Name: פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: למדו פיתוח מרקר לבחירה שלילית ב-Entamoeba histolytica באמצעות מערכת FCU1 והפרודרוג 5-fluorocytosine. שיטה זו מאפשרת סילוק סלקטיבי של תאים מושתלים ומסייעת במניפולציה גנטית של הטפיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר Erbs פיליפ לספק לנו את הרצף של הגן FCU1. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AI 26649.

1. FCU מערכת סלקציה שלילית ב Entamoeba histolytica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת וקטור קו (HM1 / pKT3M) ואת קו ניסיוני (HM1/pKT3M-FCU1) נוצרו על ידי 1,2 הטכניקות המתוארות קודם לכן. זרעים הקווים תחת מחקר מן המניות לתוך צינורות T-25 צלוחיות ולשמור הבחירה על ידי הוספת אנטיביוטיקה המתאימה (12 מיקרוגרם / מ"ל G418) בינוני 3 TYI-S-33. צלוחיות צריך להיות 70-80% ומחוברות לאחר 16-18 שעות של צמיחה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טרי המניות של 5-50mm Fluorocytosine (5-FC, Sigma) במדיום TYI-S-33 חם. וורטקס בקפדנות במשך מספר דקות לפרק 5-FC לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון המניות על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר trophozoites ידי הצבת צלוחיות על קרח למשך 3-5 דקות לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 200xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה במדיום TYI טריים לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב של ניסוי טיפוסי משתמשת 0.5 x 10 4 תאים לכל גם צלחת 48 באר נפח סופי של 1 מ"ל, וחוזר בשלושה עותקים עבור כל תנאי הבדיקה. בנוסף, כדי להקל על המדידות ניאון, צלחת נפרדת משמש עבור כל זן לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 Seed x 10 4 תאים לכל טוב עבור כל בדיקה 5-FC ריכוז, בשלושה עותקים. שמירה על לחץ ברירה אנטיביוטי במדיום TYI. עכשיו להוסיף את הכמות הנדרשת של פתרון FC-5 המניות trophozoites היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות בתיק אנאירובי על 37 ° C. </li></ol> 2. קביעת יעילות לבחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות של תא גשש ירוק CMFDA (Invitrogen) ב DMSO. כדי להפוך את הפתרון עובד לדלל את המניות של פי 1000 בינוני TYI בסרום חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בינוני לחלוטין צלחות תרבות trophozoite ולהחליף 150 CMFDA μL TYI סרום ללא המכיל. המשך דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון לצבוע מבארות ולקרוא את הצלחת spectrofluorometer M2 microplate Spectramax. גל עירור צריך להיות מוגדר ב 492 ננומטר ואת פליטת הקרינה לקרוא 517 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את ערכי הקרינה עבור התאים מלאה מול transfectants הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לקרוא את הלוחות במרווח בכל פעם. שימוש חיובי המתאים (TYI בלבד) והשלילי (25 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin) בארות שליטה כל צלחת. </li></ol> 3. נציג תוצאות E. transfectants histolytica הראו ביטוי חזק של FCU1 קודון רקומביננטי אופטימיזציה (איור 1). כאשר פרוטוקול זה הוא לאחר נכונה התוצאה היא חיסול סלקטיבי של E. histolytica תאים להביע FCU1 בנוכחות מ"מ 0.5 5 fluorocytosine. תאים הבקרה, בניגוד להמשיך לצמוח בדרך כלל במהירות של עד 5 מ"מ בריכוז של 5-FC ולהגיע מפגש בין 72 לבין 96 שעות (איור 2). FCU1 התאים נושאת ב 48 שעות הם lysed לחלוטין כאשר בארות מטופלים הם מתחת למיקרוסקופ. אלה גם להראות ירידה הקרינה כאשר מוכתמות חיוני לצבוע CMFDA, המשמש במחקרים כמותיים מעורבים מספר גדול של דגימות (תמונה 2 ב). מערכת FCU1/5-FC היא כלי אפקטיבי ורב עוצמה סלקציה שלילית עבור E. histolytica trophozoites. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הדור של E. histolytica HM1 transfectants להביע סמן לבחירה שלילית (א) חלבון רקומביננטי FCU1 זוהה על כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי-c myc (הפאנל העליון). כצפוי, הלהקה 42kDa ניתן היה לזהות (המוצג על ידי החץ) ב lysate הכולל מן transfectants FCU אך לא וקטור לבד transfectants שליטה. הפאנל התחתון מראה את אותו כתם נחקר עם נוגדן אנטי אקטין כביקורת הטעינה. (ב) תוצאות של זמן אמת כמותי PCR מראה ביטוי של mRNA FCU1 ספציפי מנורמל לשלוט lgl4. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור במבחנה התרופה הרגישות של E. histolytica transfectants להביע סמן לבחירה שלילית הישרדות של עקומות (א) transfectants מלאה (ב) transfectants FCU1 להביע בתרבית בצלחת 48-היטב. התאים גדלו בנוכחות ריכוזים הגוברת של prodrug-5-fluorocytosine; הישרדות התא היה לכמת ידי מכתים CMFDA במרווח כל הזמן מסומן על ציר ה-X. ציר Y מייצג יחידות פלואורסצנטי הוא השתקפות ישירה של האוכלוסייה התא לשרוד. שים לב FCU1 transfectants להביע הראו רגישות משמעותית בריכוז prodrug 0.5mm לעומת שליטה. תאים לא נצפו בנקודת זמן 120h אלה בארות כמו compared לצמיחה ומחוברות לראות את הבארות בקרה המתאימים תחת מיקרוסקופ (מידע לא מוצג). Hygro מציין 25μg / mL hygromycin לשמש מלאה שלילי.

