Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay
30 בינואר 2011
Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.
המטרה הכללית של הליך זה היא להקים ולחקור ביופילמים בתוך פלטת מיקרוטיטר. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת תרבית חיידקים לפלטה של 96 בארות. לאחר מכן, התרבית מדגרה בטמפרטורה ובזמן המתאימים, בהתאם למיקרואורגניזם, כדי לצבוע את הביופילם.
מוסיפים Crystal violet לכל באער עם חיידקים, ולאחר מכן שוטפים את החיידקים. לבסוף, מצלמים את הבאערים ומכמתים את כמות החיידקים. בסיכומו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את ההצטברות וההיווצרות של ביופילמים לאורך זמן באמצעות מדידת ה-Crystal violet.
היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים להעריך במהירות היווצרות של ביופילם באורגניזמים חיידקיים ופטריות. ניתן להגדיר אותה גם עבור סריקות גנטיות בתפוקה גבוהה, או לזיהוי תרכובות טיפוליות חדשות המעכבות היווצרות ביופילם. הכינו תרבית לילה של 5 mL של זן הבר של pseudomonas, aerogen, או זן מוטנטי.
בתווך LB, דללו 10 µL של תרבית לתוך 1 mL של תווך M 63 טרי, תווך מינימלי המועשר במגנזיום, סולפט, גלוקוז וחומצות קזאין. לאחר מכן, באמצעות פיפט, העבירו 100 µL של התרבית המדוללת לבארות נפרדות בלוחית 96 בארות בעלת תחתית עגולה. דגרו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C למשך 4 עד 24 שעות כדי לאפשר צמיחה של ביופילם.
לאחר שנוצרו הביופלמים, הוצא את הפלטה מהאינקובטור והסר את העלומות של התרבית על ידי הפיכת הפלטה וניעור הנוזל החוצה. לאחר מכן, טבול בעדינות את הפלטה במיכל קטן עם מים כדי לשטוף תאים לא קשורים שנותרו או רכיבי מצע שעלולים לגרום לצביעת רקע. נער את המים החוצה, ייבש את הפלטה בעזרת נייר סופג, וחזור על השטיפה.
לאחר שהפלטה נקייה, יש להוסיף 125 µL לכל באר של תמיסת crystal violet בריכוז 0.1%. לצביעת התאים, יש להדגיר את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות.
לאחר מכן, שטפו את הפלטה שלוש או ארבע פעמים כפי שהודגם קודם לכן. ייבשו את הפלטה בעוצמה על ידי ספיגה בערימה של נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזלים לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את הפלטה הפוכה והשאירו אותה להתייבש במצב זה למשך מספר שעות. ברגע שהפלטה יבשה, ניתן לצלם את הבארות בעזרת מצלמה דיגיטלית כדי להעריך את איכות הביופילמים.
כפי שמוצג כאן, חיידקים ניידים כגון pseudomonas aerogen משמאל ו-pseudomonas fluorescence מימין נוטים ליצור ביופילמים במיקום הממשק בין האוויר לנוזל במהלך צמיחת הביופילם. לעומת זאת, חיידקי staphylococcus ora, שאינם ניידים, יוצרים ביופילמים בתחתית הבארות. כדי לכמת את הביופילמים, הוסיפו תחילה 125 µL של 30% acetic acid לכל בארה, כולל בארת ביקורת (blank) המכילה acetic acid בלבד, והדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר את המסת ה-crystal violet שנשמר בביופילמים.
בשלב הבא, העבירו 125 microliters של צבע מומס מכל באער ללוחית מיקרוטיטר חדשה בעלת 96 באערים ותחתית שטוחה. באמצעות קורא לוחות, מדדו את הבליעה של כל באער באורך גל של 550 nanometers. ריכוז ה-crystal violet בכל באער פרופורציונלי למספר התאים בביופילם.
גרף זה מציג כימות של יצירת ביופילם והצטברותו על ידי pseudomonas fluorescence לאורך זמן במהלך דגירה ב-37 °C. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת ביופילם בצלחת 96 בארות המשמשת בשילוב עם שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה. היא יכולה לתרום משמעותית להבנתנו לגבי יצירת ביופילם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקה זו מתארת שיטה מהירה למדידת היווצרות מוקדמת של ביופילם בחיידקים ובפטריות באמצעות פלטת מיקרוטיטר. ניתן להמחיש את הביופילם באמצעות צביעה בكريסטל ויולט (crystal violet), המאפשרת ניתוח איכותני וכמותי כאחד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחקר ביופילמים
- פיתוח בדיקות (Assay)
רקע
- ביופילמים הם קהילות של מיקרואורגניזמים הנדבקים למשטחים.
- חקר היווצרות של ביופילם הוא חיוני להבנת ההתנהגות המיקרוביאלית.
- קריסטל ויולט (Crystal violet) הוא צבע נפוץ המשמש להדמיה של ביופילמים.
- שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של התפתחות ביופילם.
מטרת המחקר
- ביסוס בדיקה מהימנה לזיהוי מוקדם של היווצרות ביופילם.
