Name: סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למדו לסמן קצוות דוקרניים של F-אקטין חופשי בקונוסי צמיחה עצביים באמצעות אקטין רודמין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקת האקטין והשפעת רמזי הכוונה על צמיחת עצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר ג&#39;יימס Bamburg ואנשי המעבדה שלו לשיתוף פעולה במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי מענקים NIH HD19950, EY07133 ועל ידי תרומות של קרן רפואית מינסוטה.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטות שהוצגו כאן לאפשר ברזולוציה של זמן ומרחב של מרכיבים תאיים המעורבים בשיפוץ הדינמי של cytoskeleton אקטין בשוליים מובילה של נודדות קונוסים צמיחה. הפעולה של מולקולות attractant, כמו NGF או netrin, במהירות כדי לעורר פילמור אקטין נימה מתגלה גידול מקומי מסתיים אקטין תיל, נוצר על ידי ניתוק חוט אקטין מופעל על ידי ADF / cofilin 10, כפי שמוצג איורים 1 ו -2. השיטה מאפשרת לוקליזציה של חלבונים אחרים המעורבים בתיווך חרוט צמיחה התגובות chemotropic, כגון radixin, חלבון ERM, בתמונה...

<table><tbody><tr><td>לוחית כיסוי 18x18 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 35mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>דבק לאקווריומים</td><td></td><td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td><td>כל חנות חומרי בניין</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (mw &amp;gt; 300,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>למינין טבעי מעכבר</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine non-muscle actin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

סימון ה-f-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין rhodamine ב permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

טיפים ניעתי של אקסונים הגוברת נקראים גביעי צמיחה. קונוסים צמיחה להוביל בניווט אקסונים דרך הרקמות המתפתחות על ידי אינטראקציה עם ביטוי מקומי רמזים הדרכה המולקולרי אשר נקלטות חרוט קולטנים הצמיחה להסדיר את הדינמיקה ארגון של חרוט צמיחה cytoskeleton 3-6. היעד העיקרי של האותות הללו ניווט היא נימה אקטין meshwork הממלא את חרוט צמיחה בפריפריה וכי כוננים חרוט צמיחה תנועתיות באמצעות פילמור אקטין מתמשכת שיפוץ דינמי 7. רמזים הדרכה חיובית או אטרקטיבי לגרום חרוט צמיחה מפנה ידי גירוי אקטין נימה (F-אקטין) פילמור באזור הפריפריה צמיחה חרוט כי הוא קרוב יותר למקור של המקל attractant. זה פילמור אקטין כוננים הצמיחה המקומית חרוט בליטה, הדבקה של השוליים המובילים התארכות axonal כלפי attractant. פילמור אקטין נימה תלוי בזמינות של מונומר אקטין מספיק על גרעינים פילמור או חוט תיל אקטין מסתיים עבור תוספת של מונומר. מונומר אקטין זמין בשפע הגנגליון ברשתית ואת השורש הגבי חומוס (DRG) קונוסים צמיחה. כתוצאה מכך, גדל במהירות כאשר פילמור חינם F-אקטין מסתיים תיל להיות זמינים בנוסף מונומר. זה מתרחש חומוס DRG קונוסים צמיחה הרשתית באמצעות הפעלת המקומית של ה-F-אקטין אקטין ניתוק חלבון depolymerizing גורם (ADF / cofilin) ​​באזור הגידול חרוט קרוב 8-10 attractant. זו פעילות מוגברת ADF / cofilin מנתקת סיבי אקטין ליצור חדש F-אקטין מסתיים תיל פילמור. השיטה הבאה ממחישה את המנגנון הזה. תוכן הכולל של ה-F-אקטין הוא מדמיין על ידי צביעה עם phalloidin ניאון. F-אקטין מסתיים תיל הם דמיינו על ידי שילוב של אקטין rhodamine בתוך קונוסים צמיחה כי הם permeabilized עם ההליך המתואר להלן, אשר מותאם ממחקרים קודמים של תאים אחרים ניעתי 11, 12. כאשר rhodamine-אקטין נוסף בריכוז מעל ריכוז קריטי בנוסף מונומר אקטין מסתיים תיל, rhodamine-אקטין מרכיבה על קצות התיל חינם. אם קיו אטרקטיבית מוצג שיפוע, כגון ששוחרר micropipette ממוקם בצד אחד של חרוט צמיחה, שילוב של rhodamine-אקטין על ה-F-אקטין קצוות התיל יהיה גדול בצד חרוט הצמיחה כלפי micropipette 10 . קונוסים הצמיחה הם מבנים תאים קטנים ועדינים. הנהלים של permeabilization קיבעון rhodamine-אקטין, שילוב ויזואליזציה הקרינה הם עשו בקפידה ניתן לבצע על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. שיטות אלה ניתן ליישם לומד פילמור אקטין המקומית נוירונים נודדים, תאים ורקמות אחרות ראשוני או שורות תאים.

שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.

סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

הקצוות הניידים של אקסונים גדלים נקראים קונוסי צמיחה. קונוסי צמיחה מובילים אקסונים בדרכם דרך רקמות מתפתחות באמצעות אינטראקציה עם גורמים מקומיים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים ויזואלית את המיקום והמספר של קצוות barbed של f actin חופשי, הזמינים לפולימריזציה של אקטין בקונוסי צמיחה נוירונליים החשופים לרמזי הדרכה אקסונליים. דבר זה מושג תחילה על ידי טבילת נוירונים שגודלו על לביבות זכוכית (cover slips) בבופר המכיל ספונין כדי להפוך את קונוסי הצמיחה לחדירים. לאחר מכן, התאים נחשפים לבופר המכיל rumine actin למשך ארבע דקות כדי לאפשר ל-rumine actin להיכנס לקונוסי הצמיחה ולהיבנות (polymerize) על קצוות barbed של f actin חופשי.לבסוף, התאים מקובעים כימית ונשטפים כדי לשמר את התפלגות ה-F actin. קצוות משוננים (Barbed ends) ששילבו rumine actin. על בסיס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח כמותי של תמונות, מתקבלים תוצאות המראות שסימני הדרכה מושכים מגבירים את מספר ה-free f effectin.קצוות משוננים (Barbed ends) בקצה המוביל של קונוסי צמיחה נודדים. שלום, אני פול ארנו מהמחלקה למדעי העצבים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מינסוטה. היום נדגים הכנה של תרביות של קונוסי צמיחה עצביים של אפרוחים.נדגים שיטה להדמיה של הקצוות המהודפים (barbed ends) של פילמנטים של אקטין בתוך קונוסי גדילה, שהם רכיבי השלד התאי הדינמיים המניעים את האקסונים קדימה בעודם מנווטים דרך עוברים אל יעדיהם הסינפטיים. למרות שביצענו שימוש בשיטה זו כדי לחקור דינמיקה של אקטין וקונוסי גדילה של עצבים, ניתן להחילה אותה על תאים עצביים ניידים אחרים כגון גליות, תאי רב השכבה (neural crest cells) או נוירונים נודדים. הדגמת הפרוצדורות.היום יכינו חברי המעבדה, בוני מארק, עמיתת פוסט-דוקטורט, וחוסה סן מיגאל רויז, סטודנט לרפואה ולדוקטורט (MD PhD), את צלחות הווידאו המשמשות לסימון אקטין נוירונלי. יש לשטוף כיסויי זכוכית ריבועיים בגודל 18 מילימטרים או עגולים בקוטר 24 מילימטרים במים מזוקקים ולאפות אותם בחום יבש למשך שלושה חודשים או יותר. ניתן להחליף את שיטת האפייה בתנור בשיטות אחרות לניקוי כיסויי זכוכית. קדחו חורים עגולים בקוטר המתאים בתחתית של צלחות פטרי מפלסטיק או צלחות לתרביות רקמה בגודל 35 או 50 מילימטרים באמצעות שורן לשעם או מכשיר אחר. לאחר מכן, גרדו את קצות החורים שנקדחו בעזרת מספריים כדי ליצור משטח חלק משני הצדדים.בשלב הבא, מדביקים לכיסוי חור בכל צלחת לכיסוי זכוכית נקי באמצעות דבק סיליקון לאקווריומים, ושוטפים את הצלחות מספר פעמים במים מזוקקים סטריליים. הצלחות מוכנות כעת לציפוי תשתית. יש למרוח תמיסה של 100 µg/mL של PDL ו-PBS על לכיסויי הזכוכית או על צלחות הווידאו, ולהדגיר למשך שעתיים עד ארבע שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 °C.שאבו את תמיסת ה-PDL ושטפו את הזריקות שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים והניחו לייבש באוויר. לאחר מכן, הכינו תמיסת ניטרוצלולוז בריכוז 1% על ידי המסה של חמישה מיליגרמים של ניטרוצלולוז בחמישה מיליליטר של amyl acetate. גרפו 10 µL מתמיסה זו לחלק העליון של זריקה והטו אותה כדי לפרוס את התמיסה על פני השטח; הניחו לייבש באוויר במשך כ-10 דקות.לבסוף, מרחו 250 µL של laminin בריכוז 25 µg/mL, או 4 µg/mL של L one cam ב-PBS, על פני השטח של הניטרוסלולוז. דגרו במשך שש עד שמונה שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 °C. לאחר מכן, בתוך מנעול סטרילי לתרביות רקמה, שאבו את התסביך והוסיפו מיד מצע גידול, תוך הבטחה שהתסביך לא יתייבש.תרביות של גנגליון שורש אחורי (dorsal root ganglia או DRGs) או רקמות רשתית עצביות מוכנות על ידי דיסקציה של עוברי אפרוח ביום השביעי. שתלי DRG הם חצי גנגליון שלם, ושתלי רשתית הם בקוטר של 1 מילימטר או פחות.תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה כדי להניח את ה-explan על זכוכית כיסוי. לאחר מכן, לחצו עליו בעדינות במרכז זכוכית הכיסוי כדי למנוע תזוזה בזמן ההעברה לאינקובטור. את הצלחות עם זכוכיות הכיסוי מעבירים בזהירות ומניחים באינקובטור לח ומחומם למשך לילה או למשך 18 שעות.במהלך תקופה זו, אקסונים באורך של כמה מאות מיקרונים נמתחים מה-explan. הכינו את תמיפת החדירה של רמין-אקטין לשימוש על ידי הוספת הרכיבים הבאים, saponin A TP ו-LOR three 50 fein. הרכבה של תמיפה זו מתוארת בפרוטוקול הכתוב.