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
<li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica%3A+implications+for+approaches+to+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li>
<li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukaryot.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li>
<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
<li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li>
<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

ההפקה של הוידאו הזה מומן על ידי חברת סיגמא אלדריץ&#39;, Inc, אשר מייצרת כמה חומרים כימיים המשמשים במאמר זה.

אמנם יש כבר התקדמות ניכרת כלים Entamoeba ביולוגי מולקולרי אין השיטות הקיימות זמין למחוק או לשבש גנים 4. מציאה של ביטוי גנים ספציפיים הושג על ידי שימוש RNAs מכבנה 5, קטן מפריע RNA 6 והביע bacterially dsRNA 7. אולם שיטות אלו תוך יעיל עבור גני מטרה בהתאמה, יש מספר מגבלות, כולל שימוש בכימיקלים יקרים, מבחר מתמשך נגד אנטיביוטיקה את הצורך באימות מתמדת עקב שכיחות גבוהה של חזרה המתרחשים לאורך זמן (אלישיה Linford, תקשורת אישית) 8. הפלסמיד כל יכול לשכפל Entamoeba כפי שיש כנראה לא דרישה רצף קפדנית על מקורותיה של שכפול הדנ&quot;א 9, transfected כך פעם, זה בדרך כלל קשה לרפא פלסמיד. זה מגביל את השימוש האפשרי של פלסמידים שלמים בניסויים רקומבינציה ואת הגן בנוקאאוט. סמני סלקציה שלילית הם רכיבי מפתח של גן מיקוד שיטות כפי שהם יכולים לשמש כדי לחסל subpopulations רקומביננטי. אנחנו הבענו בהצלחה קודון אופטימיזציה FCU1 גנים Entamoeba histolytica נבדק הפוטנציאל שלה כסמן לבחירה שלילית. היתוך גן זה שימש לטיפול גן התאבדות של תאים סרטניים אנושיים חילוף החומרים prodrug 5-FC למוצרים במורד רעילים וכתוצאה מכך עיכוב סינתזה של RNA-DNA 10. FCU1 שימש לאחרונה כסמן לבחירה שלילית Plasmodium, עוד טפיל protozoan. Plasmodium תאים berghei להביע FCU1 נמצאו 1000 כמעט פי רגישים יותר prodrug במבחנה טיפול vivo עם 5-FC נהרגו מעל 99.9% של הדבקה של טפילים רקומביננטי במודל האריתרוציטים בשלב העכבר של מלריה 11. E. תאים histolytica להביע FCU1 הראו רק רגישות פי 30 עלה ל prodrug 5-FC בניגוד רגישות שנצפתה פ berghei. הסיבות האפשריות לכך יכולה להיות מאגר גדול של נוקלאוטידים הזמינים בינוני הצמיחה מתחרים עם מטבוליטים רעילים. בשני פ berghei ו פ falciparum סמן FCU1 נעשה שימוש שיבוש גנטי ממוקד. מחקרים 11,12. אנו שואפים לשנות את הגנום Entamoeba באמצעות הומולוגיים רקומבינציה. אימות של מערכת מבחר FCU1/5-FC השלילי הוא צעד משמעותי לקראת המטרה הזאת.

