אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:47 דק׳ • February 26th, 2026
התחילו בשתי מיקרוספינות עם תחתית זכוכית המכילות תלויות של חיידק יוצר ביופילם.
צלחת הטיפול מכילה אנזים פעיל שמפריע לאותות, בעוד שמערכת הבקרה כוללת את האנזים המושבת.
כסו את הכלים ודגרו כדי לאפשר הידבקות חיידקית לפני השטח.
שטוף כדי להסיר תאים לא דביקים לזה, ואז הכנס מדיום טרי המכיל את האנזימים ודגם.
בצלחת הבקרה, החיידקים מתקשרים דרך מולקולות איתות ומייצרים חומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS), היוצרים ביופילם.
האנזים הפעיל מפרק את מולקולות האיתות, משבש את תפקודן ומפחית את יצירת הביופילם.
מלא מחדש במדיום טרי ודגר עוד כדי לחזק את השפעות הביופילם של האנזים.
הסירו את המדיום, הוסיפו לקטין עם תוויות פלואורסצנטיות, ודגרו כדי לאפשר קישור ללקטין ל-EPS.
שטוף כדי להסיר כל לקטין לא קשור.
דגרו עם קיבוע לשימור ארכיטקטורת הביופילם, ואז שטפו את התערונית.
לרכוש תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות להערכת דיכוי היווצרות ביופילם בתיווך אנזימים.
לביצוע מיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי, או CLSM, של ביופילמים של A. baumannii S1, יש לגדל תרבית של 5 מיליליטר של A. baumannii S1 ב-LB בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במדמרה רועדת למשך 16 שעות. כוון את התרבות של A. baumannii S1 ל-OD600 של 0.8.
לאחר מכן השתמשו ב-LB טרי המכיל 1.2 מיליגרם למיליליטר של אנזים GKL מטוהר לדילול התרבית, 1 עד 100, והוסיפו 1 מיליליטר למיקרודיש זכוכית עם תחתית זכוכית בנפח 35 מיליטר. כסו את המיקרודה במכסה, הניחו אותה במיכל פלסטיק בנפח 10 ליטר ואטומו אותו לפני שמכניסים את המנה ל-30 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הסרה עדינה של המדיום, הוסיפו 1 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 30 מיקרוליטר של אנזים GKL מטוהרת, ואז דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לעוד 21 שעות.
הסר בעדינות את המדיום בפעם השנייה והחלף אותו בעוד 1 מיליליטר של אנזים GKL במדיום טרי. דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר בעדינות את המדיום והוסיף 500 מיקרוליטר של 5 מיקרוגרם למיליליטר של אלקסה פלואור 488 אגלוטינין מחיטה מצומדת מומס ב-HBSS.
דגרו את המיקרו-צלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לצבוע את הביופילמים. כדי לתקן את הביופילמים, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 3.7% פורמלדהיד מומס ב-HBSS ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השתמש ב-2 מיליליטר של HBSS כדי לשטוף את המיקרודיש פעם אחת, ואז הסר את התמיסה לגמרי.
שמרו את המנה בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני התמונה של CLSM. להדמיה וניתוח CLSM, השתמשו באובייקטיב של 63X ליצירת 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרון למחסן.