- כימות הצטברות ביופילם לאורך זמן.
- סיוע בחקר של אינטראקציות מיקרוביאליות בביופילמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוסיפו תרבית חיידקים לפלטת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות.
- דגרו את התרבית בטמפרטורה ובזמן המתאימים.
- הוסיפו קריסטל וילג'ט (crystal violet) כדי לצבוע את הביופילם.
- שטפו את הבארות וצלמו לצורך כימות של היווצרות הביופילם.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מראות הצטברות של ביופילמים לאורך זמן.
- ניתן לקבל נתונים כמותיים ממדידות של קריסטל ויולט.
- הבדיקה מספקת ויזואליזציה ברורה של היווצרות ביופילם.
מסקנות
- שיטה זו יעילה למחקרי היווצרות מוקדמת של ביופילם.
- ניתן להחילה אותה על מינים שונים של חיידקים ופטריות.
- הבדיקה משפרת את ההבנה של הדינמיקה של ביופילם מיקרוביאלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת היווצרות הביופילם בצלחת מיקרוטיטר מאפשרת הערכה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה של התפתחות ביופילם בשלבים מוקדמים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בתהליך הגילוי של חומרים אנטי-מיקרוביאליים. באמצעות כימות הצטברות הביופילם בעזרת צביעת קריסטל ויולה (crystal violet), השיטה מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, המסייעים בהפחתת סיכונים עבור מועמדים תרפויטיים המכוונים להיצמדות והישרדות מיקרוביאלית. גישה ניתנת להרחבה זו ישימה במערכות בקטריאליות ופטריות כאחד, ומקלה על סריקה בשלבים מוקדמים של תרכובות המשפיעות על הביופילם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות באמצעות זיהוי גנים וגורמים הדרושים ליצירת ביופילם, כגון adhesins, pili ומסלולי cyclic-di-GMP.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות סריקות של אובדן תפקוד (loss-of-function) בזני מיקרובים תחת תנאים סטנדרטיים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי תרכובות על ידי הבחנה בין תרכובות המעכבות היווצרות ביופילם בשלב מוקדם לבין תרכובות ללא השפעה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות מיקרוביאליות מתוּקפות לסריקת תרכובות בשלבים הבאים, באמצעות קביעת מדדי יצירת ביופילם הניתנים לשחזור.
- ערך תפעולי: טיפול בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות שלבי דגירה, צביעה וכימות סטנדרטיים בפורמט של פלטת 96 בארות.
- מדרגיות: הדגשת המוכנות לסריקה ואפשרות שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקות גנטיות וספריות תרכובות על פני מספר זני מיקרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מקשר בין נתונים של התגבשות ביופילם מוקדמת לבין פרופילים של עמידות פנוטיפית, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של מובילים אנטימיקרוביאליים.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון על ידי קישור עיכוב ביופילם in vitro לסבילות לאנטיביוטיקה ולמגבירים חיסוניים.
- התאמה למסמני ביולוגיים: תומך בפיתוח מסמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות פלטים כמותיים המתואמים עם פנוטיפים של סבילות הקשורה לביופילם.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המועמד המוביל, ובמיוחד בתוכניות אנטי-זיהומיות המכוונות לעמידות המתווכת על ידי ביופילם.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של נתיבי היצמדות מיקרוביילית ויצירת ביופילם באמצעות הפרעה גנטית וכימית.
- סינון: מתארת את מוכנות המבחן באמצעות יצירת ביופילם סטנדרטית וכמותיות של כחול קריסטל (crystal violet), המאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליזה: מדגישה מדידות ספיגה כמותיות ב-550 nm המאפשרות השוואה של ביומסת הביופילם בין תנאים וזנים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני עכבה מוקדמים של ביופילם לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי מידול מנגנוני סבילות הנצפים בזיהומים כרוניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציבה את השיטה כפלטפורמת סינון הניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות אנטימיקרוביאליות, אנטיפטרגיות ואנטי-ביופילם במודלים של פתוגנים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתה מדידה של היווצרות ביופילם בעקבות התערבות גנטית או פרמקולוגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בפורמטים של 96 בארות עבור יישומים בסריקה רחבה (high-throughput).
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go) בזיהוי מובילים על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות באמצעות כימות ביופילם אורתוגונלי.
- השפעה על תיק הפיתוח: תיעדוף תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על עיכוב תלוי-מינון של היווצרות ביופילם מוקדמת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות מיקרוביולוגית בטכניקה סטרילית, הכנת תרביות וטיפול בביופילם.
- תלוי בגישה לקוראי פלטות המסוגלים למדידת בליעה ב-550 nm ולפלטות מיקרוטיטר סטנדרטיות בעלות 96 בארות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של זמני דגירה, שלבי שטיפה ופרוטוקולי צביעה כדי למזער שונות בין הבארות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לאורגניזמים שאינם מודל או לפטריות בעלות תכונות היצמדות שונות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חוסר יכולת למדל ארכיטקטורה של ביופילם בוגר או פנוטיפים תלויי-זרימה, כפי שצוין במקור.