הכינו תמיסה נפרדת המשתמשת באותם רכיבים בתוספת 0.45 micromolar ermine non-muscle actin T rate וערבבו באמצעות וורטקס כדי להחדיר ולסמן את התאים הנוירונליים. הוציאו בזהירות מהאינקובטור את צלחת התרבית עם שתלי DRG או רשתית ובצעו את השלבים הבאים בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפט, הסירו בזהירות את מצע התרבית והוסיפו מספיק בופר חדירה (permeation buffer) כדי לכסות את התאים, והדגרו למשך דקה אחת.הסר בעדינות את תמיפת החדירה (permeation buffer) והחלף אותה בתמיפה המכילה 0.45 micromolar rumine non-muscle actin; הדגר למשך ארבע דקות. לבסוף, הסר את התמיפה המכילה rumine actin וקבע את הנוירונים באמצעות 4%paraform aldehyde ו-0.05%glutaraldehyde למשך חמש דקות. שטוף בעדינות עם PBS והעבר למשקופיות זכוכית של שלושה אינץ' עם slow fade.השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי המצויד בעדשת אובייקטיב עם טבילת שמן 60x כדי להדמיות של שילוב R domine actin ב-f actin, קצוות מסוג barbed ends, וסימון פלואורסצנטי של f actin באזורי growth cones לקבלת הכימות הטוב ביותר של שילוב R domine actin. יש לאסוף את כל התמונות במפגש בודד תוך שימוש באותן הגדרות של רגישות (gain) וחשיפה במצלמה הדיגיטלית עבור כל תמונה. נתחו את הסימון מאזורים שווי ערך באמצעות metamorph image J או תוכנה דומה לניתוח תמונות.ניתן לבצע גם מספר וריאציות לנהרה זו. וריאציה אחת כוללת אימונוכימיה לאיתור חלבונים נוספים בנוסף ל-F actin ולקצוות משוננים (barbed ends). לאחר קיבוע של ה-rhodamine actin שהוטמע ושטיפה ב-PBS, ניתן להוסיף נוגדנים נגד רכיב אחר של קונו הגדילה, ולאחר מכן לבצע שטיפה, חסימה ודגירה עם נוגדן משני פלואורסצנטי המתאים לסימון משולש עם rhodamine actin ו-phalloidin פלואורסצנטי.וריאציה שלישית בוחנת את ההשפעות של סימני הדרכה על F FACT וקצוות מסמרים (barbed ends) חופשיים על ידי הוספת גורמי גדילה או סימני הדרכה לצלוחיות תרבית בתוך האינקובטור למשך חמש עד 15 דקות, לפני הוצאת הצלוחית מהאינקובטור ותחילת הליך החדירה. פעולה זו מאפשרת להעריך את ההשפעות קצר-הטווח של גורמי גדילה או סימני הדרכה על fac וקצוות מסמרים חופשיים. לחלופין, ניתן להניח צלוחית וידאו עם תרביות עצביות על משטח מיקרוסקופ מחומם ולהשתמש במיקרופיפט כדי לשחרר גורמי גדילה או סימני הדרכה במדרג בתוך קו ניבט עצבי לפני תחילת החדירה וההטמעה של rumine actin.ניתן להחדיר את גורמי הגדילה למשך זמן קצר של דקה אחת עד שתיים לפני תחילת הליך ההחדרה (permeation). ניתן לבצע את ההחדרה והקיבוע בעוד צלחת הווידאו נשארת על במת המיקרוסקופ. דבר זה מאפשר להעריך את ההשפעות המקומיות של מדרג רמזי הניווט (guidance cue gradient) על היווצרות F ACT וקצוות משוכות (barbed ends) חופשיים באזורי הגדילה (growth cones).סרטון זה מציג את ההתרחבות המהירה של שולי תרגיש הצמיחה (growth cone) המודאלי בתגובה להוספה גלובלית של NGF. כאשר תרגיש צמיחה של DRG מטופל גלובלית בגורם גדילה עצבי למשך חמש דקות, פולימריזציית אקטין מעוררת בשוליים המובילים, וניתן לראות פס בהיר של שילוב אקטין רומין מסביב להיקף תרגיש הצמיחה. סרטון זה מציג תרגיש צמיחה הפונה לעבר מיקרו-פיפט שמשחרר NGF ויוצר גרדיאנט של NGF המוצג כאן.כאשר צד אחד של קונו צמיחה של DRG נחשף למדרג של NGF למשך שתי דקות, הוא מעורר מקומית עלייה בשילוב של R domine actin לתוך F act וקצוות barbed חופשיים. בדוגמה זו, התפלגות ה-phospho RIN ridin moin נחשפת באמצעות אימונוכימיה. בנוסף לסימון F ACT וקצוות barbed חופשיים על ידי שילוב R Domine actin כאשר NGF מתווסף כאן באופן גלובלי, נוירונים של DRG עברו טרנספקציה משותפת עם GFP actin ומבנה דומיננטי שלילי של ezrin ridin moisan. NGF התווסף חמש דקות לפני סימון קצוות ה-barbed של f actin.שימו לב כי בקו הגדילה שעבר טרנספקציה עם מבנה ERM דומיננטי-שלילי ישנם מעט קצוות barbed של f actin בשוליים הקדמיים של קו הגדילה, דבר העומד בניגוד לקו גדילה סמוך שלא עבר טרנספקציה. על ידי שילוב של פרוצדורה זו עם אימונוכימיה, ניתן לקשר את הלוקליזציה של f ו-bardens לפיזור של חלבונים אחרים המווסתים את הדינמיקה והארגון של האקטין. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיזהר לא לפגוע במבנה העדין של קוני הגדילה של התאים.

