Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

שלום, אני סטיב. אני עובד במעבדה של ד"ר פלאנגן במחלקה לפתולוגיה ב-uc, Irvine. היום אראה לכם כיצד לבצע טרנספקציה של תאי אב עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני maxis.

ראשית, תזדקקו לכמות גדולה של תאים. אני ממליץ על בקבוק T 25 מלא (confluent) לפחות, כיוון שפרוטוקול זה דורש צפיפות תאים גבוהה מאוד, כך שתזדקקו למיליון תאים לפחות. ראשית, אתחיל בהסרת התאים מהמשטח באמצעות תמיסת פירוק תאים (cell dissociation buffer), ולאחר מכן אספור אותם.

לצורך הליך זה, עיינו בפרוטוקול האריזה שלי. הסיבה לכך שאני מעדיף את מערכת amaxa לניסויי הטרנספקציה שלי היא ש-amaxa מפתחת פרוטוקולי טרנספקציה מותאמים אישית לסוגי תאים ספציפיים, ובמקרה שלי, לתאי גזע עצביים. וזה עובד מצוין.

הדבר מניב יעילות טרנספקציה גבוהה מאוד וחיוניות תאים גבוהה מאוד. בואו נתחיל. כעת אני מוכן לבצע טרנספקציה.

כדי להתכונן לטרנספקציה זו, כבר ציפיתי את צלחת תרבית הרקמה שלי בפיברין למשך לילה. לאחר מכן, הוספתי אליה מצע גידול. כעת היא נמצאת באינקובטור בהמתנה להוספת התאים.

בנוסף, הכנתי את כל הרכיבים שלי, את וקטור ה-DNA ואת תמיסת הטרנספקציה. כולם ממתינים כאן על קרח, ואני מוכן להתחיל בתהליך הטרנספקציה.

זהו הגורם הגרעיני M max, ולפני שאני מניח אותו בתוך המנדף, אהדא אותו ב-70% ethanol, ולאחר מכן אנגב אותו בנייר סופג. ספרתי את התאים כך שיש לי סך כולל של 4 מיליון תאים והעברתי אותם למבחנה. כעת אני מוכן להתחיל בתהליך הטרנספקציה.

ראשית, אני אסיר את המצע שבו הם נמצאים. כעת יש לי את משקע התאים כאן, ואני אשאב החוצה את המצע שבו הם שהו. אנסה להסיר כמה שיותר מהמצע, כיוון שאיני רוצה שיהיו חלבונים או רכיבים דומים במצע הטרנספקציה, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על פרוטוקול הטרנספקציה.

הסרתי כמעט את כל המצע, וכעת אני עומד לרespend את משקע התאים הזה במאה מיקרוליטרים של תמיסת הגורם הגרעיני לתאי גזע עצביים של עכבר המנוסחת במיוחד זו. חברת Mxa מייצרת תמיסת טרנספקציה לטרנספקציית תאי גזע עצביים של עכבר, ואין לה תמיסה כזו לתאי גזע עצביים של בני אדם, אך מצאנו ששימוש בתמיסה עבור תאי עכבר עובד היטב. לכן, אני עומד להוסיף מאה מיקרוליטרים של תמיסת הגורם הגרעיני לתאי גזע עצביים של עכבר זו.

כעת אתה שוב תשהה את משקע התאים בתוכו היטב, כך שלא יישארו גושים של תאים. זאת כדי שיהיה לי תמיס תאים הומוגני. לכן, אבצע פיפוט מעלה ומטה כ-10 פעמים.

אני סבור שכעת יש לי תערובת הומוגנית למדי, ואעביר אותה כעת למבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.5 ml. אני משתמש בפיפט P 1000 ואוודא שאשאב את כל התמיסה. כעת יש לי 4 מיליון תאים רסוספנדים בתמיסת טרנספקציה לעכברים, וכעת אוסיף 5 µL מהווקטור שלי.

לכן השארתי את זה על קרח במשך כל הזמן עד כעת. וכך אני עומד, ראשית, להעביר 5 µL. כעת אוסיף זאת לת сусפנזיית התאים.

כעת אשתמש ב-P 200 המכוון לסביב 50 µL, ואערבב את התאים עם הווקטור באופן יסודי מאוד. לכן, אבצע פיפטינג (שאיבה ושחרור) 10 פעמים. אוקיי, זה מוכן.

וכעת אני מוכנה לביצוע הטרנספקציה. לכן, אני אפתח קיט חדש, ואקח גם פ pipette מיוחדת שסופקה על ידי amaxa.

כעת אסיר את הפקק ואמשוך בעדינות את התערובת הזו למעלה. אני אכניס את הפ pipette עד סוף ה-vete ואלחץ בעדינות להוצאת התמיסה. כעת אפעיל את ה-max nuclear factor, ואגדיר אותו ל-33 0 3 3 ואלחץ על enter.

כעת אני אמקם את ה-vete בתוך מחזיק ה-vete, ואז אסובב את הגלגל, וכעת אני מוכן לטרנספקציה. אך לפני כן, אוודא שיש לי מצע חם מוכן להוספה לתאים שעברו טרנספקציה באופן מיידי. הוספת מצע חם לתוך ה-vete מיד לאחר הטרנספקציה מסייעת להעלות את חיוניות התאים.

לכן, אני אכין פיפט P 1000. ובנוסף, אני אקח את הפלטה עם המצע שנמצאת כעת באינקובטור, כדי שאוכל להעביר את התאים למצע באופן מיידי. כעת, אני אלחץ שוב על Enter וזהו.

ובטרנספקציה מוצלחת, כפי שניתן לראות, יש כאן שכבה עבה מאוד של בועות המעידה על טרנספקציה מוצלחת. לכן, אני עומד להוסיף 500 µL של מצע חם מראש לתוך ה-vete. אני מוסיף מצע נוסף שהתאים זקוקים לו נואשות, ואשתמש באותה פיפטת MX כדי להוציא את התאים מה-vete.

לכן הם נמצאים כעת תחת עקה רבה. לכן, אעביר אותם ישירות למדיה חמה, למדיה חמה נוספת. ולסיום, בשלב האחרון, אשטוף את ה-Q vete עם מדיה מחוממת מראש כדי לוודא שאוציא את כל התאים הללו, ואעביר אותם לאותה באר L ואכניס את הפלטה למדגרה באופן מיידי.

בתמונה זו, אנו רואים תאי קדם עצביים אנושיים שעברו טרנספקציה עם גורם גרעיני של גישה והונחו על לטיות כיסויה עם רשת. כך, אפילו יומיים לאחר הטרנספקציה, ניתן להבחין ביעילות טרנספקציה של כ-50% על ידי ביטוי GFP. היום הראיתי לכם כיצד לבצע טרנספקציה לתאי קדם עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני Xis.

בהצלחה בתהליך הטרנספקציה שלכם.