Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר
11 בנובמבר 2010
כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.
שלום, שמי אלן ואני המעבדה של ד"ר הורני לו באוניברסיטת קליפורניה אירווין במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות. ואני בוב. היום, ד"ר הארו יראה לכם פרוטוקול מהיר, יעיל ואמין לשימור קריו שגרתי של בלוקים של רקמות קליפת המוח לניוון לאחר מכן של תרביות עצביות ראשוניות באיכות גבוהה.
אז בואו נתחיל. טישו נקי וקצוץ מועמס בבקבוקוני קריו המכילים 10% TMSO. מדיום מקפיא.
בקבוקוני קריו נטענים למיכל הקפאה ומונחים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. בקבוקוני קריו קפואים מונחים לאחר מכן בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. לצורך גידול בקבוקון קריו AC נמס באמבט מים חמים ונשטף ב-HBSS חם כדי להסיר את שאריות ה-DMSO.
HBSS טרי מתווסף יחד עם tryin d ns לדיסוציאציה, ולאחר מכן מתווסף DMM עם 10% EBS. כדי לעצור את הפעילות האנזימטית הדיסוציאטיבית, תאים מסובבים כלפי מטה והגלולה מושעה מחדש ב-DMM טרי בתוספת 10% EBS ומצופה על כלי פוליליזין מצופים מראש. לאחר 24 שעות, DMM השתנה למדיום נוירו-בסיסי וגדל במשך 10 ימים.
פרוטוקול זה משתמש בסכין גילוח מפלדה לקיצוץ רקמות קליפת המוח לפני השימוש. יש לעקר את סכין הגילוח באתנול 70% למשך שעתיים לפחות. תמיסת המלח המבודדת של האנק HBSS נוצרת על ידי דילול תמיסת מלאי של פי 10 במים מעוקרים, ה-X-H-B-S-S נשמר לאחר מכן על קרח או בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד רקמות.
תחמוצת דימתיל סולף או DMSO משמשת כקריו מוגן באמצעי ההקפאה. פרוטוקול זה משתמש בדילול נפח ונפח של 10% של DMSO באחד X-H-B-S-S-D-M-S-O צריך להתערבב לחלוטין לפני האחסון בארבע מעלות צלזיוס. Nalgene ומיכל הקפאה משמשים לשליטה בקצב ההקפאה של הדגימות.
מיכל ההקפאה עמוס בבקבוקוני קריו של 2.5 מיליליטר שסומנו מראש. כמו כן, מומלץ לתייג את מיכלי ההקפאה עצמם אם יש לכם יותר מאחד ולציין את המיכל המתאים על המרה. אמצעי ההקפאה, 10% DMSO, כמו גם מיכל ההקפאה מובאים לארון בטיחות ביולוגי סטרילי.
כאן מוסיפים לאט לאט מיליליטר אחד של חומר הקפאה לכל אחד מבקבוקוני הקריו לאחר שווידאתם שהכובעים מאובטחים, הניחו את מיכל ההקפאה עם הבקבוקונים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות ממש לפני עיבוד הרקמות. יש לשטוף היטב את סכין הגילוח שעוקר בעבר. שלוש, שלוש דקות כביסות.
שימוש במים מעוקרים אמור להספיק להסרת כל האתנול שנותר. הליך כביסה זה צריך להיות מהיר מכיוון שהתער נוטה לחמצון מטבילה ממושכת ומים סטריליים. לפני הניקוי יש להניח טישו על שקית קרח.
יש לשטוף קלות עם X-H-B-S-S קר כדי להסיר פסולת צפה חופשית. מחטים מעוקרות משמשות לניקוי חלקי הרקמה מכל הממברנות וכלי הדם שנותרו. יש להקפיד על שמירה על שלמות מבנית של הרקמה בזמן הניקוי.
ככל שזה יגדל, היעילות של קיצוץ רקמות נקיות תהיה שונה באופן ניכר מרקמה גולמית ויש להסיר את רוב הממברנות או כלי הדם. לאחר ניקוי ושטיפת טישו, ניתן להתחיל בקיצוץ. חשוב לבצע חתכים נקיים של הרקמה וליצור בלוקים בגודל של כמילימטר אחד בקוביות.
