אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:12 דק׳ • January 30th, 2026
קחו תערובת המכילה נפחים שווים של שני תלונות Agrobacterium tumefaciens , שכל אחד נושא פלסמיד - אחד מקודד GFP והשני מקודד חלבון אפקטור.
נקב חור והשתמש במזרק ללא מחט כדי לחדור את התערובת אל פני השטח התחתונים של עלי Nicotiana benthamiana 16c בריאים ומורחבים במלואם.
לטשטש כל תלייה עודפת ברקמה רכה כדי למנוע צמיחת יתר חיידקים.
סמנו את האזורים החדרו ודגרו את הצמחים בתנאי צמיחה מיטביים.
אגרובקטריה מעבירה את ה-DNA של הפלסמידים לתאי הצמח, שם הגנים GFP והאפקטורים מתועתקים ל-mRNA ומתורגמים לחלבונים.
מערכת ההגנה של המפעל משתמשת בהשתקת RNA, שבה siRNA דו-פעמי נטענים ל-RISC. חוט הנוסע מוסר וחוט המדריך מכוון את המתחם לפירוק mRNA של GFP במטרה.
עם זאת, חלבוני האפקטור נקשרים ל-siRNA, מה שמונע את הקשר שלהם ל-RISC ומאפשר לקיים פלואורסצנציה של GFP.
דבר זה מאפשר זיהוי אפקטורים פתוגנים שמדכאים את השתקת ה-RNA של הצמח.
מערבבים נפחים שווים של תרבית אגרובקטריה המכילה חלבון פלואורסצנטי ירוק 35S עם תרבית אגרובקטריה המכילה 35S מדכא וירוס פסיפס מלפפון 2b, אפקטור משוער, או וקטור ריק. באמצעות מזרק ללא מחט בנפח 1 מיליליטר, חדרו בזהירות ובאיטיות את תהליכי האגרובקטריה המעורבים בצדדים האבקסיים של עלי ניקוטיאנה בתמיאנה 16c.
הסר את שארית ההתנגדות החיידקית מהעלים עם מגבוני רקמות רכות, ומעגל את שולי הכתמים החדרו עם עט טוש.