<table><tbody><tr><td>מצע TYI-S-33</td><td>ATCC</td><td></td><td>הספרות המקושרת מופיעה בטקסט</td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=he&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=חיפוש_שרשור_מספר_קטלוג%7Cמפתח_מותג&amp;amp;F=SPEC&quot;&gt;5-פלואורוציטוזין&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Cell tracker green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>קורא לוחיות Spectra Max M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח מרקר לבחירה שלילי entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica הוא סוכן סיבתי של amebiasis ומדביק עד 10% מאוכלוסיית העולם. בטכניקות מולקולריות אפשרו למעלה ולמטה ויסות של ביטוי גנים להסתמך על transfection של פלסמידים נשמר ביציבות. בעוד אלה הגדילו את ההבנה שלנו של גורמים Entamoeba ארסיות, היכולת לשלב את ה-DNA אקסוגני לתוך הגנום, אשר תאפשר להפוך ניסויים גנטיקה, יהיה יתרון משמעותי במחקר של טפיל זה. האתגרים שהוצגו על ידי אורגניזם זה כוללים חוסר יכולת לבחור עבור הומולוגיים אירועי רקומבינציה וקושי לרפא DNA פלסמיד episomal מ trophozoites transfected. התוצאות מאוחר יותר ברקע גבוהה של DNA אקסוגני, בעיה מרכזית בזיהוי של trophozoites שבו אירוע בתום לב אינטגרציה הגנומי התרחשה. אנו מדווחים על פיתוח של מערכת המבוססת על סלקציה שלילית ביטוי מהונדס של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל transferase phosphoribosyl הכימרה (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). האנזים ממיר FCU1 רעיל 5-FC לתוך fluorouracil-5 רעילים 5-fluorouridine-5&#39;-monophosphate. E. קווי histolytica להביע FCU1 נמצאו 30 לקפל רגישים יותר prodrug לעומת זן הביקורת.

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת בחירה שלילית<em&gt; א histolytica</em&gt; מבוסס על ביטוי של חלבון מהונדס chimeric (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine. החלבון FCU1 הוא שילוב של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל phosphoribosyltransferase. הביטוי של FCU1 הביא מוגבר<em&gt; א histolytica</em&gt; רגישות כלפי 5-fluorocytosine.

