Name: הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: למדו הכנת סיבים לביים מחושמלים בספונין להערכת זרחון חמצוני מיטוכונדרי באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פעילות מיטוכונדרית בלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מכוני הבריאות הקנדי למחקר הגנום קנדה. JS מחזיק תמיכה משכורת פרסים מן המורשת אלברטה קרן למחקר רפואי לב, ושבץ קרן של קנדה איגוד הסוכרת הקנדית. המעבדה רוצה להכיר סיוע טכני של מכשירים Oroboros במהלך רכישת טכניקה saponin-permeabilized סיבים.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה saponin-permeabilized סיבים לב מציעה פשרה ייחודית בין במבחנה vivo הערכה של צריכת OXPHOS המיטוכונדריה חמצן. היתרונות של שיטה זו כוללים גדל רלוונטיות פיזיולוגיים לעומת המיטוכונדריה מבודד כמו ארכיטקטורה הסלולר נשמרת. בעוד הממברנה הפלסמטית נפגעת, מבנים תאיים קרום המיטוכונדריה כולל 12, 14, reticulum sarcoplasmic 14, myofilaments ואת cytoskeleton 1, 17 נותרו על כנן. יתר על כן, יחסי הגומלין בין המיטוכונדריה לבין cytoskeleton 1, 17</s...

<table><tbody><tr><td>100% אתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&amp;#8242;מלח מונופוטסיום של דיפוספט, דיהידראט (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר חומצת שומן חיונית&amp;#8211;חינם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>אנטימיצין A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&amp;#8242;מלח נתרן דו-בסיסי של אדנוזין טריפוספט הידרט (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אטרקטילוסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>סידן פחמתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>קרבוניל ציניד p-(טריפלואורומתוקסי) פניל הידראזון (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכרום c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>דיגיטונין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס-(2-אמינו&amp;#8211;(thylether)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;חומצה אתילנגליקול-טטרהאצטית (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גלוטמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>קטאסט (Ketaset)</td></tr><tr><td>חומצה לקטוביונית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסאהידראט (MgCl2·6H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6 שעות&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;טטרמתיל-p-פנילנדיאמין דיהידרוכלוריד (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומייסין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>פוספוקריאטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>פוטסיום הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ציאניד</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונובסי
(Potassium phosphate monobasic)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>ספונין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>סודיום פנטוברביטל</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>ריכוז 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סוצינית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>רומפון</td></tr><tr><td>מים מזוקקים כפולים&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 15 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 50 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה ישרת מסוג ג'ולר (Jewelers Forceps)</td><td>ג'ורג' טימאן &amp;ושות'</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת תכשיטנים מעוקלת</td><td>ג'ורג' טימן &amp;ושות'</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים ישרים</td><td>ג'ורג' טימן &amp;וחברה</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>להב ניתוח סטרילי</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;מסנני מזרק</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>צלחוני פטרי מזכוכית</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>פלטות פוליסטירן לתרבית רקמה בעלות 12 בארות</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>מגנט מגנטית (Plate Stirrer)</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>מאזניים</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;מיקרו-מזרק של Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;מזרק מיקרו של Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;מיקרו-מזרק Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי לחיצה של Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>כלי שקילה מפוליסטירן</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי (מיקרוסקופ לנתיחה)</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה respirometric זרחון חמצוני ב-saponin permeabilized סיבים לב

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

חקירת תפקוד המיטוכונדריה מהווה פרמטר חשוב בפיזיולוגיה של הלב כמו המיטוכונדריה מעורבים במטבוליזם של אנרגיה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, הזדקנות, encephalomyopathies המיטוכונדריה רעילות התרופה. לאור זאת, טכנולוגיות למדוד תפקוד המיטוכונדריה לב יש ביקוש. אחת הטכניקות המעסיקה גישה אינטגרטיבית למדוד תפקוד המיטוכונדריה היא respirometric ניתוח חמצוני (OXPHOS) זירחון. עקרון הערכה OXPHOS respirometric מושתתת על מדידת ריכוז החמצן ניצול אלקטרודה קלארק. כמו חבילת סיבי permeabilized צורכת חמצן, ריכוז החמצן יורדת לחדר סגור. שימוש נבחר מצע מעכבי-uncoupler פרוטוקולים טיטרציה, האלקטרונים ניתנים אתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים, המאפשר הערכה של תפקוד המיטוכונדריה. טכניקות הכנה לפני ניתוח respirometric של תפקוד המיטוכונדריה, מכני וכימי מנוצלים permeabilize sarcolemma של סיבי שריר. Permeabilization כימית מעסיקה saponin סלקטיבי לנקב את קרום התא, תוך שמירה על הארכיטקטורה התאית. מאמר זה מתאר את השלבים ביסודיות מעורבים בהכנת saponin עור סיבי לב עבור מדידות צריכת החמצן להעריך OXPHOS המיטוכונדריה. בנוסף, פתרון בעיות עצה כמו גם מצעים ספציפי, מעכבי ו uncouplers כי ניתן להשתמש כדי לקבוע את תפקוד המיטוכונדריה באתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים מסופקים. חשוב לציין, פרוטוקול המתואר ניתן ליישם בקלות ברקמת הלב ואת השלד של מודלים של בעלי חיים שונים דגימות אנושיות.

