הכנת תרבית אגרובקטריום להעברת גנים לתאי הצמח

התחילו בתרבות Agrobacterium tumefaciens שגדלה במדיום עם שתי אנטיביוטיקות למניעת זיהום והבטחת שמירת הפלסמידים.

החיידקים מכילים וקטור ביטוי צמחי הנושא גן מעניין וגן עמידות לאנטיביוטיקה.

הם גם מכילים פלסמיד עזר עם אזור של גנים אלימים הנדרשים להעברת הגן הרלוונטי לתאי הצמח.

העבר חלק לצינור המכיל מדיום מופתר, בתוספת אצטוסירינגון, מולקולת אות שמקורה בצמחים, והאנטיביוטיקה. תדגר עם רעידות.

אצטוסירינגון מתפשט לתוך התא, מפעיל מסלול איתות, ומפעיל ביטוי של גנים אלימים הנדרשים להעברת הגן הרלוונטי.

העבר את התרבית, צנטריפוגה לאסוף את החיידקים, וזרוק את הסופרנטנט.

הוסיפו בופר מלח ושטפו את התאים שוב ושוב כדי להסיר את האנטיביוטיקה שהותוספה.

החזירו את החיידקים לבופר עם אצטוסירינגון ודגרו ללא רעידה כדי לשמור על ביטוי גן אלימות.

השתמש בתרבות מיד לשינוי יעיל.

השתמשו בקצה כדי לבחור מושבה חיובית מהצלחת LB ולחסן את התאים בצינור זכוכית המכיל 5 מיליליטר מדיום LB עם תוספת של 50 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר ריפמפיצין. גדלו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 24 עד 48 שעות.

העבר 100 מיקרוליטר מהתרבית ל-5 מיליליטר של מדיום LB עם אותה אנטיביוטיקה, MES 10 מילימולר ב-pH 5.6, ו-20 מיקרומולרים AS. גדלו את החיידקים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 16 עד 20 שע