JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:04 דק' • January 30th, 2026
התחילו בתרבית של Legionella pneumophila, חיידק גראם שלילי פתוגני שמשחרר שלחיצות ממברנה חיצונית.
OMVs אלו נושאים ליפופוליסכרידים וחלבוני ממברנה התורמים לאלימות חיידקית.
צנטריפוגות את התרבית כדי לגרגר חיידקים שלמים.
אסוף שוב את הסופרנטנט המכיל OMVs וצנטריפוגה לחיידקים שנותרו בכדורים.
סנן את הסופרנטנט דרך ממברנה כדי להסיר את החיידקים שנותרו תוך שמירה על OMVs.
בצע סינון שני באמצעות ממברנה טרייה להסרת פסולת חיידקים.
אסוף את הסינון ללא חיידקים ובצע עליו אולטרה-צנטריפוגה כדי לפרוק את ה-OMVs.
להשליך את הסופרנאנט, להחזיר את הכדור לבופר, ולבצע אולטרה-צנטריפוגה שוב כדי להסיר חלבונים ופוליסכרידים קשורים באופן רופף.
הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש את ה-OMV המטוהרים בבופר.
הורד אליקו של ה-OMVs על לוחות אגר דם ו-BCYE אגר ודגם.
היעדר היווצרות מושבות מאשר את היעדר זיהום חיידקי.
אחסן את ה-OMV בטמפרטורה נמוכה לצורך מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.
הוסף את התרבית הנוזלית שנותרה ל-90 מיליליטר של מדיום YEB טרי ודוגר את התרבית על שייקר מסתובב עד שהיא מגיעהל-OD 600 של 3.0 עד 3.5. צנטריפוגה את תרבית הנוזל ב-4,000 גרם למשך 20 דקות כדי לפרוק את החיידקים. לאחר מכן העבר את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגות טריים.
השליכו את הכדורים החיידקיים ובצנטריפוגה את הדגימות שוב לפני שחוזרים על שלב הצנטריפוגה. לאחר מכן, סנן את הסופרנטנט שנותר פעמיים.
לאחר מכן העבר את הסופרנטנט הנטול חיידקים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה וסובב את הדגימות ב-100,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. דרק את הסופרנטנט וזרוק אותו. לאחר מכן השתמש ב-PBS סטרילי כדי להחזיר את כדורי ה-OMV ולאסוף אותם.
חזור על שלב האולטרה צנטריפוגציה כדי להסיר חלבונים מזהמים ולשחרר את ה-LPS. עכשיו, זרקו את הסופרנטנט וייבשו את צינור האולטר-צנטריפוגה עם מטלית כותנה סטרילית. החזירו את כדור ה-OMV עם 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
לאחר מכן, מרחו 20 מיקרוליטר כל אחד על לוחות אגר דם ו-BCYE אגר כדי למנוע זיהום חיידקי של הווסיקולה המוכנה. דגרו את צלחת האגר בדם למשך הלילה ואת צלחת האגר BCYE למשך 3 ימים.