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

.Entamoeba histolytica הוא הגורם למחלת האמיביאזיס ומדביק עד 10% מאוכלוסיית העולם. הטכניקות המולקולריות שאפשרו את ה...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לתקף את השימוש במערכת 5-FC FCU1 כשיטה לברירה שלילית ב-Enterhistolytica. בלוחות של 48 בארות, זרעו E. histolytica, בצעו טרנספקציה לקווים המבטאים את הגן FCU1 או בקרה וקטורית מתאימה, וטפלו את התאים בתרופה המקדימה 5-FC. בתאים המבטאים רמות גבוהות של FCU1, ה-5-FC יומר לכמויות יעילות של תוצרי קצה רעילים. אוכלוסיית התאים השורדת נצבעת ב-CMFDA כדי להדגים את הסילוק הסלקטיבי של תאים המבטאים FCU1 בנוכחות 5-FC ולהשוות באופן כמותי את יעילות הברירה השלילית. מערכת ברירה שלילית זו תאפשר לנו לנקות לראשונה פלסמידים אפיסומליים מ-E. histolytica שעברו טרנספקציה.בהתחשב באתגר המהווה נוכחות כנגד מניפולציה גנטית קונבנציונלית, שיטה זו עשויה לאפשר לנו לשבש ולמחוק גנים, ולאחר מכן לבחון גורמי VIR מטרה בתוכנית הגילוי של התרופות שלנו. טרופוזואיטים יכולים להשתנות במידת השגשוג של תרביות המקור בתרבית. שגיאה בשלב ההתחלה עלולה ליצור ארטיפקטים, ולכן שלב מוקדם קריטי הוא בקרת איכות של תרבית המוצא.זרע את קווי התאים של inba hisa הנחקרים ממבחנות מלאי לבקבוקי T 25 ושמור על סלקציה על ידי הוספת האנטיביוטיקה המתאימה למצע TYIS 33. דגרי את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 שעות עד שהתרביות יגיעו לכ-80% confluence. לצורך הליך זה, הכן תמיד מלאי טרי של 50 millimolar של five fluorine או FC ב-TYIS 33 חם.יש לערבב את המצע ב-vortex באופן מאומץ למשך מספר דקות עד להמסה מלאה של חמשה FC ולסנן, עיקר את תמיסת המקור באמצעות מסנן של 0.22 micron כדי לאסוף את הטרופוזואיטים. יש להניח את הבקבוקים על קרח למשך שלוש עד חמש דקות ולאסוף את התאים על ידי סבב בצנטריפוגה במהירות של 200 times gravity למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשעות מחדש את המשקעת במצע TYI טרי, ולספור את התאים כדי לאפשר מדידות פלואורסצנטיות בהמשך התהליך.בצעו את הניסויים בשלוש חזרות והשתמשו בלוח 48 בארות נפרד עבור כל זן בכל נקודת זמן. זרעו 0.5 × 10⁴ תאים לכל בארה בנפח של 0.5 milliliters עבור כל ריכוז של 5-FC, ושמרו על לחץ ברירה של האנטיביוטיקה במצע TYI. כעת, הוסיפו לבארה את הכמות הנדרשת של תמיסתו המרוכזת של 5-FC, ולאחר מכן מצע TYI עד לנפח סופי של 1 milliliter, והדגרירו את הלוחות בשקית אנאירובית בטמפרטורה של 37 °C.הכינו תמיסת מלאי של cell tracker green C-M-F-D-A בריכוז של 2 mg/mL ב-DMSO. לאחר מכן, כדי להכין את תמיסת העבודה, דללו את תמיסת המלאי פי 1000 במצע TYI נטול סרום בנקודות הזמן הניסיוניות שצוינו. הסירו את המצע לחלוטין מלוחיות תרבית Tropho Xite והחליפו אותו ב-150 µL של מצע TYI נטול סרום המכיל C-M-F-D-A.המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת, ושאבו את תמיסת ה-DI מהבארות. לבסוף, קראו את הפלטה במכשיר ה-spectra max M two microplate spectro fluorimeter, תוך שימוש באורך גל עירור של 492 nm ואורך גל פליטה פלואורסצנטית של 517 nm. השוו את ערכי הפלואורסצנציה בין תאי הבקרה לבין התאים שעברו טרנספקציה בניסוי.המשיכו לקרוא את הלוחיות בכל מרווח זמן. השתמשו תמיד בבארות בקרה חיוביות ושליליות מתאימות בכל לוחית. ניתוחי Western BLO מדגימים יצירה מוצלחת של תאי lya טרנספקט המבטאים את ה-FCU one, כימרה של cytosine deaminase של שמרים ו-uracil phospho rib transferase.תוצאות אלו באות לידי ביטוי גם במדידות qPCR כמותיות. בנוכחות של five fluorine, תאי בקרה גדלים באופן נורמלי בריכוז של עד 5 millimolar ומגיעים לקונפלואנס בין 72 ל-96 שעות. לעומת זאת, תאי e histolytica המבטאים FCU one ממוגברים באופן סלקטיבי בנוכחות של 0.5 millimolar של התרופה המקדימה (prodrug) תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר.התגובה הסלקטיבית של תאי E histolytica המבטאים FCU לתרופה FC Pro נראית כהתפנות של התאים. במקרה זה, התרביות גודלו 72 שעות לאחר הטרנספקציה. בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור לנטר את הצמיחה בכל נקודת זמן.ניתן להשתמש בשיטה זו במוטגנזה מסוג hit and run, אותה נשתמש כדי לענות על שאלות חשובות בנוגע לעוצמת המחלה (virulence) של Inba Hisa.

development-of-a-negative-selectable-marker-for-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

הדבקת בני אדם על ידי Entamoeba histolytica מובילה לamoebiasis, גורם עיקרי לשלשולים בארצות טרופיות. זיהום הוא ביוזמת אינטראקציות הפתוגן עם תאי אפיתל במעי, מעורר הפתיחה של אנשי קשר תאי תאים וכתוצאה מכך שלשולים, לפעמים אחריו דלקת בכבד. מאמר זה מספק מודל כדי להעריך את האינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מוקדם כדי לשפר את ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.

התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

שימוש בחומרים זמינים, זו מערכת קומפוסט biocontained מאפשר יעיל באתר סילוק פגרי בעלי חיים גדולים הנובעים במקרה של התפרצות מחלות זיהומיות. הליך זה הורג גורמים מדבקים ביותר פגרים וזבל מזוהמים. פעם סוכן זיהומיות הוא אישר שאינו בר קיימא, קומפוסט בוגר ניתן להפיץ כדשן.

פגר קומפוסט Biocontained לבקרת להתפרצות מחלות מדבקות של בעלי חיים

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא...

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

למדו פיתוח מרקר לבחירה שלילית ב-Entamoeba histolytica באמצעות מערכת FCU1 והפרודרוג 5-fluorocytosine. שיטה זו מאפשרת סילוק סלקטיבי של תאים מושתלים ומסייעת במניפולציה גנטית של הטפיל.

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica

גלה סרטונים נוספים