רקמות קליפתיים חומר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני ההפשרה דגימות רקמה, poly-L-ליזין צלחות פטרי מצופה / coverslips מוכנים. באופן כללי, עבור נוירונים בקליפת המוח אנו מכינים מאכלים מצופה 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​או 1 מ"ג / מ"ל. הוסף מספיק poly-L-ליזין פתרון (שנעשו חיץ borate) באופן מלא לכסות את החלק התחתון של המנה. אם coverslips זכוכית נדרשים, להבטיח כי הם שקועים לחלוטין מתחת פתרון poly-L-ליזין. דגירה של לפחות 12 שעות. לפני השימוש, לשטוף ביסודיות את הכלים עם כמות ליברלית של מים סטריליים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS חם משמש לניקוי הרקמות מופשר, וכן לנתק את הרקמה השעיות לתוך התא. נפח HBSS צורך ישתנה בהתאם לכמות רקמות להיות מופשר, אבל בדרך כלל 1 cryovial מדללים ב 50 מ"ל של HBSS ויהיה ניתק ב 10 מ"ל של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי של Dulbecco בינוני הנשר עם 10% ברזל בתוספת שור עגל בסרום (EBS) ו -1% אנטיביוטי / antimycotic (AA) תערובת (DMEM (++)) צריך להיות ממוקם בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ציפוי (NB (+++)) צריכה להיעשות טרי לפני השימוש. בינוני זה הוכן על ידי הוספת 1% אנטיביוטי / antimycotic בתוספת B27 ותוספי N2. </li></ol> הערה: שמות מדיה שצורפה צלבים (+) מצביעים על הכללת תוספי הרכב הבסיס של התקשורת. בטקסט הזה, DMEM (+ +) מציין DMEM EBS פלוס 10% פלוס 1% AA, בעוד NB (+++) מציין NB plלנו 1% AA פלוס B27 פלוס N2. הפשרה ו culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את cryovials מהטנק חנקן נוזלי במהירות להפשיר על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד רק קרח גלולה קטנה הוא ציין את הבקבוקון בתוך התוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את תוכן הבקבוקון 50 מ"ל של HBSS חם צינור חרוטי. השתמש קצה פתח רחב בעדינות כדי לסלק כל גושי רקמה שנותר תקוע cryovial. הפוך את הצינור 3-4 פעמים ולאפשר הרקמה לאט לאסוף בתחתית. רקמות צריכה להתיישב מהר, אבל אם בלוקים קטנים מדי זה לא יכול להתרחש ואור צנטריפוגה (~ 200 x ז) ​​מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב HBSS עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל של HBSS חם רקמת גלולה ו 300 μL של טריפסין 0.25% ו 50 μL של DNAase. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 5 דקות, ולאחר מכן מקום שייקר מסלולית מוגדר 80 סל"ד ו - 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, להביא את גושי רקמה לתוך ארון בטיחות ביולוגית להשתמש פיפטה 10 מ"ל בזהירות להתסיס את גושי רקמה עד ההשעיה תא מעונן נוצר. לבטל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) כדי השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ניתק ב 1200 x g עבור 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) ולכמת מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים פולי-L-ליזין מנות מצופה. בדרך כלל, מנה 60 מ"מ יהיה מצופה 1x10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף צלחת / coverslips במשך שעה בערך 1 ב בתרבית רקמה חממה. מומלץ לעקוב אחר התקדמות מצורף צלחת אחת כל 10 דקות עד מצורף יעיל הוא ציין. ואז, בעדינות להחליף את מדיום עם טרי DMEM (++). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף את DMEM (+ +) עם חם NB (+++). שינויים בינוני חלקית (50%) מתבצעות כל 5 ימים עם טרי NB (+++). תרבויות בריא בדרך כלל מראים סימנים של בידול וצמיחה של תהליכים לאחר 24 שעות. בתנאים אלה, וביצוע שינויים בינוני חלקית כל 4-5 ימים, התרבויות יכול להישמר במשך תקופות ממושכות של זמן עד 4-6 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדור של תאים עצביים מבשר (NPCs), פרוטוקול דומה משמש למעט שאחרי צנטריפוגה, DMEM ללא EBS משמש. תאים הם מצופה ב-T-25 צלוחיות ב DMEM/F12 (01:03) בתוספת B27 ו EGF (20 ng / mL) כדי לאפשר היווצרות של neuropheres. כדי לבדל את NPCs, neurospheres הם מצופה על laminin (10 UG / mL) coverslips מצופה DMEM/F12 (01:03) בינוני בתוספת N2. </li></ol> 3. נציג תוצאות תרבויות בריא תציג צמיחה בידול משמעותי לאחר 5 ימים שלאחר ההפשרה ובדרך כלל לייצב את הצמיחה שלה על ידי 10 ימים (איור 1). מכתים Immuncocytochemical של תרבויות אלה מגלה האסטרוציטים רבים (איור 2 א) ו נוירונים (תרשים 2B) הן האדם חולדה תרבויות עצבי ראשוני. פרוטוקול זה מתאים גם לדור של NPCs כמו ריחוף ללא neurospheres (איור 3A), אשר בתנאים הבחנה, תוצאה בתרבויות באיכות גבוהה מעורבת (איור 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בתרביות תאים של רקמות קפוא קליפת המוח האנושי. קפוא חוסם רקמת קליפת המוח האנושי הם מופשרים, מצופה על poly-ליזין coverslips מצופה גדל במשך 10 ימים. ביום 5 הרחבת התא ניכר וביום 10 confluency מושגת. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מכתים Immunocytochemical של תרביות תאים. (א) תרבויות הוכתמו החלבון סמן גליה גליה חומצי fibrillary (GFAP, חיצים עבה). (ב) נוירונים התגלו עם עצבי בטא טובולין סמן III (TIII, חיצים דקים). (ג) הן האדם בתרבויות עכברוש להראות גליה שפע נוירונים לאחר 10 ימים בתרבות. נוגדנים העיקרי: עכבר אנטי GFAP (1:1000) ו הארנב נגד TIII (1:1000). נוגדנים משני: אנטי עכבר Alexa 594 (1:500) ואנטי ארנב Alexa 488 (1:500). מכתים גרעינים: Hoestch כחול (1:1000). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. דור neurospheres. (א) הרקמה הקפואה היה מעובד כמתואר לעיל ואיפשר להפיץ כמו neurospheres. (ב) Neurospheres היו על coverslips מצופה זכוכית בתנאים המבדילים גדל במשך 10 ימים, וכתוצאה מכך התאים נודדות הרחק neurosphere. (ג) שני נוירונים האסטרוציטים נמצאים בשוליים של הרחבת neurosphere מבדל. Counterstaining גרעיני, נוגדנים ראשוניים ומשניים לשמש באיור 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Cryopreservation מציע הזדמנות לבנק היקר דגימות רקמות המוח לשימוש עתידי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוטה אך יעילה ליצור שתי נוירון מועשר תרבויות תאים עצביים מאבני מבשר קפוא רקמות המוח. הליך זה חסכוני ימנע את העלויות של טכניקות מסורתיות cryopreservation לנצל יותר יקר שיעור שבשליטת מקפיאים. הפרוטוקול מאפשר לדור של תרבויות העצבית קיימא שלאחר ההפשרה על ידי מתן אמצעי מהיר אך יעיל להקפיא בלוקים רקמות. תהליך הקפאה כולו יכול לקחת קצת כמו 20 דקות. בנוסף תרבויות עצבי ראשוני, תוך שימוש בשיטה זו רקמת בלוקים יכולים גם להיות מופשר ליצור NPCs גדל כמו neurospheres צף חינם. בהקשר זה, היעדר נסיוב במדיום הקפאת שלנו מבטיחה כי התאים נשמרים במצב לא מובחן. בתנאים הבחנה, המיוצר neurospheres מהרחבת להראות קפוא רקמות שיעורי הבחנה דומה מאוד neurospheres שנוצר מרקמות טריות.

