הדמיית טיים-לאפס של הפרדת כרומוזומים בחיידקים מסומנים פלואורסצנטית

התחילו עם כרית אגרוז עשירה בחומרים מזינים על מסגרת מתכתית המכילה חיידקים המבטאים מקור כרומוזומים מסומנים פלואורסצנטי ומיקרוספירות פלואורסצנטיות.

כרית האגרוז תומכת בחיבור חיידקים ובניידות, ומיקרוספירות פלואורסצנטיות משמשות כהפניה להפרדת כרומוזומים במעקב.

הוסיפו שמן טבילה לעדשת האובייקטיב בתא הדגירה המחומם מראש של מיקרוסקופ רחב שדה הפוך.

הנח את הדגימה מעל העדשה, ואז התמקד באזור המכיל מספר חיידקים ולפחות מיקרוספירה פלואורסצנטית אחת.

התחילו הדמיית טיימ-לאפס וצילמו תמונות גם של ניגודיות פאזה וגם תמונות פלואורסצנציה.

מקור השכפול המתויג פלואורסצנטי מופיע כאשכול בהיר ליד קצה אחד של התא.

במהלך החלוקה, המקור משכפל; אשכול אחד נשאר בקצה המקורי בעוד שהאשכול השני נודד לקצה התא החדש.

מבנה זה מאפשר מעקב אחר הפרדת הכרומוזומים במספר חלוקות וניתן להתאים אותו להמחשת תהליכים דינמיים דומים בחיידקים אחרים, כולל מינים פתוגניים במהלך אינטראקציות עם המארח.

כדי לבצע מיקרוסקופ טיימלפס, הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. בחר את המטרה הנכונה ואת המראות והמסנן הנכונים כדי לצלם תמונות קונטרסט פאזה וכן תמונות של חלבונים ירוקים-פלואורסצנטיים, אדומים-פלואורסצנטיים או צהובים-פלואורסצנטיים. הוסיפו טיפה של שמן טבילה איכותי על עדשת האובייקטיב ולתחתית הדגימה המוקדמת בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.

עם צד החור לכיוון המטרה, מניחים את המסגרת המתכתית עם הדגימה על שלב המיקרוסקופ, ואז מהדקים את הדגימה היטב במחזיק הבמה. התמקד בתאים על ידי הזזת הבמה בכיוון Z קרוב יותר למטרה. כאשר השמן על המטרה והדגימה נוצרים במגע, הזז את השלב בכיוון X/Y.

עבור לתוכנת Metamorph ופתח את כלי Acquire. בחר ניגודיות פאזה ברשימת ההגדרות והגדר את זמן החשיפה ל-100 מילישניות. לחץ על Show Live, הבא את Cell למישור מוקד, והזיז את השלב בכיוון X/Y עד שמספר תאים בודדים נראים בשדה הראייה.

ודא שלפחות מיקרוספירה פלואורסצנטית אחת נמצאת באזור הראייה כדי ליישר מאוחר יותר את התמונות שנרכשו. לאחר מכן, פתח את אשף הרכישה הרב-ממדית של תוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להקים ניסוי טיים-לאפס שמאפשר למיקרוסקופ לצלם תמונות באורכי גל שונים ובמיקומי שלבים במידת הצורך.

בלשונית הראשית, הפעל טיים-לאפס ו-Multiple Wavelengths. טאבים נוספים יופיעו בצד שמאל של החלון. לחץ על לשונית השמירה ובחר תיקייה כדי לבחור תיקייה ריקה בכונן הקשיח של המחשב ולשמירת התמונות שנרכשו, ואז הפעל את Increment Base Name If File Exists כדי לוודא שמערכי הנתונים העוקבים לא מחליפים את הקודמים. תנו לניסוי שם עם תאריך ושם הזן או שם הניסוי.

לחצו על לשונית הטיימ-לאפס כדי להתאים את פרמטרי הטיימלפס, ואז הגדרו את מרווח הזמן ל-20 דקות והגדרו את משך הזמן ל-24 שעות. מספר נקודות הזמן ישתנה אוטומטית. עכשיו, לחץ על לשונית Wavelengths.

בחר את מספר אורכי הגל שיש לרכוש עבור כל תמונה בכל נקודת זמן על ידי שינוי המספר. בחר לאפשר מיקום AF נפרד שנזכר בחומרה עבור כל אורך גל. לחצו על לשונית אורך הגל הראשון מלמעלה.

ברשימת הנפתח של Illumination, בחר Phase Contrast. בחר 100 מילישניות לחשיפה, וברשימת הרכישה הנפתח בחר בכל נקודת זמן. כבה את Auto Expose ברשימת הנפתח על ידי בחירת Never, ובחר בכל רכישה בתפריט הנפתח עבור Auto Focus.

הגדר את החשיפה לכל אורך גל כפי שהוצג זה עתה באמצעות הפרמטרים הבאים. לאחר מכן, כדי להשיג תמונות ממספר מיקומי שלבים, בלשונית הראשית, הפעל את מספר מיקומי שלבים. לחצו על לשונית הבמה ולחצו על כפתור החי כדי להסתכל על שדה התצוגה.

הזיזו את הבמה בכיוון X/Y עד שהתשואה (ROI) נמצאת בשדה הראייה. שמור את קואורדינטות ה-X וה-Y בלשונית הבמה על ידי לחיצה על סימן פלוס. הזז את השלב שוב בכיוון X/Y עד שנמצא ROI חדש ושמור את הקואורדינטות שוב על ידי לחיצה על סימן פלוס.

המשך עד שמספר האזורים הרצוי יישמר. בדוק שוב שהתאים בפוקוס על ידי לחיצה על מיקומי X ו-Y השמורים, והתחל את המיקוד האוטומטי של החומרה על ידי לחיצה על AFC hold כדי לשמור על מיקום Z השמור קבוע במהלך הניסוי. התחל את הקלטת הטיימלפס באכשף הרכישה הרב-ממדית של תוכנת בקרת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על 'רכישה'.

בדוק שהתאים עדיין בפוקוס אחרי כמה נקודות זמן ראשונות בהקלטות הטיימלפס כדי למקסם את איכות התמונות ולמיקוד מחדש במידת הצורך.