Name: Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למדו את שיטת הטרנספקציה בתאי גזע עצביים אנושיים באמצעות מכשיר Nucleofector Amaxa. פרוטוקול זה מאפשר חקר יעיל של פונקציית גנים במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג&#39; קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC.

הערה: עיין Passaging האדם מאמר בתאי גזע עצביים ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ואת ספירת אדם בתאי גזע עצביים מאמר ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / ראשי / Details.stp? ID = 262</a> ) כדי ללמוד כיצד resuspend ולספור hNSPCs. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי יש שפע של תאים זמינים transfection (כמה מיליוני תאים עבור כל ה-DNA להיות transfected). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל רקמה צלחת תרבות, שלתוכו התאים transfected יהיה seeded, עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פיברונקטין האדם אמש transfection. ממש לפני תחילת פרוטוקול transfection, להסיר את פיברונקטין, לשטוף את המנה עם PBS, מקום ותרבות התקשורת בצלחת. השאירו את המנה ב 37 ° C תרבות רקמות חממה לחמם את התקשורת. כמו כן, מקום 1 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות בחממה מראש חמים 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ה-DNA (ים) להיות transfected, והפתרון transfection (מ Amaxa), על קרח. </li></ol> Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מספר מוגדר של תאים עם PBS (אנחנו בדרך כלל להשתמש ~ 5 x 106 תאים לכל transfection). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (1000 סל&quot;ד (~ 200xg) במשך 5 דקות), להסיר כמו PBS הרבה ככל האפשר, resuspend התא גלולה ב 100 μl של הפתרון transfection המסופק עם ערכת transfection. מעבירים את ההשעיה לתא צינור Eppendorf 1.7 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ה-DNA (~ 50-10 מיקרוגרם של ה-DNA לכל transfection) כדי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Amaxa מיני פיפטה, להעביר את התערובת לתוך התא ה-DNA קובט transfection Amaxa. ודא שיש לך 1 מ&quot;ל של טרום חימם בתקשורת תרבות לשלב הבא. כמו כן, להסיר את צלחת תא עם התקשורת בתרבות מן האינקובטור ולמקם אותו למכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קובט לתוך Nucleofector, לסובב ההגה עם כיוון השעון, ובחר בתוכנית &quot;A-033&quot;. לחץ על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection מוצלח מותווה על ידי נוכחות של שכבה צפופה מאוד של בועות על גבי פתרון של קובט. הוסף 500 μl מדיה חם לתוך קובט, ושימוש Amaxa מיני פיפטה, העברת תאים transfected לתוך צלחת עם טרום חימם התקשורת. שוטפים את קובט עם התקשורת יותר חמים ומוסיפים את לשטוף את צלחת זהה. מניחים את צלחת עם תאים של 37 ° C תרבות רקמות חממה. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מתאר הליך transfection מהיר יחסית ויעיל hNSPCs. באמצעות הליך זה, השגנו יעילות transfection הראשונית של 35% ~. תאים transfected על ידי הליך זה יכול לשמש מחקרים קצרי טווח (תאים transfected transiently) או לטווח ארוך מחקרים אם סוכן מבחר משמש ליצירת אוכלוסיה transfected ביציבות. יש לנו שנוצר בתאי transfected ביציבות שבו ~ 70% מכלל התאים מבטאים את חלבון אקסוגני. ב hNSPCs transfected transiently, ראינו ביטוי המשיכה של חלבון אקסוגני עבור ~ 7 ימים.

<table><tbody><tr><td>מכשיר ה-Nucleofector</td><td>כלי</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לנוקלאופקציה של תאי גזע עצביים של עכבר</td><td>ריאגנט</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם nucleofector amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection העיקרי של תאים עצביים יונקים, כגון גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), עם נפוץ ריאגנטים transfection קטיוני שומנים הביא לעתים קרובות כדאיות התא עניים transfection יעילות נמוכה. שיטות מכאניות אחרות של החדרת גן של עניין, כגון אקדח או גן microinjection, מוגבלים גם על ידי כדאיות התא עניים המספרים הנמוכים של תאים transfected. האסטרטגיה של שימוש בונה ויראלי להציג הגן אקסוגניים לתוך תאים ראשוניים כבר מוגבל על ידי כמות הן של זמן העבודה הנדרש כדי ליצור וקטורים נגיפיים חששות בטיחות פוטנציאליים. אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור transfecting hNSPCs השימוש במכשיר Nucleofector של Amaxa וטכנולוגיה עם פרמטרים זרם חשמלי ופתרונות המאגר מותאם במיוחד עבור transfecting בתאי גזע עצביים. שימוש בפרוטוקול זה, השגנו יעילות transfection הראשונית של 35% ו ~ ~ 70% לאחר transfection יציבה. הפרוטוקול מחייב שילוב של מספר גבוה של hNSPCs עם ה-DNA להיות transfected במאגר המתאים ואחריו electroporation עם המכשיר Nucleofector.

היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

טרנספקציה של תאי עצב ראשוניים של יונקים, כגון תאי גזע/קדמון עצביים אנושיים (hNSPCs), באמצעות טרנספקציה של ליפידים קטיוניים נפוצים...

שלום, אני סטיב. אני עובד במעבדה של ד"ר פלאנגן במחלקה לפתולוגיה ב-uc, Irvine. היום אראה לכם כיצד לבצע טרנספקציה של תאי אב עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני maxis.ראשית, תזדקקו לכמות גדולה של תאים. אני ממליץ על בקבוק T 25 מלא (confluent) לפחות, כיוון שפרוטוקול זה דורש צפיפות תאים גבוהה מאוד, כך שתזדקקו למיליון תאים לפחות. ראשית, אתחיל בהסרת התאים מהמשטח באמצעות תמיסת פירוק תאים (cell dissociation buffer), ולאחר מכן אספור אותם.לצורך הליך זה, עיינו בפרוטוקול האריזה שלי. הסיבה לכך שאני מעדיף את מערכת amaxa לניסויי הטרנספקציה שלי היא ש-amaxa מפתחת פרוטוקולי טרנספקציה מותאמים אישית לסוגי תאים ספציפיים, ובמקרה שלי, לתאי גזע עצביים. וזה עובד מצוין.הדבר מניב יעילות טרנספקציה גבוהה מאוד וחיוניות תאים גבוהה מאוד. בואו נתחיל. כעת אני מוכן לבצע טרנספקציה.כדי להתכונן לטרנספקציה זו, כבר ציפיתי את צלחת תרבית הרקמה שלי בפיברין למשך לילה. לאחר מכן, הוספתי אליה מצע גידול. כעת היא נמצאת באינקובטור בהמתנה להוספת התאים.בנוסף, הכנתי את כל הרכיבים שלי, את וקטור ה-DNA ואת תמיסת הטרנספקציה. כולם ממתינים כאן על קרח, ואני מוכן להתחיל בתהליך הטרנספקציה.זהו הגורם הגרעיני M max, ולפני שאני מניח אותו בתוך המנדף, אהדא אותו ב-70% ethanol, ולאחר מכן אנגב אותו בנייר סופג. ספרתי את התאים כך שיש לי סך כולל של 4 מיליון תאים והעברתי אותם למבחנה. כעת אני מוכן להתחיל בתהליך הטרנספקציה.ראשית, אני אסיר את המצע שבו הם נמצאים. כעת יש לי את משקע התאים כאן, ואני אשאב החוצה את המצע שבו הם שהו. אנסה להסיר כמה שיותר מהמצע, כיוון שאיני רוצה שיהיו חלבונים או רכיבים דומים במצע הטרנספקציה, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על פרוטוקול הטרנספקציה.הסרתי כמעט את כל המצע, וכעת אני עומד לרespend את משקע התאים הזה במאה מיקרוליטרים של תמיסת הגורם הגרעיני לתאי גזע עצביים של עכבר המנוסחת במיוחד זו. חברת Mxa מייצרת תמיסת טרנספקציה לטרנספקציית תאי גזע עצביים של עכבר, ואין לה תמיסה כזו לתאי גזע עצביים של בני אדם, אך מצאנו ששימוש בתמיסה עבור תאי עכבר עובד היטב. לכן, אני עומד להוסיף מאה מיקרוליטרים של תמיסת הגורם הגרעיני לתאי גזע עצביים של עכבר זו.כעת אתה שוב תשהה את משקע התאים בתוכו היטב, כך שלא יישארו גושים של תאים. זאת כדי שיהיה לי תמיס תאים הומוגני. לכן, אבצע פיפוט מעלה ומטה כ-10 פעמים.אני סבור שכעת יש לי תערובת הומוגנית למדי, ואעביר אותה כעת למבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.5 ml. אני משתמש בפיפט P 1000 ואוודא שאשאב את כל התמיסה. כעת יש לי 4 מיליון תאים רסוספנדים בתמיסת טרנספקציה לעכברים, וכעת אוסיף 5 µL מהווקטור שלי.לכן השארתי את זה על קרח במשך כל הזמן עד כעת. וכך אני עומד, ראשית, להעביר 5 µL. כעת אוסיף זאת לת сусפנזיית התאים.כעת אשתמש ב-P 200 המכוון לסביב 50 µL, ואערבב את התאים עם הווקטור באופן יסודי מאוד. לכן, אבצע פיפטינג (שאיבה ושחרור) 10 פעמים. אוקיי, זה מוכן.וכעת אני מוכנה לביצוע הטרנספקציה. לכן, אני אפתח קיט חדש, ואקח גם פ pipette מיוחדת שסופקה על ידי amaxa.כעת אסיר את הפקק ואמשוך בעדינות את התערובת הזו למעלה. אני אכניס את הפ pipette עד סוף ה-vete ואלחץ בעדינות להוצאת התמיסה. כעת אפעיל את ה-max nuclear factor, ואגדיר אותו ל-33 0 3 3 ואלחץ על enter.כעת אני אמקם את ה-vete בתוך מחזיק ה-vete, ואז אסובב את הגלגל, וכעת אני מוכן לטרנספקציה. אך לפני כן, אוודא שיש לי מצע חם מוכן להוספה לתאים שעברו טרנספקציה באופן מיידי. הוספת מצע חם לתוך ה-vete מיד לאחר הטרנספקציה מסייעת להעלות את חיוניות התאים.לכן, אני אכין פיפט P 1000. ובנוסף, אני אקח את הפלטה עם המצע שנמצאת כעת באינקובטור, כדי שאוכל להעביר את התאים למצע באופן מיידי. כעת, אני אלחץ שוב על Enter וזהו.ובטרנספקציה מוצלחת, כפי שניתן לראות, יש כאן שכבה עבה מאוד של בועות המעידה על טרנספקציה מוצלחת. לכן, אני עומד להוסיף 500 µL של מצע חם מראש לתוך ה-vete. אני מוסיף מצע נוסף שהתאים זקוקים לו נואשות, ואשתמש באותה פיפטת MX כדי להוציא את התאים מה-vete.לכן הם נמצאים כעת תחת עקה רבה. לכן, אעביר אותם ישירות למדיה חמה, למדיה חמה נוספת. ולסיום, בשלב האחרון, אשטוף את ה-Q vete עם מדיה מחוממת מראש כדי לוודא שאוציא את כל התאים הללו, ואעביר אותם לאותה באר L ואכניס את הפלטה למדגרה באופן מיידי.בתמונה זו, אנו רואים תאי קדם עצביים אנושיים שעברו טרנספקציה עם גורם גרעיני של גישה והונחו על לטיות כיסויה עם רשת. כך, אפילו יומיים לאחר הטרנספקציה, ניתן להבחין ביעילות טרנספקציה של כ-50% על ידי ביטוי GFP. היום הראיתי לכם כיצד לבצע טרנספקציה לתאי קדם עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני Xis.בהצלחה בתהליך הטרנספקציה שלכם.