<table><tbody><tr><td>מדיום Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>High gluclose 1X</td></tr><tr><td>סרום עגל בקר (Bovine calf serum) מועשר</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>עבור מדיום תרבית</td></tr><tr><td>מדיום Neurobasal-A (1X), נוזלי</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>תוסף למדיום Neurobasal</td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>תוסף למדיום Neurobasal</td></tr><tr><td>טריפסין (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>דיסוציאציה של רקמה</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease 1 מבלוטת הלבלב של בקר (DNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>דיסוציאציה של רקמה</td></tr><tr><td>תמיסת מלחים מאוזנת של הנקס (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065</td><td>ניקוי רקמה, שטיפות ומדיום הקפאה</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine- 500mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>מצע להצמדה של תאי עצב</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X), נוזלית</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>למניעת זיהומים</td></tr><tr><td>טיפי פפט פה רחב (1-200 ul)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>למניעת מאמץ גזירה לתאים</td></tr><tr><td>טיפי פפט מדורגים (101-1000 ul)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>מחטי הדרכה מדויקות 21 G1</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>לניקוי רקמה</td></tr><tr><td>פפט 10 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>ארוז בנפרד</td></tr><tr><td>מבחנות 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>להב סכין גילוח בעל קצה יחיד</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td> לקיצוץ רקמה</td></tr><tr><td>צלחת פטרי פוליסטירן 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>עבור תרבית כללית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי פוליסטירן 100 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>לניקוי רקמה</td></tr><tr><td>קופסה קריוגנית</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>מכל הקפאה</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>מבחנות קריוגניות 2.0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>עבור מדיום הקפאה</td></tr><tr><td>אתנול 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>לעיקור להב הסכין</td></tr></tbody></table>

cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

במחקר זה, אנו המתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור cryopreservation המוצלחת הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. עבור פרוטוקול זה המדיום הקפאת בשימוש הוא sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) מדולל פתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS). בלוקים של רקמת קליפת המוח מועברים cryovials המכיל את המדיום מקפיא קפוא לאט ב -1 ° C / min במיכל שיעור שבשליטת מקפיא. לאחר ההפשרה עיבוד ניתוק של גושי רקמה קפוא המיוצר באופן עקבי העצבית מועשר תרבויות אשר הציגו צמיחה מהירה מדלקת עצבים במהלך 5 הימים הראשונים בתרבות הרחבה משמעותית של רשת נוירונים בתוך 10 ימים. מכתים Immunocytochemical עם חלבון סמן astrocytic גליה חומצי fibrillary (GFAP) ואת עצבי בטא טובולין סמן המעמד השלישי, גילה מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתרבויות. הדור של תאים עצביים תרבויות מבשר לאחר רקמות לחסום דיסוציאציה הביא המתרחב במהירות neurospheres, אשר הפיק מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתנאים מבדל. זה פרוטוקול cryopreservation פשוט מאפשר לשימור, מהיר ויעיל, ולא יקר של גושי רקמה קורטיקלית במוח, המעניק גמישות משופרת עבור דור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

במחקר זה, אנו מתווים פרוטוקול סטנדרטי להקפאה (cryopreservation) והפשרה מוצלחים של בלוקים של רקמת מוח קורטיקלית, במטרה להפיק...

