זיהוי ביטוי גן מטרה במוח עכבר נגוע בחיידקים

קח את כל ה-RNA שמופק ממוח עכבר שנדבק בחיידקים פתוגניים. התמצית מכילה תמלילים מגנים המגיבים לזיהום.

הוסיפו אנזים מפרק DNA ודגרו כדי לפירוק DNA גנומי שנותר.

הוסף תערובת מאסטר המכילה אנזים טרנסקריפטאז הפוך (RT), נוקלאוטידים ופריימרים לא ספציפיים.

דגרו כדי לסנתז DNA משלים (cDNA).

הכנס טמפרטורה גבוהה כדי לנטרל את אנזים ה-RT.

קחו תערובת מאסטר המכילה DNA פולימראז, נוקלאוטידים, צבע קושר DNA דו-גדילי, ופריימרים ספציפיים לגן היעד.

הוסף את ה-cDNA ומרח חום כדי לפרק את ה-DNA.

הפריימר נקשר ל-cDNA המטרה, ומאפשר סינתזת גדילי DNA חדשים.

המחזור חוזר על עצמו כדי להגביר את הגן המטרה.

הצבע נקשר ל-DNA המוגבר ופולט פלואורסצנציה, המתועדת בסוף כל מחזור.

עלייה בפלואורסצנציה מאשרת את ביטוי הגן המגיב לזיהום במוח העכבר הנגוע.

הדביק את כל העכברים באמצעות תאי פלנקטוניים או תאי מצב ביופילם וביצוע המתת חסד כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יש להוציא את כל ה-RNA מרקמת המוח באמצעות ערכת חילוץ RNA.

לכל עכבר, השתמש ברקמת מוח שלמה להפקת RNA. חלק את רקמת המוח השלמה לחמישה צינורות. קח עד 100 מיליגרם רקמת מוח והוסיף 1 מיליליטר של תמיסת ליזיס לכל צינור המכיל את מטריצת הליזה שמספקת הערכה.

חלץ את ה-RNA לפי השלבים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לבצע סינתזת cDNA, כולל חיסול DNA גנומי, באמצעות תרמחזור עם ערכת תגובת שעתוק הפוך. הוסף