Saponin-permeabilized הכנה סיבים בשילוב עם ניתוח respirometric זרחון חמצוני מספק הערכה אינטגרטיבית של תפקוד המיטוכונדריה. הנשימה מיטוכונדריאלי במדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים יכול לשקף השפעות רגולטוריות שונות, כולל אינטראקציות המיטוכונדריה, מורפולוגיה וביוכימיה.

הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב

חקירת התפקוד המיטוכונדריאלי מהווה פרמטר חשוב של פיזיולוגיה לבבית, שכן מיטוכונדריה מעורבות במטבוליזם של אנרגיה, ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להכין סיבי לב חדירים לספונין למדידות פולרוגרפיות. דבר זה מושג תחילה על ידי כריתת הלב מהעכבר. השלב השני של הנוהל הוא הכנה מכנית של צרורות סיבי לב המכילים מקסימום של שישה עד שמונה סיבים המחוברים באופן רפוי.בשלב הבא, מבצעים פרמיליזציה כימית של צרורות שריר הלב באמצעות saponin. לאחר מכן, שוטפים את צרורות שריר הלב כדי להסיר את ה-saponin ואת כל המטבוליטים שנותרו. לבסוף, ניתן להפיק תוצאות המספקות תובנות לגבי הפוספורילציה החמצונית המיטוכונדריאלית באמצעות מדידות פולריגרפיות.שלום, אני קרטיס יויו (Curtis Huey) מהמעבדה של ד"ר ג'יין שיר (Jane Sheer) במחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת קלגרי. היום נדגים לכם פרוטוקול להכנת סיבי לב חדירים לספונין (saponin perme). אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדתנו כדי להעריך פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית in situ.אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו לב של יצור ימי והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה תמיסת RP על קרח. באמצעות מיקרוסקופ לדיסקציה, הסירו בזהירות כל רקמת חיבור ו/או שומן.חתכו את הלב לחצי לאורך המחיצה (septum) והוציאו 10 עד 25 מיליגרם, במשקל רטוב, של רקמה על ידי חיתוך מפני השטח של האנדוקרדיום של החדר השמאלי. ודאו כי החתך מבוצע לאורך כיוון הסיבים כדי למזער נזק מכני למיוקרדיום. העבירו את תת-דגימת הרקמה שהופרדה לכלי פטרי נפרד המכיל את תמיסת ה-RP על קרח.חתוך את הלב לרצועות אורכיות לאורך כיוון הסיבים, בקוטר של 1 עד 1.5 מילימטרים. קצר את הרצועות באמצעות סקלפל לאורך של בין שניים לארבעה מילימטרים, תוך נקיטת זהירות רבה ושימוש בפינצטה חדה. הפרד את צרורות הסיבים באופן מכני.צרורות סיבים סופיים צריכים להכיל מקסימום שישה עד שמונה סיבים המחוברים על ידי אזורי מגע קטנים, ולהשקיל בין 1 ל-3 milligrams במשקל רטוב. מבחינה חזותית, רקמת הלב צריכה לשנות את צבעה מאדום מקורי לוורוד חיוור. התחילו את הכנת צרורות סיבי הלב על ידי הנחת פלטת 12 בארות על קרח.שטפו את הבארות בתמיסת RP כדי למזער זיהום בסידן. הוסיפו שלוש מיליליטר של תמיסת RP קרה מהקרח עם 50 מיקרוגרם למיליליטר saponin לאחת הבארות. לאחר מכן, העבירו את צרורות הסיבים שהוכנו באופן מכני לבאור.דגרו את צרורות הסיבים למשך 20 דקות עם ערבוב עדין על קרח. שטפו באר חדשה עם תמיסת mirror five והעבירו בעזרת פיפטה 10 milliliters של mirror five קר מאוד אל הבאר החדשה. העבירו את צרורות השריר הלבבי לבאר ודגרו אותם למשך 10 דקות עם ערבוב עדין על קרח.לאחר האינקובציה, חזור על השלב של mirror five. שטוף שתיים עד שלוש פעמים עם mirror five טרי. העבר את צרורות השריר הלבבי ל-10 milliliters של mirror five קר בקרח בכל פעם.שלבי השטיפה החוזרים נועדו להבטיח את הסרת ה-saponin, A-T-P-A-D-P וכל שאריות של סובסטרטים מאגודות הסיבים מיד לפני הניתוח הנשימתי. קבעו את המשקל הרטוב של כל אחת מאגודות הסיבים על ידי ייבושן על משטח סופג באמצעות פינצטה, תוך הצמדת הסיב למשטח למשך חמש שניות או עד שכל הלחות נספגת. השתמשו במשטח סופג נוסף כדי להסיר נוזלים עודפים מהפינצטה.יש לאפס את המאזניים ולהניח את צרור הסיבים על משקל פלסטיק למדידת מסה. העבירו את צרור הסיבים הלבביים לבאר חדשה עם תמיסת near five קרה מאוד (בטמפרטורת קרח). צרור הסיבים מוכן כעת להערכת צריכת חמצן.הטיטרציות הבאות לצורך תיקוף מבוצעות באמצעות גרף הזרקת טיטרציה בעל שני תאים XI. ניתן לבצע ניסויים אלו כפרוטוקול נפרד או לכלול אותם בתוך פרוטוקול טיטרציה, בהתאם למטרה הניסויית והאבחנתית של מחקרי הברומטריית הנשימה. מכשיר ה-ERO GRA 2K המשמש כאן יכול למדוד ריכוז חמצן.המכשיר מחובר למחשב המצויד בתוכנת DAT lab, המאפשרת לדוח על שינויים בריכוז החמצן כמדידות של צריכת חמצן בזמן אמת לאורך כל משך הניסוי. לפני הנחת סיבי הלב המראה אל תוך תאי ה-XI graft, יש להוסיף 2.1 milliliters של mirror five למעטפת התאים המכילה את חיישני החמצן הפולריגרפיים (POS). כאשר התאים סגורים, שני מיליליטרים של mirror five יהיו נוכחים בתא ה-XI graft.אפשרו זמן מספיק לרוויית אוויר ולהשגות של ה-mirror five בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההשגות, הניחו את דגימות הסיבים הלבביים בתוך ה-mirror five הנמצא בתוך תאי ה-XI graft המערבלים על ידי Stir bars מצופים ב-poly odine fluoride.העלה את ריכוז החמצן בתאי ה-GRAT לבין 250 ל-550 micromolar באמצעות מזרק מלא בחמצן. המתן חמש עד 10 דקות להתייצבות ריכוז החמצן תוך שימוש במזרק Hamilton של 10 microliter. הוסף לתא 10 microliters של glutamate בריכוז two molar כדי להגיע לריכוז סופי של 10 millimolar.לאחר מכן, השתמש במזרק Hamilton נפרד כדי להוסיף 5 µL של malate בריכוז 800 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 2 mM בתא. טיטרציה זו משמשת לקביעת הנשימה הבסיסית הנתמכת על ידי קומפלקס 1. שטף החמצן אמור להתייצב תוך כחמש דקות מהטיטרציה, מה שמאפשר לקבוע את צריכת החמצן במצב 2 (state two), שהיא צריכת החמצן.בהיעדר DP לאחר שתי עד חמש דקות של צריכת חמצן יציבה, השתמש במזריק מיקרו Hamilton של 25 µL כדי להוסיף 20 µL של 500 mM DP לריכוז רוויה סופי של 5 mM. ריכוז זה משמש להגעה לרוויה של מעל 90%, מה שמאפשר קביעה של המצב המקסימלי. שלושה. נשמה מיטוכונדריאלית דרך קומפלקס 1 תאפשר שתי עד חמש דקות נוספות של צריכת חמצן יציבה.לאחר מכן, השתמש במזריק מיקרו Hamilton של 10 µL כדי להוסיף 5 µL של cytochrome C בריכוז 4 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 10 µM. ריכוז החמצן בנקודה זו משמש לביצוע ניתוח בקרת איכות של שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. לאחר שתיים עד חמש דקות נוספות של צריכת חמצן יציבה, הוסף 1 µL של ACIN בריכוז 4 mg/mL כדי לעכב את ה-TP synthase.שלב טיטרציה זה משמש כדי לתקף את שלמות ממברנת המיטוכונדריה הפנימית. לאחר הערכת oxphos בשיטת repi metric, הוצא את הדגימה לקביעת משקל יבש או לקביעת סמן מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, הוצא את mirror five מתאי הזכוכית של ה-XI Grat.שטפו את התאים לפחות שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר מכן, שטפו את התאים לפחות שלוש פעמים נוספות ב-100% ethanol. זאת כדי להסיר מעכבים מסיסים ב-ethanol, כגון oligomycin.בצע לאחר מכן שתי שטיפות נוספות ב-70% ethanol. לאחר מכן, הוסף 70% ethanol והשאר את תאי השתיל XI להשריה למשך 30 דקות לצורך עיקורם. לבסוף, שטוף את התאים המכילים את ה-POS לפחות חמש פעמים במים מזוקקים פעמיים. צריכת החמצן בסיבי לב המשקפים שהוכנו כראוי מוערכת לפי פרוטוקול בקרת האיכות כפי שמוצג; יחס הבקרה הנשימתית או RCR מייצג את הצימוד בין צריכת החמצן לבין פוספורילציה חמצונית בהכנות של סיבים חדירים.ה-RCR הוא קצב הנשימה במצב שלושה ביחס למצב שני, או לחלופין מצב שלושה חלקי מצב ארבע; דגימות בעלות צימוד תקין המשקפות הרכבים של שריר לב מניבות RCR שבין 3 ל-6. טיטרציה של cytochrome C משמשת כאישוש להכנה תקינה של הרקמה. cytochrome C הוא חלבון הממוקם במרווח הבין-ממברנלי בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה.כאשר הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה שלמה, הציטוכרום C האנדוגני נשאר במרווח הבין-ממברנלי, ולטיטרציה של ציטוכרום C אקסוגני יש השפעה זניחה על הנשימה. לעומת זאת, אם הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה פגומה, הציטוכרום C האנדוגני עלול להשתחרר מהמרווח הבין-ממברנלי ויעכב את הנשימה עד להוספת ציטוכרום C אקסוגני, מה שמאפשר להעריך את השפעתם של גורמי עקה פתולוגיים או ניסויים על שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. הוספת CIN משמשת להערכת שינויים בנשימת דליפה (leak respiration), שהיא צריכת חמצן שאינה תורמת ל-DP. סיבים של בקרת פוספורילציה או מסוג בר (wild type) אמורים להיות רגישים להוספת CIN ולחוות הפחתה משמעותית בזרימת החמצן.RCR נמוך ורגישות מופחתת ל-oligo mycin, המובילים לזרימת חמצן גבוהה יחסית, מעידים על נזק לממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית במהלך ההכנה. היעדר תגובה לטיטרציות של מעכבי סובסטרט וביטול צימוד (uncoupling), כפי שניתן לראות כאן, עשוי להעיד על תקופות אינקובציה ממושכות של sasin ואגודות סיבים מקולפים (skinned fiber bundles) בתמיסאות RP ו-mirror five. מאמצים עתידיים צריכים לצמצם את הזמנים שבין הקטילת בעל החיים למדידות צריכת החמצן.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין צרורות סיבים לבביים למדידות גרפיות קוטביות. חשוב לזכור בעת ביצוע הליך זה לנקוט זהירות רבה במהלך ההפרדה המכנית של הסיבים הלבביים. זהו כל התהליך.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה והניצול של חוצצים למדידה כמותית של שיעורי חמצון הגלוקוז וחומצות השומן בלב החולדה המבודד. נדונות גם השיטות המשמשות לניתוח מדגם ופרשנות נתונים.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

עבודה זו מדגימה את ההיתכנות של טכניקת ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית של זרחן-31 in vivo (31PMRS) לכימות יכולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) בשריר השלד האנושי.

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת In vivo קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

פרוטוקול זה מתאר calorespirometry, מדידת סימולטני הישירים של פיזור חום וגם נשימה, אשר מספקת גישה לא פולשנית כדי להעריך את חילוף החומרים האנרגיה. טכניקה זו משמשת כדי להעריך את התרומה של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי ניצול האנרגיה על-ידי ניטור את זרימת האנרגיה התאית הכוללת.

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

כאן אנו מציגים שיטה לשימוש צנתר אופטי פנים-חדר בלבבות מעשה כדי לבצע ספקטרוסקופיה ספיגת על פני קיר הלב. הנתונים שהושגו מספק מידע חזק על מתח החמצן ברקמות, כמו גם ניצול מצע ופוטנציאל הממברנה במקביל עם ביצועים מדדים לב בהכנה זו בכל מקום.

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.

פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

במאמר זה אנו מתארים שיטה מקיפה למדידת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי בסיבי שריר שלד טריים משריר אדם או עכבר. שיטה זו מאפשרת כימות בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית והערכת העדפת דלק וגמישות מטבולית תוך שמירה על רשתות מיטוכונדריאליות קיימות ושלמות הממברנה.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לכימות קצב צריכת החמצן וקצב החמצה החוץ-תאית של חדרי דגי זברה בוגרים מחוץ לחיים כדי לאפיין את היכולת המטבולית החמצונית והגליקוליטית שלהם.

הערכת הפעילות המטבולית של חדרי דגי זברה המתחדשים מחוץ לחיים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

למדו הכנת סיבים לביים מחושמלים בספונין להערכת זרחון חמצוני מיטוכונדרי באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פעילות מיטוכונדרית בלב.

הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב

גלה סרטונים נוספים