בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

שלום, אני וויליאם טיס ממעבדת קרייט. היום, אני ואחרים נראה לכם הזרקות תוך-רחמיות לעוברים של עכברים ביום E 15. שלום, שמי לורה אליאס.

היום אראה לכם כיצד להכין את פיפטות המיקרו-הזרקה ולמלא אותן לצורך ההזרקות תוך-חדריות והאלקטרופורציה שנבצע. שמי הוא דייוויד קסטנידה, והיום אסייע בהזרקות in vivo in utero של עוברי עכברים. נזריק DNA פלסמידי לתוך החדרי הצדי של עוברי עכברים בשלבי התפתחות.

אנו מכוונים לקליפת ה-CE של עוברי אלה כדי להשיג ביטוי של מולקולות שונות על ידי תאי גליה, אשר יהפכו לנוירונים בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות. בעת ביצוע ההזרקות התוצאיות הללו, ישנם מספר כלים חשובים שתצטרכו להשתמש בהם ואני אראה אותם לכם כעת. אנו משתמשים בפינצטה זירה ובזוג פינצטות עזר.

זוג אחד, זוג אחד משונן, וזוג נוסף שיש לו שן קטנה בקצה. אנו משתמשים בזוג המוסטטים. אלו הם מספריים.

לאחר מכן אנו משתמשים בשני המדבקי הללו. זהו הגדול יותר, שבו אנו משתמשים עבור חולדות. וזהו הקטן יותר, שבו אנו משתמשים עבור עכברים.

נעשה שימוש בסיכה בגודל שבע, וכאן נעשה שימוש בסיכה בגודל תשע והן בעלות קפיץ. חלק מהעזרים שבהם אנו משתמשים כאן כדי לסייע בניתוחים הם מקור אור סיב אופטי פשוט עם ראש כפול. אנו משתמשים במצע חימום המזרים מים חמים כדי לשמור על חום הגוף.

על משטח העבודה, אנו משתמשים במערכת אלקטרופורציה זו מתוצרת BTX. יש לנו מספר גדלים שונים של מגעים (paddles) שבהם אנו משתמשים בהתאם לגודל העוברים. הצד הכחול הוא הצד החיובי.

עבור העכברים אנו משתמשים במאייד איזופלוריין (iso fluorine). מצאנו כי הוא מעלה את שיעורי ההישרדות של האם ושל העוברים. כמו כן, הוא מאפשר לנו להביא את בעל החיים למצב של חוסר הכרה ולהחזירו להרעננות במהירות רבה ובאופן מבוקר מאוד.

מסיבה זו, מצאנו שזה שימושי מאוד. ובכן, כעת אנו הולכים לבצע שיפוע (bevel) לפיפטות ההזרקה שלנו. זה חשוב מאוד כדי שלפיפטה תהיה פתח גדול מספיק המאפשר טעינה של ה-DNA, אך גם כדי שתהיה חדה מאוד, כך שלא תפגע בעובר בזמן ההזרקה.

ואם תגרמו נזק לעובר בזמן ההזרקה, יהיה לכם שיעור תמותה גבוה בהרבה. וזה אינו רצוי. לכן, זהו למעשה תהליך חשוב מאוד בניתוח זה.

ראשית, נשפוך מעט מים על אבן השיוף המסתובבת כאן. לאחר מכן ניקח, בואו נראה, פשוט מקל, ונמקם באמצעות סרט דבק את הפפטה שמשכנו זה עתה על המקל הזה.

נשתמש באחד ממניפולטורים המיקרוסקופיים הללו כדי להחזיק את הפיפטה על גבי השסוע ולאפשר לה להישען עליו. נמקם זאת ונשתמש במיקרוסקופ כדי להדמיות את קצה הפיפטה. נניח אותה ישירות במים מעל השסוע, כך שתיווצר השפעה של מעט לחץ.

ניתן לראות את הקצה לוחץ על האבן כאן. יש להניח לו לעבור השחזה למשך זמן מה, לפחות 15 דקות. אני מעדיף להשאיר אותם גם למשך שעה.

לפעמים הן הופכות להיות ממש חדות, אך זה בהחלט תלוי בכל אדם כמה זמן הוא משייף את השפשוף של הפיפטות שלו. ובכן, כאן ניתן לראות בחלק העליון פיפטה שנמתחה אך טרם שויפה. לכן, למרות שהיא חדה, אין לה פתח שדרכו ניתן להטעין את ה-DNA שלכם.

כעת הקצה התחתון של הפיפטה נחתך בזיקה, וניתן לראות את הפתיחה הזוויתית היפה הזו. דבר זה יאפשר לכם להטעין את ה-DNA, אך הקצה עדיין חד כדי שתוכלו להזריק מבלי לגרום לנזק. ובכן, כעת נמלא את פיפטות ההזרקה ב-DNA. חשוב להכין את ה-DNA באופן נקי מאנדוטוקסינים, כדי שלא תזריקו ליפופוליסכרידים בזמן הזרקת ה-DNA.

כעת ניקח את ה-DNA שלנו, ובשלב זה נכין את ה-Parafilm. פשוט הכינו את ה-Parafilm, אספו את ה-DNA והניחו אותו כנקודה קטנה על גבי ה-Parafilm. לאחר מכן, אני בדרך כלל לוקח עבור כל 10 µL של DNA, אשר בדרך כלל משתמש בריכוז של כ-1.5 עד 1.7 µg ל-µL.

אשתמש בכ-1 µL מצבע fast green זה. הדבר נועד לסייע לנו במיקום ההזרקה ולהבטיח שהזרקנו בהצלחה אל תוך החדריות (ventricle). לאחר מכן, אערבב את צבע ה-fast green עם ה-DNA שלי.

לאחר מכן קחו את אלקטרודת ההזרקה ונמלא את הפ pipette על ידי משיכה של הבוכנה לאחור. ניתן לראות כאן שאם ה-pipette חתוכה בזווית נכונה ויש לה פתח גדול מספיק, ה-DNI אמור להיטען בקלות רבה. לעיתים יש להזיז את הבוכנה קדימה ואחורה כדי לסייע בטעינה תקינה.

כעת ניתן למלא את הפפט בצורה זו. ה-DNA טעון במלואו לתוך הפפט והוא מוכן להזרקה. אקח כעת את בעל החיים ואשטוף אותו באלכוהול וביוד, אך ראשית, כמובן, אבצע צביטה של בהונות כדי לוודא שהבעל חיים נמצא תחת הרדמה מלאה ושהמצב תקין.

כעת אני יכולה להתחיל. אני פותחת בביצוע סדרה של שלושה מהם, בדומה למה שנעשה בחולדות, ומתחילה עם האתנול. אוקיי, יוד.

כדי למזער את הסיכון לזיהום, שימו לב שכאשר ויליאם פותח את המטריות, הוא מנקה את בעל החיים באמצעות החלק שלא נגעו בו אצבעותיו, וזאת כדי להבטיח רמה מקסימלית של ניקיון באזור. שנית, הוא מבצע ניגוב אחד בלבד כדי למנוע פיזור של חיידקים על פני השטח של הבטן.

בסדר, מצוין. כעת אני אנקה מעט ונחליף לכפפות כירורגיות. בסדר. בסדר. בסדר. כעת אני אפתח את העכבר ואוציא את קרני הרחם, ואתחיל זאת בתפיסה קלה של העור.

אבצע צביטה נוספת של בהוז רק כדי לוודא שהיא תחת הרדמה מלאה, וזה תקין. אני אצביט את העור ואצור שם קמט קטן שיהיה בולט, מה שיקל עליי לבצע את הגזירה. ושוב, עלינו לבצע את החתך בדיוק לאורך קו האמצע של בעל החיים כדי להימנע מפגיעה בכלי דם.

אני בדרך כלל חותך את העור בצורה כזו, מפריד אותו וחושף את השריר. לאחר שעשית זאת, ניתן לראות בקלות את קו האמצע בשריר; הוא מוגדר מאוד.

אני אקח מעט מהשריר שם ואגזור. זהו גודל חתך מתאים; לא הייתי רוצה להגדיל אותו יותר מכך. לאחר מכן, אני משתמש במכשיר ה-freer רק כדי להרים את השריר והעור, מושך אותם הצידה, ואז מבצע בדיקה עדינה מאוד כאן ומנסה למקם את ה-freer בין שני העוברים, כדי שאוכל פשוט למשוך אותם בעדינות החוצה מבלי לגרום להם לכל נזק.

לפעמים זה קל יותר מפעם אחרת. הנה זה קורה. רק משכו זאת בעדינות פנימה, וברגע שזה יעבור, אוכל פשוט לדחוף אותם החוצה.

חשוב מאוד לא לצבוט את העובריים לעולם, אלא רק להנחות אותם, מעין לדחוף אותם קלות. ולאחר שמוציאים אותם, אני רוצה לוודא שהם נשארים תמיד רטובים מאוד. אין לאפשר להם להתייבש.

ובכן, אשתמש שוב ב-freer שלי כאן, אבדוק מסביב. הנה זה. זה נהדר.

לכן אני תמיד רוצה לוודא שהוצאתי את כולם, כי קל להשאיר אחד בפנים אם לא בודקים את השחלות. לכן אני תמיד מושך אותם החוצה שוב בעדינות רבה, תוך חיפוש ובדיקה של השחלות בסוף, שנמצאות ממש שם. ובבעל חיים זה הן נראות פשוט כגוש קטן של רקמה אדומה.

לאחר מכן הפכו אותם, חזרו ובדקו את הצד השני ואני יכולה לראות אותם שם. לכן, רק וודאו שהם נשארים הידרטיים ואנחנו מוכנים להתחיל. דבר אחד שברצוני לציין הוא שיש לתפוס את העובריים בעדינות רבה ולתפוס אך ורק את העובריים.

אין לתפוס באזורים שבהם נמצאים כלי הדם, כיוון שהם עלולים להינזק בקלות רבה, מה שיוביל לדימום אצל בעל החיים ולהורדה דרמטית של שיעור ההישרדות. לכן, הדבר הראשון שעלינו לקבוע הוא היכן נמצא הראש בעובר שאותו ברצוננו להזריק ב-DNA. אנו עושים זאת על ידי סיבוב עדין של בעל החיים ובחינה של כל חלק ventral.

במקרה הספציפי הזה, הראש נמצא מימין לי והזנב קרוב לשמאלי. קו האמצע נמצא במיקום זה, וויליאם ימשיך למקם את העובר באופן הולם כדי שאוכל להזריק לו. בדיוק כמו בחולדות, אני תמיד ממקמת אותם כאשר הראש נמצא בצדה הימני של האם ופונה אלי.

ואני אתחיל את זה עכשיו. אוקיי, ניתן לראות שם את מוט הרצפה השמאלי, הזיזו אותו מעט ותוכלו לראות בבירור את קו האמצע ממש שם. אנסה לסובב אותו מעט כדי שיהיה במיקום נוח עבור דייוויד.

ובכן, כעת אגש להזרקה לתוך החדר השמאלי. ניתן לראות כאן שהחדר השמאלי מלא לחלוטין בצבע. ניתן לראות שחלק מהצבע התפשט לחדר הימני וכן לחדרים השלישי והרביעי כאן.

זהו אינדיקטור טוב להזרקה תקינה. כעת נמשיך להחדרה אלקטרופורטית של ה-DNA לתאים. השיקול החשוב כאן הוא לדעת איזו אלקטרודה היא הצד החיובי.

אנו יודעים שהאלקטרודה עם הידית הכחולה כאן היא האלקטרודה החיובית, וצד זה צריך להיות ממוקם בצד שבו אנו רוצים לבצע אלקטרופורציה של ה-DNA. מאחר שהזרקנו את רוב ה-DNA לחדר השמאלי, אני אמקם את האלקטרודה החיובית בצד שמאל באופן זה, ואז נפעיל חמישה פולסים וזהו. חשוב שהאלקטרודות יהיו רטובות לחלוטין ב-PBS כדי שהמגע בין האלקטרודות לרחם יהיה טוב וההעברה של הפולסים החשמליים תהיה תקינה.

בסדר, כעת לאחר שהבדיקה הושלמה, אני אחזיר את הקרנים פנימה. אעשה זאת על ידי הזזה עדינה של הקרנים לצד אחד, הגעה פנימה ותפיסת השריר והעור, והחזרתם בעדינות רבה למקומם. מצוין.

היזהרו מהשלפוחית. אני יכול לטפל בצד השני. ואז מה שאנחנו עושים זה פשוט לנער אותה מעט כדי שהם יתיישבו שם.

ניתן להשתמש בפינצטה מעט כדי להחליק אותם בעדינות. לאחר מכן, אני אבצע שטיפה עם 3 mL של תמיסת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטית. נבצע לחיצה על בהו ה ayak כדי לוודא שהיא מורדמת לחלוטין לפני שאני מתחיל בתפירה.

וזה נראה טוב. אני אשתמש בחוט הנרי שיין (Henry Shine), מספר 6, תפר כירורגי.

אני מעדיף לבצע תפרי block stitches. אני חושב שהם מחזיקים מעמד טוב יותר. אנחנו נתחיל פשוט בהחדרת המחט שם, נמשוך אותה החוצה, נקיף שלוש פעמים, נתפוס את הקצה ונמשוך אותו החוצה.