בלוקים גדולים מדי מפלסים תאים נמוכים יותר בהפשרה. עם זאת, יש להימנע גם מעיבוד יתר של הבלוקים הקטנים יותר. ניתן לאסוף רקמות קצוצות באמצעות פיפטה אוטומטית וכמה מגניבות X-H-B-S-S.
הקפידו לשטוף את הכלי עם HBSS כדי לשחזר את כל הרקמות שנאספו. לאחר מכן מוסיפים רקמה לנפח גדול של X-H-B-S-S אחד ומניחים לה ליפול לתחתית, וליצור כדור ארוז באופן רופף. זה מנקה את כל הפסולת שנותרה שעלולה להיות נוכחת כאשר הרקמה שוקעת ב-HBSS אחזר את מיכל ההקפאה שהתקרר בעבר ובקבוקוני קריו לפני הקצאת רקמה.
הקפד לפתוח את כל הבקבוקונים כדי לזרז את תהליך מילוי הרקמה. יש להגביל את החשיפה ל-DMSO בטמפרטורת החדר ללא יותר מ-10 דקות. מומלץ לעבוד עם מיכל הקפאה אחד בכל פעם עד לשימוש בכל הרקמות.
התחל לשאוף את הרקמה הרופפת, גלולת תירס קרוב ככל האפשר לגלולה מבלי להפריע לה. לאחר מכן התקן קצה פתח ברוחב 200 מיקרוליטר לפיפטה. אל תשתמש בפתח קצה קטן יותר מכיוון שהוא יפגע במבנה הבלוקים ההולכים לתחתית גלולת גוש הרקמות.
אוספים 200 מיקרוליטר רקמה לאט. הוסף את הרקמה הזו לבקבוקון קריו ועבור להבא עד שכל הבקבוקונים מתמלאים. אולי צריך כלל של 10 דקות.
הנח במהירות את מיכל ההקפאה בבקבוקוני קריו במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות או לילה אם הזמן מוגבל. לאחר מספיק זמן, הוציאו את מיכל ההקפאה מהמקפיא והקצו את בקבוקוני הקריו לקופסת קריו במהירות האפשרית. הנח את קופסת הקריו במתלה קופסת חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
הסר קריו שפל מחנקן נוזלי במהירות האפשרית, והגביל את קופסאות הקריו חשיפה לטמפרטורת החדר ממיסה במהירות את הדגימה על ידי טבילה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. יש לשמור תמיד על הפקק מעל המים. בדוק לעתים קרובות והפשיר עד שנצפה קרח P קטן.
לפני הכנסתו לארון הבטיחות, יש לעקר את הקריו עם 70% אתנול. המשך להוסיף את רקמת ההפשרה לנפח גדול של חם X-H-B-S-S אם נשארת רקמה על דפנות הקריו הנתעב. נאסף בעדינות עם HBSS.
לאחר איסוף כל הרקמות. הפוך את הצינור שלוש עד ארבע פעמים ואפשר לרקמה להתיישב לתחתית. שלב זה מבטיח דילול מספיק של DMSO.
לאחר שהרקמה התייצבה, שאפו כמה שיותר מהסופר נאטין. לאחר מכן הוסף לזה 10 מיליליטר טרי חם אחד X-H-B-S-S. הוסף 300 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ו -50 מיקרוליטר DNA.
המשך לנתק את הרקמה בתסיסה עדינה, וליצור תרחיף תאים עכור לאחר ניתוק הרקמה. עצור את הפעילות האנזימטית על ידי הוספת DM חם בתוספת תרחיפי תאי צנטריפוזיה EPS בסרום בקר מועשר ב-10% ב-1200 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את גלולת התא ב-DMEM טרי בתוספת 10% EBS וצלחת לצלחות מצופות פוליליזין.