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

סרטון זה מתאר טכניקת עריכת גנום מדויקת בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או hiPSCs, תוך שימוש ב- TALENs כדי ליצור שברים דו-גדיליים בלוקוס ממוקד, ולגרום לתיקון מכוון הומולוגיה לשילוב גנים של חלבון פלואורסצנטי.

שילוב גנים ממוקד בתיווך TALEN: שימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף מהונדס להחדרה מדויקת של גן חלבון פלואורסצנטי לתוך hiPSCs

סרטון זה מדגים תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים מהונדסים גנטית לתאי גזע עצביים. גורמי שעתוק המבוטאים על ידי תאי אב המטופויטיים מעוררים שרשרת של אירועים מולקולריים המאפשרים את טרנספורמציה. מדיה ספציפית נוספת משמשת לבחירה ולגידול של תאי גזע עצביים מושרים.

תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים לתאי גזע עצביים

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתמיין לנוירונים על ידי העברתם עם לנטי-וירוסים מהונדסים הנושאים גן גורם שעתוק נוירוגני תחת שליטה של אלמנט מגיב טטרציקלין, ולאחר מכן טיפול בנגזרת טטרציקלין ומדיום התבגרות.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

למדו את שיטת הטרנספקציה בתאי גזע עצביים אנושיים באמצעות מכשיר Nucleofector Amaxa. פרוטוקול זה מאפשר חקר יעיל של פונקציית גנים במערכת העצבים.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

גלה סרטונים נוספים