התמרה לנטי-ויראלית של תאי אב עצביים לוויסות אפיגנטי של ביטוי אלפא-סינוקלאין

להפשיר תאי אב עצביים או NPCs המאוחסנים עם מגן קריאופרוטקטנט בגוש חום.

NPCs אלה מבטאים עלייה באלפא-סינוקלאין, גורם מפתח במחלת פרקינסון.

העבירו את התאים המופשרים לצינור המכיל מדיה בסיסית חמה כדי לדלל את חומר ההקפאה.

צנטריפוגה כדי לגלול את התאים, להסיר את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה במדיה עצבית.

הוסף את תרחיף התאים על צלחת מרובת בארות מצופה ECM ודגירה כדי לאפשר הידבקות והתפשטות של תאים.

הוסף וקטורים לנטי-ויראליים המכילים RNA מדריך, Cas9-DNA methyltransferase מנוטרל וגן עמיד לאנטיביוטיקה.

דגירה כדי להקל על כניסה ויראלית, שעתוק הפוך של ה-RNA הנגיפי, אינטגרציה בגנום המארח וביטוי טרנסגנים.

ה-RNA המנחה מכוון את dCas9 לגן אלפא-סינוקלאין, שם מתילציה של DNA בתיווך מתיל-טרנספראז מפחיתה את ביטוי אלפא-סינוקלאין.

החלף את המדיה במדיה עצבית המכילה אנטיביוטיקה כדי לבחור תאים מותמרים, בעוד שתאים שאינם מתמרים עוברים אפופטוזיס.

הנח Cryovial עם MD NPC בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות והעביר את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר DMEM-F12 חם.

צנטריפוגה בחום של 300 גרם למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום N2B2 שלם שחומם מראש. הוסף שני מיליליטר של N2B27 למתלה התא וצלחת שני מיליליטר תאים בכל באר של צלחת שש בארות מצופה BMM שהוכנה בעבר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO_2 למשך הלילה. כאשר MD NPCs נמצאים במפגש של 70%, התמיר אותם על ידי הוספת שני מיקרו ליטרים של וקטורים של מדריך לנטי-וירוס RNA d-Cas9-DNMT3A וסובב בעדינות את הצלחת. לאחר הדגירה של התאים באותם תנאים כמו בעבר למשך 16 שעות, החלף את המדיום N2B27 48 שעות לאחר ההעברה.

הוסף N2B27 עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין