היברידיזציה פלואורסצנטית במקום של חיידקי מעי בחתכי מעי בעכברים

התחילו בהוספת תמיסה המכילה חיידקי 16S rRNA ייחודיים ל-Fluorescence in situ hybridization (FISH) לשקף המכיל את חלקי המעי של העכבר שהתיישבו על ידי חיידקים.

הניחו כיסוי כיסוי כדי לפזר את הנוזל המכיל גלאים ולמנוע אידוי.

דגרו את המחסנית בתא לח בטמפרטורה מוגברת.

זה פורש את המבנה המשני של ה-RNA, ומקל על היברידיזציה של הגשוש עם רצפים משלימים ב-rRNA חיידקי 16S.

הסר את הכיסוי ודוגר את המחסנית בבופר שטיפה מחומם מראש כדי להסיר את הגשדים הלא קשורים.

לשטוף עם בופר פוספט לשמירה על pH פיזיולוגי.

מרח צבע נגד המכיל צבע ייחודי לריר וצבע גרעיני, ודגם.

צבעים אלו נקשרים באופן סלקטיבי לריר המעי ול-DNA של תאי חיידק ותאי מארח. שטפו את המחסנית עם בופר והתקינו את הכיסוי על הסלייד באמצעות מדיה להרכבה.

מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי, ניתן לצפות בחיידקים מסומנים על ידי FISH, תאי מעיים ושכבת הריר בתוך החתכים.

צור מעגלים קרובים מאוד סביב כל חתך רקמה באמצעות חוסם נוזלים או עט PAP כדי להגביל את שטח ההתרחבות הנדרש לכיסוי בתמיסת ההיברידיזציה, ולמנוע מגע דיו עם החתך.

הכינו את תמיסת ההיברידיזציה והוספו 0.5 מיקרוגרם של גלאי לכל 50 מיקרוליטר של התמיסה שהשתמשו בה. הפיפט את הפתרון על החלקים בשקף. כיסו את החלק בכיסויי פלסטיק גמישים, כדי להבטיח שנפח הנוזל המשמש מכסה את כל החלק.

צרו תא לח עם קופסת קצה פיפטה עם מגבונים או מגבות נייר שהושרו בתמיסת היברידיזציה עודפת (PBS) כדי לספק לחות. דגרו את המחסנית בתא הלח בטמפרטורה של 45 עד 50 מעלות צלזיוס למשך לפחות שלוש שעות, בהתאם למערכת הגשושית, כדי להפחית את האידוי. הסר את הכיסוי הפלסטי, ודוגר את המחסניות בבופר שטיפת FISH בצנצנת קופלין, שניהם מחוממים מראש ל-50 מעלות צלזיוס.

החזירו את צנצנת קופלין לתנור של 50 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות. הסר את בופר הכביסה של FISH והחלף אותו ב-PBS בצנצנת קופלין. מיד לאחר מילוי מחדש של צנצנת קופלין ב-PBS, שחררו את ה-PBS.

הסר את השקופיות מהצנצנת והפך את צבע הנגדי על כל הקטע, תוך שמירה על כך שלא נוגע בטישו עם קצה הפיפטה. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. שטוף את הכתמים שלוש פעמים במהירות עם PBS טרי.

נגב את גב השקופיות על מגבון או מגבת נייר ותן לרוב ה-PBS להתאדות מהחלקים בעזרת קו ואקום שמחובר לקצה פיפטה. התקן את החלקים באמצעות מדיום התקנה. הדביקו את הכיסוי על הסלייד על ידי צביעה לאורך הקצוות עם לק שקוף, תוך היזהרות להתרחק מהקצה של הסלייד. תן לו להתייצב בטמפרטורת החדר.