שלום, שמי אלן ואני מהמעבדה של ד"ר Horney Lu באוניברסיטת קליפורניה אירביין, במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות. ואני בוב. היום, ד"ר Haro יציג בפניכם פרוטוקול מהיר, יעיל ואמין להקפאה שגרתית (cryo preservation) של בלוקים מרקמת קליפת המוח, לצורך יצירת תרביות ראשוניות של נוירונים באיכות גבוהה.אם כך, נתחיל. רקמה נקייה וחתוכה מוכנסת למבחנות הקפאה (cryo vials) המכילות תוך כדי תהליך Medium הקפאה 10%TMSO.מבחנות קריו נטענות לתוך מכל הקפאה ומונחות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. לאחר מכן, מבחנות הקריו הקפואות מועברות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. לצורך תרבית, מבחנת קריו של AC מופשרת באמבט מים חמים ונשטפת ב-HBSS חם כדי להסיר את ה-DMSO שנותר.מוסיפים HBSS טרי יחד עם trypsins לצורך דיסוציאציה, ולאחר מכן מוסיפים DMM עם 10% EBS. כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית של הדיסוציאציה, מרכזים את התאים באמצעות ספינטדאון ואת המשקע מרסספנדים ב-DMM טרי בתוספת 10% EBS וזורעים בצלחות מצופות polylysine. לאחר 24 שעות, מחליפים את ה-DMM במצע neuro basal מועשר, ומגדלים את התאים למשך 10 ימים.פרוטוקול זה משתמש בלהב תער מפלדה לקיצוץ של רקמת קורטקס לפני השימוש. יש לעקר את התער ב-70% ethanol למשך שעתיים לפחות. תמיסת מלח רב-ערכית של Hank's בריכוז 1x HBSS מוכנה על ידי דילול של תמיסת מלאי בריכוז 10x במים סטריליים; לאחר מכן, את ה-1x HBSS שומרים על קרח או בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד הרקמה.דימתיל סולפוקסיד או DMSO משמש כחומר קריו-פרוטקטיבי (מגן קור) בתמיסת ההקפאה. פרוטוקול זה משתמש בדילול של 10% (נפח לנפח) של DMSO ב-1X-H-B-S-S-D-M-S-O, אשר יש לערבב באופן מלא לפני אחסון בטמפרטורה של 4 °C. מיכל הקפאה של Nalgene משמש לשליטה על קצב ההקפאה של הדגימות.מכלי ההקפאה נטענים במבחנות קריו בנפח 2.5 מיליליטר שסומנו מראש. מומלץ גם לסמן את מכלי ההקפאה עצמם אם ישנם יותר ממכלי אחד, ולציין את המכל התואם על המבחנה. ה-10% DMSO שקולל מראש, מדיום ההקפאה ומכלי ההקפאה מועברים אל תוך קבינה בטוחה ביולוגית סטרילית.כאן מוסיפים לאט מיליליטר אחד של תמיסת הקפאה לכל אחד ממבחנות הקריו. לאחר שווידאנו כי הפקקים סגורים היטב, מניחים את מכל ההקפאה עם המבחנות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך שעתיים לפחות רגע לפני עיבוד הרקמה. יש לשטוף ביסודיות את להב התערה שעבר עיקור קודם לכן: שלושה שטיפות, כל אחת למשך שלוש דקות.שימוש במים סטריליים אמור להספיק להסרה של שאריות אתנול. הליך שטיפה זה צריך להיות מהיר, שכן התער אמור להתרחשן מעל טבילה ממושכת ובמים סטריליים. לפני הניקוי, יש להניח את הרקמה על מאre קרח.שטפו קלות עם cold one X-H-B-S-S כדי להסיר שאריות צפות. השתמשו במחטים סטריליות כדי לנקות מחתיכות הרקמה ממברים וכלי דם שנותרו. יש לנקוט משנה זהירות כדי לשמור על השלמות המבנית של הרקמה במהלך הניקוי.ככל שפעולה זו תגבר, יעילות הקיצוץ של רקמה נקייה תהיה שונה באופן ניכר מזו של רקמה גולמית, ומרבית הממברנות או כלי הדם צריכים להיות מוסרים. ברגע שהרקמה ננקתה ונשטפה, ניתן להתחיל בקיצוץ. חשוב לבצע חיתוכים נקיים של הרקמה ליצירת קוביות בגודל של כ-1 mm³.בלוקים גדולים מדי גורמים לירידה בתשוא התאים בעת ההפשרה. עם זאת, בבלוקים קטנים יותר, יש להימנע מעיבוד יתר. ניתן לאסוף רקמה קצוצה באמצעות פיפט אוטומטית ומעט cool one X-H-B-S-S.יש להקפיד לשטוף את הצלחת בעזרת HBSS כדי להחזיר את כל הרקמה שנאספה. לאחר מכן, מוסיפים את הרקמה לנפח גדול של one X-H-B-S-S ומניחים לה לשקוע לתחתית, כך שייווצר pellet דחוס באופן רופף. פעולה זו מנקה שאריות פסולת שעלולות להיות נוכחות. בעוד הרקמה שוקעת ב-HBSS, יש להוציא את מכל ההקפאה והמבחנות לקריו (cryo vials) שהוקפאו מראש, לפני חלוקת הרקמה.יש לוודא כי כל המבחנות פתוחות כדי להאיץ את תהליך מילוי הרקמה. יש להגביל את החשיפה ל-DMSO בטמפרטורת החדר ל-10 דקות לכל היותר. מומלץ לעבוד עם מיכל הקפאה אחד בכל פעם עד לניצול כל הרקמה.התחל לשאוב את הנוזל העליון של רקמה רפויה, גרגרת תירס, קרוב ככל האפשר למשקע מבלי להפריע לו. לאחר מכן, התאם טיפ עם פתח רחב של 200 microliter לפיפט. אין להשתמש בטיפ עם פתח קטן יותר, שכן הדבר יפגע במבנה הבלוקים היורדים לתחתית משקע בלוק הרקמה.אספו 200 microliters של רקמה באיטיות. העבירו רקמה זו למבחנה לקריו (cryo vial) והמשיכו למבחנה הבאה עד שכל המבחנות יתמלאו. ייתכן שיהיה צורך בהפעלת כלל 10 הדקות.העבירו במהירות את מיכל ההקפאה עם מבחנות הקריו (cryo vials) למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות, או למשך הלילה אם הזמן מוגבל. לאחר זמן מספיק, הוציאו את מיכל ההקפאה מהמקפיא והעבירו את מבחנות הקריו לקופסת קריו במהירות המרבית. הניחו את קופסת הקריו במדף של מיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.הוצאו מבחנה לקריו (cryo vial) מחנקן נוזלי במהירות רבה ככל האפשר, תוך הגבלה של חשיפת קופסאות הקריו לטמפרטורת החדר. הפשירה את הדגימה במהירות על ידי טבילה בבן-מטב של 37 °C. הקפידו תמיד להשאיר את הפקק מעל פני המים. בדקו בתדירות גבוהה והמשיכו בהפשרה עד שיתבחן גביש קרח קטן.לפני הכנסת המבחנה לתא המבטיח, סטריליזציה של מבחנת הקריו באמצעות 70% ethanol. המשך בהוספת הרקמה שהופשרה לנפח גדול של 1X HBSS חמים אם נותרה רקמה על דפנות מבחנת הקריו. אסוף בעדינות באמצעות HBSS.לאחר איסוף כל הרקמה, הפוך את המבחנה שלוש עד ארבע פעמים והמתן עד שהרקמה תשקע לתחתית. שלב זה מבטיח דילול מספיק של DMSO.לאחר שהרקמה שקעה, שאבו כמה שיותר מהנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו לכך 10 milliliters של HBSS בריכוז 1X טרי וחם. הוסיפו 300 microliters של 0.25% trypsin ו-50 microliters של DNase.המשיכו בפירוק הרקמה תוך써 ערעור עדין, עד ליצירת תרחיף תאים עכור לאחר פירוק הרקמה. הפסיקו את הפעילות האנזימטית על ידי הוספת DMEM חמים בתוספת 10% bovine serum. סבבו את תרחיפי התאים ב-1200 G למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את משקע התאים ב-DMEM טרי בתוספת 10% EBS והעבירו לצלחות מצופות ב-polylysine.אפשרו לתאים להיקשר לפיתחים למשך 30 דקות. לאחר מכן, החליפו את המצע במצע DM טרי בתוספת 10% EBS. לאחר 24 שעות, החליפו את המצע המכיל DM במצע neuro basal בתוספת N two ו-B 27, וגדלו למשך 10 ימים.פירטנו כעת פרוטוקול נרחב, יעיל ואמין לשימור קריוגני שגרתי של גושי רקמה קורטיקלית. בהצלחה.

