זיהוי במקום של חיידקים בחתכי רקמת החניכיים של העכבר

קחו חתך חניכיים של עכבר שנדבק בחיידקים פתוגניים, מטופל מראש כדי לגשת ל-DNA חיידקי.

הפעילו בופר עם גלאי DNA מסומן בדיגוקסיגנין המכוון ל-DNA חיידקי.

הניחו כיסוי ואטום כדי למנוע התייבשות בדגימה.

הכנסת חום לדנטטורציה של ה-DNA, ואז דגירה בתנאים חמים ולחות כדי לאפשר היברידיזציה של פרוב.

קרר את המחסנית והסר את הכיסוי, ושטוף מספר פעמים עם בופר כדי להסיר את הגלאים הלא קשורים.

הוסף תמיסת חסימה למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

דגרו עם נוגדנים אנזימיים צמודים שנקשרים לדיגוקסיגנין.

שטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף מעכב כדי לנטרל את האנזים האנדוגני באופן סלקטיבי.

מרח סובסטרט שמגיב עם האנזים כדי ליצור משקע צבעוני.

שטוף במים כדי להסיר את המצע העודף.

הוסיפו צבע כדי לצבוע את הגרעינים.

שטוף כדי להסיר צבע עודף.

ייבשו באתנול וטפלו בקסילן כדי להגדיל את שקיפות הרקמות.

תרכיב על החלק.

מתחת למיקרוסקופ, הצג את החיידקים בתוך החתך.

התחל את ה-in situ על ידי הטבלת השקופיות ב-2x SSC למשך 20 דקות. בינתיים, דילל את הגשוש המסומן ל-1 ננוגרם למיקרוליטר במאגר היברידיזציה. לבקרה שלילית, השתמש בריכוז פי 10 של גלאי לא מסומן. לאחר מכן, דטרנציה של הגשושים על ידי חימום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן קירור מהיר על הקרח.

לאחר מכן, יש להחיל את אותו נפח דילול הפרוב על כל שקופית כמו פרוטינאז K. לאחר מכן, כסו בזהירות את החלקים עם לק לציפורניים. עכשיו, חממו את המחסניות על בלוק מכונת PCR בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והעבירו אותן לאינקובטור לחות של 45 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

למחרת, קרר את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חצי שעה, ואז הסר בזהירות את הכיסוי. הרקמות שבירות. לבסוף, העבירו את הסליידס דרך סדרה של בופר SSC בטמפרטורת החדר.

שטפו את השקופיות ההיברידיות במקום במשך 5 דקות ב-MABT. לאחר מכן, מרחו 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ב-1% Tween 20 למשך 20 דקות. לאחר דגירה בלוק, יש להניח 50 עד 400 מיקרוליטרים של 1 עד 1000 נוגדן פוספטאז אלקליני אנטי-DIG בתמיסת חסימה.

תן לה להיקשר ל-90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שהחלה את הראשונית, שטוף את השקופיות ב-MABT למשך 10 דקות. ואז, במשך 5 דקות, הכניסו את השקופיות למאגר זיהוי עם 1% Tween 20.

כעת מרחו 50 עד 400 מיקרוליטר של לבימיזול 1 מילימולר בתמיסת בופר גילוי על כל שקופה, ודגרו אותם במשך 5 דקות כדי לנטרל את הפוספטאז האלקליני האנדוגני. לאחר מכן, הוסף 50 עד 400 מיקרוליטר של NBT/BCIP מדולל בבופר גילוי ב-1 עד 100 לכל שקופה, ותן למחסניות להתפתח במשך 2 עד 3 שעות בתא לח, בהתבסס על ניסיון.

שטוף את המגלשות במי DI. לאחר מכן, מרחי מתיל ירוק במשקל של 0.05% בנפח ותנו לצבע הנגדי לעבוד על הרקמה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את השקופיות שוב במי DI, ואז ייבשו אותן עם 100% אתנול, ואחר כך טבלו בקסילן. לבסוף, מרח 80 מיקרוליטר של מדיה להרכבה ומכסה את הסלייד.