אפשר לתאים להיצמד לכלים למשך 30 דקות. לאחר מכן החלף את המדיה ב-DM טרי בתוספת 10% EBS. לאחר 24 שעות, יש להחליף את החומר המכיל DM במדיה נוירו-בזאלית בתוספת N 2 ו-B 27 ולגדול במשך 10 ימים.
זה עתה פירטנו פרוטוקול נרחב, יעיל ואמין עם שימור בכי שגרתי של בלוקים של רקמות קליפת המוח. אז בהצלחה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לשימור קריופרזרבציה יעיל והפשרה של גושי רקמת מוח קליפת המוח, המאפשרת ייצור של תרביות עצבים מועשרות. הפרוטוקול מאפשר טיפוח עוקב של תרביות עצבים, אסטרוציטים ותאי מבשרי עצבים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאים
- שימור רקמות
רקע
- קריופרזרבציה חיונית לשמירת הקיימות של רקמת מוח.
- טכניקות הפשרה יעילות הן חיוניות לתרביות תאים באיכות גבוהה.
- תרביות עצבים הן חיוניות למחקרים נוירוביולוגיים שונים.
- פרוטוקולים חייבים להבטיח נזק מינימלי לשלמות הרקמה במהלך העיבוד.
מטרת המחקר
- לפתח שיטת קריופרזרבציה אמינה לרקמת קליפת המוח.
- להעצים את התפוקה של תרביות עצבים ראשוניות.
- לספק פרוטוקול גמיש ליצירת סוגי תאים שונים מרקמה משומרת.
שיטות ששימשו
- הכנת גושי רקמת קליפת המוח באמצעות להב גילוח מעוקר.
- שימוש ב-10% DMSO במדיום הקפאה לקריופרזרבציה.
- הפשרת רקמה באמבט מים חם כדי למזער יצירת גבישי קרח.
- פירוק הרקמה המופשרת באמצעות טריפסין ו-DNase לתרבית תאים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול שומר בהצלחה על קיימות הרקמה הקליפתית.
- תרביות עצבים באיכות גבוהה הושגו לאחר הפשרה.
- הוכחה גמישות ביצירת סוגי תאים שונים.
- נוסחו שיטות יעילות לעיבוד רקמה.
מסקנות
- שיטת הקריופרזרבציה המתוארת יעילה לרקמת מוח קליפתית.
- פרוטוקול זה יכול להתאים ליישומי תרבית עצבים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על שיטה זו למחקר נוירוביולוגי מתקדם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Standardized cryopreservation of cortical tissue blocks enables reliable generation of highly enriched neuronal cultures, supporting consistent early discovery and assay development in neurobiology-focused R&D. This protocol increases operational flexibility and resource efficiency by decoupling tissue collection from downstream culture initiation, reducing biological variability and supporting scalable, reproducible workflows. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, bankable sources of primary neuronal and glial cells for target validation and screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent access to high-quality neuronal and astrocyte cultures for mechanistic studies.
- Supports functional target validation by providing reproducible primary cell systems.
- Facilitates biological de-risking through standardized tissue processing and storage.
- Improves predictive confidence in early-stage neurobiology research.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible cell sources for assay standardization and optimization.
- Enables scalable preparation of neuronal cultures for compound screening workflows.
- Supports quantitative readouts and reproducibility across experimental batches.
- Reduces batch-to-batch variability by allowing synchronized culture initiation.
Translational & Preclinical Research
- Facilitates generation of neural precursor cell cultures for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling flexible timing of culture generation.
- Aligns with translational biomarker studies requiring consistent primary cell sources.
- Reduces risk of biological drift in long-term research programs.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation protocol positions tissue banking as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling on-demand generation of neuronal and glial cultures for diverse R&D needs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis with standardized primary cultures.
- Screening: Provides assay-ready cells for reproducible compound evaluation and quantitative analysis.
- Analytics: Enables consistent measurement of neuritic growth and network expansion across experiments.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker studies using neural precursor-derived cultures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue resource for multiple projects and cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal assays.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and primary cell culture techniques.
- Needs access to controlled-rate freezing equipment and liquid nitrogen storage.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Cell yield and viability depend on precise block sizing and handling as described.
