חילוץ RNA מליסטריה מונוציטוגנס שנקטף ממאקרופאג'ים של עכברים נגועים

קח שפופרת עם נייר סינון המכיל ליסטריה מונוציטוגנס. חיידקים אלו נאספים ממאקרופאגים נגועים של עכברים.

הוסף בופר המכיל מעכבי RNase כדי למנוע התדרדרות RNA, ואז לסחרר את הצינור בזוויות שונות כדי להוציא את החיידקים.

צנטריפוגה והעברת המתלים לצינור המכיל תערובת פנול–כלורופורם–חומר ניקוי.

מערבולת ודגירה בטמפרטורה גבוהה כדי לשבש את ממברנות החיידקים, לנטרל חלבונים ולפרז את החיידקים, תוך שחרור רכיבים תוך-תאיים.

צנטריפוגה להפרדת השלב המימי העשיר ב-RNA מהרכיבים האחרים.

אסוף את ה-RNA והעבר אותו לצינור המכיל נתרן אצטט ואתנול.

מערבולת, ואז דוגר בטמפרטורה נמוכה.

אצטט נתרן מנטרל את המטען השלילי של ה-RNA, בעוד שתנאי אתנול וקור מקדמים שקיעת RNA.

צנטריפוגה לפלט את ה-RNA.

הסר את הסופרנטנט ושטוף את הכדור באתנול קר.

שוב צנטריפוגה, הסר את הסופרנאנט, ייבש באוויר, ומוסיפים מים ללא RNase.

אחסן את ה-RNA לניתוח נוסף.

הפשיר את הצינורות שמכילים את המסננים על קרח כדי לשמור עליהם קרים. ואז לכל צינור מוסיפים 650 מיקרוליטר של אצטט קר EDTA או בופר AE.

בעבודה מהירה ככל האפשר, מערבולת בעוצמה בצינור המסנן כך שהמסנן יגיע לשולי הצינור והבופר ישטוף את המסנן במלואו. ייתכן שיהיה צורך להפוך את הצינור והמערבולת כדי לשטוף לחלוטין את החיידקים מהפילטר. השלב הקריטי ביותר בתהליך הוא להבטיח שהחיידקים מוסרים ביעילות מהמסנן.

לשם כך, אנו חוזרים על מער