זיהוי ביטוי גן מטרה במוח עכבר נגוע בחיידקים

קח את כל ה-RNA שמופק ממוח עכבר שנדבק בחיידקים פתוגניים. התמצית מכילה תמלילים מגנים המגיבים לזיהום.

הוסיפו אנזים מפרק DNA ודגרו כדי לפירוק DNA גנומי שנותר.

הוסף תערובת מאסטר המכילה אנזים טרנסקריפטאז הפוך (RT), נוקלאוטידים ופריימרים לא ספציפיים.

דגרו כדי לסנתז DNA משלים (cDNA).

הכנס טמפרטורה גבוהה כדי לנטרל את אנזים ה-RT.

קחו תערובת מאסטר המכילה DNA פולימראז, נוקלאוטידים, צבע קושר DNA דו-גדילי, ופריימרים ספציפיים לגן היעד.

הוסף את ה-cDNA ומרח חום כדי לפרק את ה-DNA.

הפריימר נקשר ל-cDNA המטרה, ומאפשר סינתזת גדילי DNA חדשים.

המחזור חוזר על עצמו כדי להגביר את הגן המטרה.

הצבע נקשר ל-DNA המוגבר ופולט פלואורסצנציה, המתועדת בסוף כל מחזור.

עלייה בפלואורסצנציה מאשרת את ביטוי הגן המגיב לזיהום במוח העכבר הנגוע.

הדביק את כל העכברים באמצעות תאי פלנקטוניים או תאי מצב ביופילם וביצוע המתת חסד כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יש להוציא את כל ה-RNA מרקמת המוח באמצעות ערכת חילוץ RNA.

לכל עכבר, השתמש ברקמת מוח שלמה להפקת RNA. חלק את רקמת המוח השלמה לחמישה צינורות. קח עד 100 מיליגרם רקמת מוח והוסיף 1 מיליליטר של תמיסת ליזיס לכל צינור המכיל את מטריצת הליזה שמספקת הערכה.

חלץ את ה-RNA לפי השלבים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לבצע סינתזת cDNA, כולל חיסול DNA גנומי, באמצעות תרמחזור עם ערכת תגובת שעתוק הפוך. הוסף 1 מיקרוגרם RNA לצינור המכיל 2 מיקרוליטר של 5x באפר השמדת DNA גנומי ו-1 מיקרוליטר של אנזים להסרת DNA גנומי.

הוסף מים ללא RNase עד שנפח מגיע ל-10 מיקרוליטר. דגרו במשך 2 דקות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. הוסיפו 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לתמיסת התגובה ואז ערבבו בעדינות.

המשיכו מיד בתגובת השעתוק ההפוכה על ידי הנחת הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן העבר את התגובה ל-85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות. בצע ניתוח PCR כמותי בזמן אמת באמצעות מכונת PCR בזמן אמת עם ערכת PCR כמותית בזמן אמת סייבר. בהתאם להוראות הערכה, שלב את האנזים, הפריימרים, צבע רפרנס 50x ROX 2, ותבנית cDNA. לאחר מכן מוסיפים מים ללא RNase עד שמגיעים לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.

הרץ כל דגימה בשלושה עותקים באמצעות הפרמטרים התרמיים המפורטים בפרוטוקול הטקסט וחשב את שינוי הקיפול היחסי בהתבסס על שיטת CT של שתיים מינוס דלתא דלתא.