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

מקור: Palma-Tortosa, S., et.al. תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים השתלה של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות רקמת קליפת המוח האנושית. ההליך כולל בידוד והשעיה מחדש של תאי אב במטריצת קרום מרתף, ולאחר מכן הזרקתם לפרוסה קליפת המוח המונחת על מכלול טרנסוול. לאחר הדגירה כדי לאפשר התמצקות מטריצה והתמיינות עצבית, הרקמה המושתלת מוכנה לניתוח נוסף.

השתלת אבות עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות קליפת המוח האנושיות

סרטון זה מדגים את השיטה של תרבית נוירונים עובריים שמורים בהקפאה, הכוללת הפשרה מבוקרת, דילול עם תווך נוירובזאלי וזריעה על צלחת מצופה פולי-L-ליזין. הדגירה הבאה תומכת בצמיחה ובתחזוקה של קשרים עצביים.

יצירת תרבית נוירונים ראשונית בצפיפות נמוכה מתאי עצב עובריים קפואים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור Ca2 + הדמיה של נוירונים ותאי גלייה, המאפשרת את הקרע של Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular. תהליך זה הוא החלים על כל סוגי תאים לאפשר הביטוי של Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

במחקר זה, אנו מספקים טכניקה מפורטת למערכת תרבית אורגנואידים פשוטה אך חזקה בקליפת המוח באמצעות תרביות hPSC סטנדרטיות ללא הזנה. זהו פרוטוקול מהיר, יעיל וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים המדגימים היבטים של סנסנציית המוח במבחנה.

דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול סנסנציה עצבית במוח במבחנה

מלאי קפוא מוכן לשימוש של נוירונים הוא כלי רב עוצמה להערכת תפקודים סינפטיים. כאן, אנו מציגים תרבית ראשונית קלה בצפיפות נמוכה ממלאי קפוא באמצעות צלחת של 96 בארות.

תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

למדו פרוטוקול יעיל להקפאת בלוקים של רקמת קליפת המוח לשימור ארוך טווח בחנקן נוזלי. השיטה מאפשרת ייצור תרביות עצביות איכותיות מרובות סוגי תאים לחקר נוירוביולוגי מתקדם.

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

גלה סרטונים נוספים