1, 2, 3, גזרו את העודפים. כעת יש להמשיך לאורך הקו במרווחים שווים תוך써 מתיחה חזקה. יש להמשיך מעבר לנקודה שבה מסתיימת החתיכה ולקשור שוב.

וכעת אני ניגש לשם. משוך את הרקמה או את העור מעט אחורה. יש שם מעט דימום.

זה אמור להיות תקין. אנו מחזיקים מכשיר קוטרז (cauterizer) זמין למקרה שיהיה דימום, דבר שקורה מדי פעם. ומכשיר הקוטרז עובד היטב כדי לעצור זאת.

אז, אוקיי, עברתי את החתך. אעצור שם. אמשוך דרך, אצור לולאה, אסתובב שלוש פעמים, אתפוס את הלולאה ואמשוך אותה למטה.

סובבו שלוש פעמים, תפסו את הלולאה, משכו אותה החוצה, והסִירו את העודפים. השליכו את המחט למיכל החדים. ולאחר מכן נשתמש בסיכות (stapler).

נשתמש בסיכות בגודל 7 בחיה זו. אנו משתמשים במידה 7 עבור עכברים ובמידה 9 עבור חולדות.

פשוט תפסו את העור, משכו אותו מעט למעלה והתחילו להניח את התופסנים. תפסו את התופסן הבא. עלינו להניח אותם במרווחים שווים לאורך כל הדרך, עד למרחק קטן מעבר לחתך, וכך זה תקין.

בצעו ניגוב של כל האזור בעזרת מגבון אלכוהול. לאחר מכן, נחקה אותה בזריקה של buprenorphine כדי להבטיח שהיא לא תחווה כל כאב. נמשיך לעקוב אחריה במהלך הימים הקרובים כדי לוודא שהיא נשארת בריאה ושאינה סובלת מכאב כלשהו.

ובכן, כעת, לאחר שהזרקנו לה buprenorphine, נחזיר אותה לכלוב המקורי שלה כדי שתרגיש בנוח כשתתעורר, נכניס אותו לאינקובטור ונניח לה להישאר שם למשך כ-20 דקות עד שתהיה ערנית לחלוטין ויבשה. הצגנו בפניכם כיצד לבצע electroporation של plasma DNA בשיטת in vivo in utero. ניתן להזריק כל מולקולה.

אלו יכולים להיות פלסמידים או תרופות. גורמי גדילה. אם יש צורך בהחדרה של מולקולות אלו לתאים והן אינן חודרות באמצעות דיפוזיה פסיבית, יהיה צורך באלקטרופורציה, ועבור זאת, המולקולות ידרשו להיות טעונות.

אך באופן בסיסי, האפשרויות הן בלתי מוגבלות. דוגמה אחת לווקטור חלופי להחדרת גנים לתאים היא באמצעות וירוסים.

ובעבר השתמשנו ברטרו-וירוסים כדי לסמן GLS באמצעות DNA ולהראות כיצד הם מתחלקים והופכים לנוירונים, וכעת נודדים בסופו של דבר אל הקורטקס, לאחר סימון התאים באמצעות וירוס או שימוש באלקטרופורציה, או על ידי הזרקת תרופות או מולקולות אחרות המשפיעות על התפתחות המוח. ניתן לחקור זאת באמצעות מספר טכניקות, אחת מהן היא ביצוע TimeLapse בתוך תרביות של פרוסות אורגנוטיפיות.

לאחר מכן, תעקבו אחר גורלן של התאים באמצעות מיקרוסקופ. כפי שניתן לראות כאן, זמן 0.0. אנו מתחילים עם מקבץ תאים הנמצאים קרוב מאוד לחדר הצדי (lateral ventricle).

ועם חלוף הזמן, ניתן לראות שהתאים מתחילים לנדוד אל מחוץ לאזור הוונטריקולרי ובכיוון הלוח הקורטיקלי. בנוסף, אנו מקבעים את העוברים ומבצעים אימונוהיסטוכימיה כדי לחקור את ההפצה של מולקולות שונות, או כדי לקבוע את גורלם של תאים שונים אלו. אפשרות נוספת היא ביצוע אלקטרופיזיולוגיה.

אנו מזהים את התאים המסומנים ולאחר מכן אנו בוחנים את תכונותיהם החשמליות. ובכן, תודה שהייתם איתנו היום. אנו מקווים שנהניתם מההדגמות שלנו ושתצליחו בביצוע הניסויים שלכם.

אם יש לכם שאלות כלשהן, אל תהססו ליצור איתנו קשר. בהצלחה.