דימות טיימלפס בתאי חיים של טורפות בקטריובורוס של Bdellovibrio על E. coli

התחילו בצלחת פטרי המכילה קו-תרבות של Bdellovibrio bacteriovorus, חיידק טורף, ו-E. coli, טרפו, מתחת לכרית אגרוז.

כרית האגרוז שומרת על E . coli מקובע, בעוד ש-B. bacteriovorus נשאר נייד ופולש באופן פעיל לתאי טרף.

הטורף מבטא סמן ציטופלזמי אדום ותג פלואורסצנטי ירוק המחובר לתת-יחידת DNA פולימראז לצורך הדמיה.

אבטח את התבנית במחזיק ומרח שמן טבילה על בסיס הצלחת ועל מטרת המיקרוסקופ לרזולוציה מיטבית.

התקן את המחזיק על המיקרוסקופ והגדר אותו לזיהוי פלואורסצנציה דו-ערוצי.

השתמשו באופטיקה של שדה בהיר כדי לאתר את מישור המוקד ולבחור מספר שדות הדמיה שאינם חופפים.

קבע פרמטרי טיים-לפס כדי ללכוד תמונות שדה בהיר ותמונות פלואורסצנציה ברצף בפרקי זמן מוגדרים.

שיטה זו מאפשרת תצפית על טורף החל מהיצמדות ופלישה של הטרף, לאחר מכן טרנספורמציית תאי טרף, גדילה סירית, הפרדה, יצירת צאצאים והסתיימה בפירוק תאי הטרף.

למיקרוסקופיה של פלורסצנציה בזמן-לפס של הקו-קולטורה, מניחים את המנה במחזיק צלחות פטרי כך שהצלחת לא תזוז במהלך הניסוי, ומניחים טיפה אחת של שמן טבילה על המטרה של המיקרוסקופ ההפוך וטיפה אחת בתחתית הצלחת. התקן את המחזיק על שלב המיקרוסקופ בתוך תא המיקרוסקופ ההפוך ובתוכנת המיקרוסקופ הגדר את ההגדלה ל-100X ואת העדשה הפוליכרומית ל-GFP ו-mCherry. באמצעות עינית ב-Brightfield, אתר את מישור המיקוד ופתח את מנהל רשימת הנקודות.

הזיזו את הבמה והשתמשו בכפתור סימון נקודות כדי לאחסן את הקואורדינטות של לפחות 10 מיקומים מעניינים. העבר את שסתום המצלמה מהעינית למסך. הגדר את מישור המוקד ולחץ על כפתור החלפת הנקודה במנהל רשימות הנקודות כדי לכייל כל נקודה.

פתח את מעצב הניסוי ופתח את תיבת הערימה של המחלות. בחר את ערוצי הפלואורסצנטיות המתאימים ואת הגדרות התאורה האופטימליות וקבע את המרווחים בין רכישת התמונה לזמן הכולל של הניסוי. הפעל תחזוקת פוקוס למיקומים שנבחרו ובחר את תיקיית הנתונים שבה קבצי התמונה אמורים להישמר אוטומטית.

בדוק מחדש את כל ההגדרות בבקרת תוכנת המיקרוסקופ והתחל את ניסוי הטיים-לאפס. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדוק שכל מיקומי הבמה עדיין בפוקוס. כאשר ניסוי הטיימ-לפס מסתיים, הסר את צלחת פטרי והשליך את צלחת ה-35 מ"מ עם כרית אגרוז בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות הביולוגית המתאימים.