בידוד חיידקים פתוגניים תוך-תאיים מתאי מארח נגועים

קחו השעיה של חיידקים פתוגניים.

הוסף את התסריט לתרבות דביקה של מקרופאגים שמקורם במח עצם או תאי BMDM ודגם.

החיידקים משתמשים בחלבוני פני השטח שלהם כדי להיקשר לקולטני התאים המארחים, מה שמקל על ההיצמדות.

שטוף עם בופר כדי להסיר חיידקים שלא נדבקו.

הוסף מדיה טרייה ודגם.

החיידקים שנדבקו מופנים על ידי תא המארח.

הוסיפו אנטיביוטיקה כדי להרוג חיידקים לא מופנמים.

זרוק את המדיה ושטוף עם בופר.

הוסיפו מים מקוררים כדי לעבור את תא המארח, מה שמשחרר את תכולת התאים, הגרעין והחיידקים הפנימיים.

אסוף את הליזאט והצנטריפוגה של התא כדי להשקיע פסולת תאית.

אסוף את הסופרנטנט שמכיל את החיידקים. העבר אותו דרך מכשיר סינון כדי ללכוד חיידקים שלמים.

קפל את נייר הסינון והנח אותו בתוך צינור.

הקפאה מהירה בחנקן נוזלי כדי לשמור על שלמות התא.

אחסן בתנאים קרים לשימוש נוסף.

באמצעות 0.5 מיליליטר של תליון חיידקי שטוף, הדביקו כל לוח מקרופאג'. אם משתמשים במספר צלחות, מרחק את ההדבקות בהפרש של 15 דקות כדי לאפשר לקצור כל צלחת בנפרד בסיום ההדבקה. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, השתמשו ב-PBS לשטיפת התאים הנגועים פעמיים כדי להסיר חיידקים לא מחוברים, ואז הוסיפו 30 מיליליטר של מדיום BMDM מחומם מראש.

דגרו במשך 30 דקות כדי לאפשר לחיידקים להיטמע. בשעה לאחר ההדבקה, מוסיפים גנטמצין לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים שנותרו. הרכיבו את מכשיר המסנן על ידי הצבת ראש מסנן על בקבוק איסוף נוזלים עם יציאת ואקום.

לאחר מכן מניחים פילטר של 0.45 מיקרון על ראש המסנן, אחריו משפך צילינדר, והשתמשו במהדק מתכתי כדי לאבטח את החלקים השונים. שש שעות לאחר ההדבקה, בדקו את שכבת התא תחת המיקרוסקופ לפני הקציר. עובדים עם צלחת אחת בכל פעם כדי לקצור את החיידקים, השתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים הנגועים.

לאחר מכן, כדי לפרק את תאי המקרופאג', הוסיפו 20 מיליליטר מים קרים ללא RNAse, והשתמשו במהירות אך בזהירות במגרד תאים כדי לגרד את התאים מהלוח. לאחר איסוף התאים לצינור חרוטי בנפח 50 מיליליטר, מערבולות למשך 30 שניות, ואז צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 פעמים g ו-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי להסיר את גרעיני תאי המקרופאג'. כדי לאסוף חיידקים, העבירו את הסופרנטנט דרך המסנן באמצעות מערכת הוואקום.

לאחר מכן, עם פינצטה, גלגלו את המסנן והעבירו במהירות לצינור חרוטי בנפח 15 מיליליטר. השתמש מיד בחנקן נוזלי כדי להקפיא את הצינור.