אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:48 דק׳ • February 26th, 2026
התחל עם דג זברה בוגר שנדבק בזן עמיד לאנטיביוטיקה של Vibrio cholerae. חיידק פתוגני זה מבטא את אנזים β-גלקטוזידאז ומתיישב במערכת העיכול.
אספו את הדגים והעבירו לתמיסה המכילה מנת יתר של הרדמה כדי להמתים אותם.
הנח את הצד הגחוני של הדג כלפי מעלה ואבטח אותו עם סיכות.
חטא את הבטן, בצע חתך עור אורך ושני חתכים צדדיים לכיוון הראש, ואז הצמיד את העור לחשוף את מערכת העיכול.
העבר את המסלול לצינור הומוגניזציה המכיל בופר קר עם חרוזי זכוכית.
דגרו עם ערבוב, מה שמאפשר לחרוזי הזכוכית לשבש את הרקמה ולשחרר את החיידקים.
דילל סדרתי את ההומוגנט, הגש אותו על המדיום ודגם. המדיום מכיל מצע כרוגני β-גלקטוזידאז ואנטיביוטיקה להסרת מזהמים.
החיידקים מבטאים את האנזים β-גלקטוזידאז, אשר מפעיל הידרוליזה את הסובסטרט הכרומוגני ומוביל להיווצרות מושבות עם פיגמנט כחול.
ספרו את המושבות כדי להעריך את עומס החיידקים במעיים.
כאשר הניסוי מגיע לנקודת הסיום הרצויה, יש לקחת דגימה של 15 מיליליטר ממי הזיהום לצורכי אבחון. לאחר מכן לאסוף את הדגים ולהיפטר מהמים הנגועים בצורה מתאימה. כוון את הצד הגחוני כלפי מעלה ואבטח את הגוף עם סיכה דרך הלסת התחתונה וסיכה נוספת ממש מאחורי פי הטבעת.
סובב את שני הפינים הרחק מהגוף. לאחר מכן, נגב את המשטח התחתון של הדג עם 70% אתנול. לאחר מכן, סטריליזציה של סכין מנתח ומספריים של ואנאס באמצעות 70% אתנול ולהבה.
כעת, בעזרת הסקלפל, עשה חתך קטן לאורך הבטן החודר לקשקשים, אך חותך רק עד לעומק העור. לאחר מכן, עם המספריים, הארכי את החתך בזהירות לאורך הגוף, תוך חיתוך לא עמוק יותר מגובה העור. הימנע מחיתוך פי הטבעת.
לאחר מכן בצע שני חתכים צדדיים לכיוון הראש כדי להרחיב את הפתח. לאחר מכן, הצמיד את העור משני צידי החתכים הצדדיים למשטח הנתיחה, וזוית את הסיכות החוצה, הרחק מהגוף. מערכת העיכול אמורה להיות כעת נראית כצינור דק ובהיר מאוד.
כעת, השתמשו בשני זוגות מלקחיים מחוקרים בלהבה כדי להסיר בזהירות את כל מערכת העיכול שיכולה להיות עדינה מאוד. העבר את הרקמה לצינור הומוגניזציה המכיל חרוזי זכוכית ומיליליטר אחד של בופר קר. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט וכמת את רמות ההתיישבות במעיים.
לאחר מכן, יש לבצע דילול סדרתי של ההומוגנט והבופר של המעיים. לכל דג, יש להכין חמש או שש דילול של עשרה פעמים בנפח מיליליטר אחד. מערבב את הצינורות לערבוב.
לאחר מכן, פלטה של 100 עד 200 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB המכילות סטרפטומיצין ו-X-gal. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. לאחר הדגירה הלילית, ספרו את מושבות V. cholerae על הלוחות.
חיידקים אלו בדרך כלל מייצרים מושבות כחולות בהירות על מדיום LB עם X-gal.