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמה פלואורסצנטית של נוירונים בקליפת המוח של חולדה עבור מיקרוסקופיה. הוא מכוון לחלבונים מסוג F-actin וחלבונים דנדריטיים כדי לנתח שלמות מבנית ולחשב צפיפות F-actin, שהיא חיונית לחקר תפקוד עצבי ובריאות.

כימות של אקטין פונקטה נימה בתאי עצב קליפת המוח של חולדה

מקור: Alluri, H., et al. מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש כמודל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה במבחנה לחקר תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח. J. Vis. Exp. (2015). הסרטון מדגים את הלוקליזציה הפלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי מתח בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח של חולדות (RBMECs). בשכבה החד-שכבתית הלחוצה, נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית משמשים לתיוג חלבוני הצומת ההדוק, בעוד שהפלואידין המתויג בפלואורופור מסמן את סיבי הלחץ. המולקולות המסומנות מומחשות לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לוקליזציה פלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי עקה בתאי אנדותל

אקטין חוטי (F-actin) ממלא תפקיד חשוב בספינוגנזה, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. כימות של F-actin puncta הוא אפוא כלי שימושי לחקר שלמותם של מבנים סינפטיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים של כימות פונקטה F-actin המסומנת עם Phalloidin בתרביות עצביות קליפת המוח הראשוניות בצפיפות נמוכה.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

מולקולות הנחיית אקסון מווסתות את הנדידה העצבית וניווט ממוקד של חרוט גדילה. אנו מציגים שיטה רבת עוצמה, מבחן הפסים, להערכת יכולתן של מולקולות הנחיה למשוך או לדחות נוירונים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את בדיקת הפסים על ידי הצגת יכולתו של FLRT2 להדוף נוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים.

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

למדו לסמן קצוות דוקרניים של F-אקטין חופשי בקונוסי צמיחה עצביים באמצעות אקטין רודמין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקת האקטין והשפעת רמזי הכוונה על צמיחת עצבים.

סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

גלה סרטונים נוספים