Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa
July 19th, 2007
היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.
היי, אני סטיב. אני עובדת במעבדה של ד"ר פלנגן במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. היום אני הולך להראות לכם כיצד להעביר תאי קודמן עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני מקסיס.
ראשית, תזדקק להרבה תאים. הייתי אומר לפחות בקבוק T 25 קונפלואנט מכיוון שהפרוטוקול הזה דורש צפיפות תאים גבוהה מאוד, כך שתצטרך לפחות מיליון תאים. ראשית, אתחיל בהורדת התאים מעל פני השטח באמצעות מאגר דיסוציאציה של תאים, ולאחר מכן לספור אותם.
ולהליך זה עיין בפרוטוקול האריזה שלי. והסיבה שאני מעדיף מקסימום מקסימום לניסויי הטרנספקט שלי היא כי אמקסה מפתחת פרוטוקולי טרנספקציה מותאמים אישית לסוגי תאים ספציפיים, ובמקרה שלי, לתאי גזע עצביים. וזה עובד מצוין.
זה נותן יעילות טרנספקט גבוהה מאוד וכדאיות תאים גבוהה מאוד. ובואו נתחיל. אז עכשיו אני מוכן לעשות טרנספיקציה.
אז כהכנה לטרנספקציה הזו, כבר קידדתי את צלחת תרבית הרקמה שלי עם פיברין בן לילה. ואחרי זה, הכנסתי לזה כמה אמצעי צמיחה. אז כרגע הוא יושב באינקובטור ומחכה לקבל את התאים.
כמו כן, הכנתי את כולם, את כל הריאגנטים שלי, את וקטור הדנ"א שלי ואת תמיסת הטרנספקציה. אז כולם מחכים כאן על הקרח. ואני מוכן להתחיל את הטרנספקציה.
אז זה הגורם הגרעיני M max, ולפני שאני מכניס אותו למכסה המנוע, אני הולך לחטא אותו עם 70% אתנול, ואז אני הולך לנגב אותו עם מגבת נייר. אז פשוט ספרתי את עצמי כך שיהיו לי 4 מיליון תאים בסך הכל ואני משריץ אותם. ועכשיו אני מוכן להתחיל לעבור טרנסקטציה.
אז קודם כל אני הולך להסיר את המדיה שבה הם נמצאים. אז יש לי את המשטח הסלולרי שלי ממש כאן, ואני הולך לשאוב את המדיה שבה הם היו. ואני אנסה להסיר כמה שיותר מדיה כי אני לא רוצה שיהיו חלבונים או כאלה באמצעי הטרנספקציה כי זה עלול להשפיע על פרוטוקול הטרנספקציה.
אז הסרתי פחות או יותר את רוב המדיה, ועכשיו אני הולך להשעות מחדש את משטח התאים הזה במאה מיקרוליטר של תמיסת הגורם הגרעיני של תאי גזע עצביים של עכברים שפותחה במיוחד. Mxa מייצרת פתרון טרנספקציה להעברת תאי גזע עצביים של עכברים, ואין להם פתרון לתאי גזע עצביים אנושיים, אבל מצאנו שהשימוש בתאי עכבר עובד טוב מאוד. אז אני הולך לשאול מאה מיקרוליטר של תמיסת האפקטור הגרעיני של תאי גזע עצביים של עכבר.
ואני הולך לתלות את משטח התאים שלי בתוכו היטב, כך שלא יישארו גושי תאים. אז פחות או יותר, יש לי תרחיף תאים הומוגני. אז אני הולך לזרוק למעלה ולמטה בערך 10 פעמים.
אז אני חושב שעכשיו יש לי תערובת די הומוגנית, ואני הולך להעביר אותה עכשיו לתוך שפופרת דורף פתוחה של 1.5 מיל. אז אני משתמש בפיפטה P 1000 ואני הולך לוודא שאני מקבל את כל הפתרון הזה. אז עכשיו יש לי את 4 מיליון התאים שלי תלויים בעכבר, תמיסת טרנספקציה חדשה של עכבר, ועכשיו אני הולך להוסיף חמישה מיקרוליטרים של הווקטור שלי.
אז שמרתי אותו על הקרח כל הזמן הזה עד עכשיו. אז אני הולך, קודם כל אני ארבע, חמישה מיקרו-ליטר. אז עכשיו אני הולך להוסיף אותו לתרחיף התאים.
עכשיו אני הולך להשתמש ב-P 200 שנקבע לכ-50 מיקרוליטר, ואני הולך לערבב את התאים עם הווקטור ממש ממש טוב. אז אני הולך לזרוק אותו למעלה ולמטה 10 פעמים. אוקיי, אז זה מוכן.
ואני, אני מוכן לטרנספיקציה. אז אני הולך לפתוח אט חדש. וגם אני הולך לקבל פיפטה מיוחדת שמסופקת על ידי amaxa.
אז אני הולך להסיר את הפקק ואני הולך למשוך בעדינות את התערובת הזו. ואני הולך להכניס את הפיפטה עד הסוף לתוך הווט ולסחוט בעדינות את התמיסה. אז אני הולך להפעיל את הגורם הגרעיני המקסימלי, ואני הולך להגדיר את זה ל-33 0 3 3 הולך ללחוץ על Enter.
לאחר מכן אני הולך לשים את הווט במחזיק הווט, ואז אני הולך לסובב את הגלגל, ועכשיו אני מוכן לבצע טרנספקציה. אבל לפני כן, אני הולך לוודא שיש לי מדיה חמה מוכנה להוספה לתאים שעברו טרנספטציה באופן מיידי. זה עוזר להגביר את כדאיות התאים אם אני מוסיף מדיה חמה לתוך הווטרינר מיד לאחר טרנספקציה.
אז אני הולך להכין P 1000. וכך, ואני גם הולך לשחק עם המדיה שיושבת עכשיו בחממה כדי שאוכל להעביר את התאים למדיה באופן מיידי. אז עכשיו אני, עכשיו אני הולך ללחוץ שוב על Enter וזה נעשה.
והטרנספקציה המוצלחת, כפי שאתם יכולים לראות, יש לכם כאן שכבה עבה מאוד של בועות שמצביעות על טרנספקציה מוצלחת. אז אני הולך להוסיף 500 מיקרוליטר של חומר חימום מוקדם. אז אני מוסיף עוד מדיה שהתאים רוצים נואשות, ואני הולך להשתמש באותה פיפטה MX כדי להוציא את התאים מהווט.
אז הם ממש לחוצים כרגע. אז אני הולך להכניס אותם ישירות למדיה חמה, מדיה חמה יותר. ולבסוף, השלב האחרון, אני הולך לשטוף את ה-Q vete עם עוד קצת חומר חימום מראש כדי לוודא שאני מוציא את כל התאים האלה, ואני הולך למקם אותו בזה לתוך אותה באר L ולהניח את הצלחת לתוך האינקובטור מיד.
בתמונה זו, אנו רואים תאי מבשר עצביים אנושיים שהועברו עם גורם גרעיני גישה ומצופים על פתקי כיסוי מרושתים. כך שאפילו יומיים לאחר הטרנספקציה, יש לנו כ-50% יעילות טרנספקציה שאנו יכולים לראות על ידי ביטוי GFP. היום הראיתי לכם כיצד להעביר תאי קודמן עצביים אנושיים באמצעות גורם גרעיני Xis.
בהצלחה עם הטרנספקציה שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להחדרת גנים לתאי גזע/תאים מקדימים עצביים אנושיים (hNSPCs) באמצעות מכשיר האלקטרופורציה Nucleofector. התהליך חיוני לחקר תפקוד גנים in vivo.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה תאית
- ניתוח תפקוד גנים
רקע
- טרנספקציה היא טכניקה מרכזית לחקר גנים.
- תאים מקדימים עצביים אנושיים חיוניים למחקר מדעי העצב.
- טכנולוגיית Nucleofector משפרת את יעילות הטרנספקציה.
- הבנת תפקוד גנים יכולה להוביל לתובנות בנוירוביולוגיה.
מטרת המחקר
- להחדיר גן מעניין ל-hNSPCs.
- להבהיר את תפקוד הגנים בהקשר עצבי.
- לספק פרוטוקול אמין לחוקרים.
שיטות בשימוש
- ניתוק תאים באמצעות חיץ.
- ספירת תאים כדי להבטיח צפיפות גבוהה.
- שימוש במכשיר ה-Nucleofector לאלקטרופורציה.
- טרנספקציה של תאים מקדימים עצביים אנושיים.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של hNSPCs.
- צפיפות תאים גבוהה חיונית לטרנספקציה יעילה.
- הפרוטוקול מדגים שיחזור בתוצאות.
- מאפשר מחקרים נוספים על תפקוד גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל להחדרת גנים ב-hNSPCs.
- מספק בסיס למחקר עתידי במדעי העצב.
- משפר את ההבנה של תפקידי גנים בהתפתחות עצבית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Transfecting human neural stem/precursor cells (hNSPCs) remains a bottleneck in neuroscience target validation due to low efficiency and viability with conventional methods. The Nucleofector electroporation protocol described enables reliable gene delivery with ~35% initial and ~70% stable transfection efficiency, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach improves predictive confidence for pathway interrogation and functional target validation in neurodegenerative disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets in a physiologically relevant human neural system.
- Operational Value: Achieves high transfection efficiency without viral vector production timelines or biosafety concerns.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking gene modulation to neural phenotypes in a scalable format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs (e.g., GFP expression) for dose-response and phenotypic screening.
- Operational Value: Uses standardized electroporation parameters and optimized buffer for reproducible results across experiments.
- Assay Readiness: Produces stably transfected cells suitable for long-term assay development and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses primary human neural cells, enhancing relevance to human disease mechanisms over immortalized lines.
- Preclinical Modeling: Enables creation of isogenic neural models for target validation and mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates early assessment of target modulation effects before committing to in vivo models.
Pipeline & Workflow Integration
The Nucleofector transfection method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through to lead identification by enabling reliable gene modulation in disease-relevant human neural cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via efficient gene overexpression or knockdown in hNSPCs.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable transfection metrics for compound screening and target validation.
- Analytics: Enables fluorescence-based readouts (e.g., GFP) to quantify transfection efficiency and correlate with phenotypic outcomes.
- Translational Research: Uses primary human cells to improve translational fidelity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable transfection platform for multiple targets and programs in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through efficient, reproducible gene delivery in primary human neural cells.
- Operational Value: Eliminates need for viral vector production, reducing timelines and biosafety overhead.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional assessment of targets in a human-relevant system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing biological ambiguity in target mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and electroporation optimization.
- Depends on access to Nucleofector device and cell-type-specific transfection solutions.
- Necessitates standardization of cell density and DNA concentration across users and labs.
- Involves adaptation considerations when extending to other primary neural or non-neural cell types.
- Limited by the need for high cell input and immediate post-transfection handling to maintain viability.
