עיבוד רקמות נגועות לספירת חיידקים במודל זיהום משותף בעכבר

התחילו בעכבר שנדבק יחד בחיידק פתוגני ובווירוס.

הווירוס פוגע ברירית האפיתל של דרכי הנשימה העליונות של העכבר, ומקל על התפשטות החיידקים מהנאזופרינקס לריאות.

הניחו את ריאות העכבר שנקטפו בצלחת המכילה מלח מפוזר בפוספט, או PBS.

טחן את הריאות לחתיכות קטנות וערבב היטב.

העבר חצי מרקמת הריאה לצינור המכיל PBS.

הניחו גלאי הומוגנייזר לרקמות מעוקרות בתוך הצינור המכיל את רקמת הריאה.

הומוגניזציה של הרקמה כדי לשחרר את החיידקים ל-PBS.

מדלל את ההומוגנט וצלח את הדילול על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים.

דגרו את הפלטה כדי לאפשר יצירת מושבות חיידקים.

ספרו את המושבות הללו כדי לכמת את העומס החיידקי בריאות, שמחזיר את עומס החיידקים בריאות.

לאיסוף ריאות, באמצעות מספריים חתוכים, חתכו את צידי כלוב הצלעות החשוף ומשכו בעדינות את הצלעות כלפי מעלה לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 25 גייג' המחוברת למזרק 10 מיליליטר מלא מראש ב-PBS אל החדר הימני והתחל להפרפוזציה לאט. חפשו הלבנה של הריאות כאינדיקציה להצלחת הפרפוזיה.

שטוף לאט כדי למנוע שבירת רקמת הריאות. הרימו את הלב עם מלקחיים ובצעו חתך כדי להפריד בין הריאות ללב. לאחר ההפרדה, הרימו את כל אונות הריאה עם מלקחיים ושוטפים בקערת עם PBS סטרילי כדי להסיר שאריות דם.

בצלחת פטרי, טחנו את הריאה לחתיכות קטנות וערבבו היטב. הסר חצי מתערובת הריאות כדי לקבוע את ה-CFU החיידקי או ה-PFU הוויראלי והניח אותו בצינור עגול בתחתית של 15 מיליטר, מלא מראש ב-0.5 מיליליטר PBS להומוגניזציה.

כדי להומוגן את הרקמה שנאספה, נקה את גלאי ההומוגנייזר על ידי הכנסתו ל-70% אתנול והדלקת ההומוגנייזר בעוצמה של 60% למשך 30 שניות. חזור על השלב הזה במים סטריליים למשך 10 שניות.

הומוגניזציה של כל רקמה למשך דקה. לצורך ספירת מספרי חיידקים, דילול סדרתי של לוחות על לוחות אגר דם. כדי לחשב את סך ה-CFU השתמש ב-10 מיקרוליטרים לציפוי ורשום את הנפח הסופי במיליליטרים עבור כל דגימה. דגרו אותו בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.